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血清中乙肝病毒全长cccDNA的检测及其临床意义
共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)是乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)的复制中间体.HBV复制活跃时,cccDNA可从损伤的肝细胞释放入血.因此,血清中出现cccDNA是肝细胞受损的早期标志~([1]).本研究用长链PCR方法从血清中扩增HBV cccDNA全序列,结合血清中HBV PreS1抗原、HBV标志物和丙氨酸转氨酶(ALT)的检测结果,分析血清中cccDNA检出率与HBV PreS1抗原表达及肝细胞损伤的相关性.
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肝病患者血清cccDNA与HBV复制及肝组织损伤的关系
细胞外乙型肝炎病毒(HBV)DNA是一种松弛环状的部分双链DNA分子,而在感染的肝细胞核内则是另一种不同形式的病毒DNA,即共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)[1~3].近来研究发现血清中存在cccDNA[3];另有研究证实外周血淋巴细胞同样存在HBVDNA与cccDNA[1].因此血清cccDNA的来源可能不只是肝组织,其临床意义尚不十分清楚.我们检测了228例肝病患者血清cccDNA.现将有关资料报告于下.
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鸭乙型肝炎病毒cccDNA Taq Man荧光定量PCR的建立
目的 建立鸭乙型肝炎病毒(DHBV)cccDNA TaqMan荧光定量PCR方法.方法 用pUCm-T载体和PCR纯化产物连接,转染TOP10菌,筛选阳性菌落,提取质粒,制作外标准品;在DHBV基因组负链两侧设计一对引物,并在引物问设计和荧光标记一段TaqMan探针,严格优化反应物的组成和扩增条件,建立了DHBV cccDNA TaqMan荧光定量PCR方法.结果 低可检出104拷贝/ml;批内误差为0.2%~3.14%,批问误差为2.22%~4.43%;在105~102拷贝/ml之间与Ct值具有很好的线性[Ct=-2.8361ln(χ)+41.45,r=-0.9985].结论 该法是一种灵敏度高、特异性强、较为简便的DHBV cccDNA定量检测技术.
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监测乙肝病毒感染者血清共价闭合环状DNA 的临床意义
乙肝病毒(hepatitis virus B,HBV)持续感染相关疾病包括乙肝病毒抗原携带者(ASC)、慢性HBV携带者(HBV-C)、慢性肝炎(CHB)、肝硬化(HBV-LC)和肝细胞癌(HBV-HCC)[1] .
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慢性乙型肝炎治疗中的困惑
全球有近3.5亿HBV携带者,其中每年有约50万~100万例死于HBV相关性感染.慢性乙型肝炎的治疗目标是阻断炎症进展、预防肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌,达到这一目标须在出现不可逆的肝损害之前就能彻底清除HBV.可是,由于肝外HBV的存在、HBV DNA可能与宿主基因组整合以及共价闭合环状DNA(cccDNA)的存在,因此治疗停止后常伴随病毒复制而病情迅速反弹[1].
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肝细胞因子3和乙型肝炎的调节关系
0 引言乙肝病毒(HBV)是很小的包膜病毒,基因组结构精密,仅约3 200个碱基(bp),但能以小容量发挥高效功能.HBV DNA复制周期开始于共价闭合环状DNA(cccDNA),先转录为前基因组RNA,然后反转录为负链DNA,再合成正链DNA,双链DNA又成熟为cccDNA,是一个连续的过程.分散在整个HBV基因组中有多个调节元件,与细胞或病毒产生的调节因子结合,增强或抑制不同基因的表达[1-3].肝细胞因子3(HNF3)是重要的转录调节因子,对于调节前基因组RNA和前核心RNA等的转录复制有重要的作用.
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慢性乙型肝炎长期抗病毒治疗的耐药管理
慢性HBV感染目前仍然是全球重要的健康问题,全世界范围内HBV仍有很高的感染率,并且近年出现了抗病毒耐药突变.目前美国药品和食品管理局(FDA)批准的抗病毒药物如拉米夫定(LAM)、阿德福韦(ADV)和恩替卡韦(ETV)可抑制HBV复制.然而,HBV共价闭合环状DNA存在于感染细胞核中,需要延长治疗时间而达到防止停药后病毒复制反弹.伴随延长治疗时间出现的问题就是治疗中的选择性抗病毒药物耐药突变发生.随着核苷类抗病毒药物的应用,抗病毒药物耐药突变已经成为目前临床医师进行慢性乙型肝炎(CHB)治疗面临的主要问题,以下就目前关于CHB长期抗病毒治疗耐药管理相关问题做一简要回顾总结.
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乙型肝炎抗病毒治疗靶点的研究新进展
慢性乙型肝炎是一种难治性疾病,病毒持续复制和机体免疫清除障碍是其发病的两个基本要素,因此,抗病毒治疗是慢性乙型肝炎治疗的关键.有效的抗病毒治疗可以促进疾病缓解,阻止肝硬化进程,防止出现肝衰竭和(或)肝细胞痛的严重后果.目前抗HBV治疗的效果尚不令人满意,临床使用的抗病毒治疗措施难以根治慢性HBV感染,消除.HBV的共价闭合环状DNA(cccDNA)需要更有效的抗病毒治疗.
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HBV ccc DNA的检测方法及研究进展
共价闭合环状 DNA(covalently closed circular DNA,ccc DNA)作为乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)的转录模板,是一种独特的复制中间体,长期聚集于宿主细胞核内,在HBV生命周期及持续感染中起着关键作用。由于目前常用的抗病毒药物均不能清除ccc DNA,其监测对于评价抗病毒治疗疗效、判断停药时间、预测治疗后再发等方面具有着重要作用。随着分子生物学技术的发展,HBV ccc DNA的检测方法得到不断的建立和完善,其临床应用价值也逐渐得到探究。本文就近年来研究报道的ccc DNA检测方法及临床意义等作一综述。
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慢性乙型肝炎的治疗现状
对慢性乙型肝炎病毒(HBV)的分子生物学及致病机理的深入研究表明,共价闭合环状DNA(cccDNA)在慢性HBV感染的持续过程中起关键作用,而慢性感染是病毒、肝细胞和机体免疫系统之间处于相互作用的动态过程.相应地,慢性HBV感染的自然病程可分为3个连续阶段:免疫耐受期、免疫清除期和残余期.
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乙肝病毒共价闭合环状DNA检测可作为评价抗病毒治疗的新指标
第二军医大学附属长征医院的缪晓辉教授在2005年5月召开的中华医学会第十二次全国病毒性肝炎及肝病学术会议上指出,共价闭合环状DNA(cccDNA)是乙肝病毒前基因组RNA复制的原始模板,虽然其含量较少,每个肝细胞内只有约5~50个拷贝,但对乙肝病毒的复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义,只有清除了细胞核内的cccDNA,才能彻底消除乙肝患者病毒携带状态,是抗病毒治疗的目标.检测乙肝病毒cccDNA的临床意义包括以下3点.
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慢乙肝患者HBsAg定量与HBV DNA和HBV cccDNA含量的相关性分析
血清中的乙肝病毒脱氧核糖核酸( HBV DNA)是乙肝病毒(HBV)感染直接的证据,检测其阳性提示HBV复制和有传染性;而肝细胞核内的HBV共价闭合环状DNA( HBV cccDNA)则是HBV前基因组RNA复制的原始模板,只有清除了肝细胞核内的HBV cccDNA,才能彻底消除乙肝患者病毒携带状态.然而血清HBV DNA和肝组织HBV cccDNA检测价格昂贵、操作繁琐,不适宜普遍开展;近年来有研究表明,血清HBsAg定量与血清HBV DNA和肝组织HBVcccDNA含量有一定的相关性,可用于临床诊断与治疗检测[1,2].本文就其相关性进行初步研究,旨在将血清HBsAg含量指标应用于HBV复制状态和临床治疗效果的评价中.
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乙肝病毒cccDNA的研究进展
乙型肝炎病毒基因组为双链松弛环状DNA(rcDNA).HBV感染发生后,HBVDNA进入细胞,rcDNA转化为共价闭合环状DNA(cccDNA),并以cccDNA为模板开始一系列的病毒复制过程.HBV复制是一种保守的机制,在转录后模板cccDNA仍然完整,并且可反复转录,所以cccDNA是嗜肝病毒持续感染的关键因素,是HBV复制的突出标志,也是评价HBV感染状态及药物疗效重要的指标.
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应用巢式-实时定量PCR方法检测慢性乙型肝炎患者PBMC中HBV cccDNA
乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA( HBV cccDNA)是HBV复制的原始模板,是HBV持续感染的关键因素.外周血单核细胞(PBMC)中HBV cccDNA的存在状态及动态变化成为研究HBV肝外分布及复制问题的热点.诸多研究证实,PBMC中存在HBV DNA,但是否存在HBV复制模板HBVcccDNA及复制过程,却有不同意见.国内外学者进行大量探索,建立了许多方法用于检测乙型肝炎患者PBMC等标本中HBV cccDNA,但因方法的特异性和敏感性不够高,重复性欠佳,迄今尚无可靠的检测方法和商品化试剂[1-3].本实验建立巢式-实时荧光定量PCR方法,用于检测慢性乙型肝炎患者PBMC中HBV cccDNA,并初步分析PBMC中HBV cccDNA的存在状态及临床意义,探索研究HBV复制状态、指导临床诊断和治疗的新方法.
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HBV cccDNA临床意义研究新进展
乙型病毒性肝炎呈世界性流行.据推算,我国现有HBV感染者约9 300万,其中慢性乙型肝炎患者约2 000万[1].虽然近年来乙型肝炎抗病毒治疗取得了一定的进展,但治疗疗程、耐药及停药后复发等一系列问题仍是目前困扰临床的难题.其原因之一是HBV特殊的反转录复制形式以及特殊的复制模板HBV共价闭合环状DNA (covalently closed circular,HBVcccDNA)的持续存在和难以清除[2-3].HBVcccDNA在慢性乙肝发展的各个阶段都具有重要意义,本文就其临床意义的研究进展综述如下
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替诺福韦与恩替卡韦联合治疗慢性乙型肝炎出现病毒学突破
乙型肝炎病毒(HBV)感染是导致病毒携带、慢性肝炎进展和相关性肝癌发生发展的常见疾病,大多数国家已批准干扰素及核苷/核苷酸类似物(NA)抗病毒药物(如:拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦和替诺福韦等)用于治疗慢性肝炎。由于NA 抗病毒药物主要是阻止 HBV 聚合酶的逆转录过程,而不能直接干扰共价闭合环状 DNA(cccDNA)的形成,因此患者需要长期服药治疗,此过程中常伴随 HBV 聚合酶耐药突变的出现和选择[1]。
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乙型肝炎HBeAg与HBV DNA定量关系的探讨
目前HBV DNA和HBeAg的存在及其水平是反映HBV感染及传染性强弱的直接可靠的指标,是临床上指导慢性乙型肝炎的诊断、治疗及预测疗效的重要依据.随着分子生物学技术,荧光免疫技术的发展,HBV脱氧核糖核酸及其血清标志物检测已由过去的定性检测发展到现在的定量检测.近年来关于HBeAg与HBV DNA定量关系的研究越来越多,在此,我们就HBeAg与HBV DNA的定量关系进行分析与探讨.一、HBV DNA与HBeAg的形成过程HBV DNA的复制分成两个阶段:第一阶段,在肝细胞核内,部分双链环状HBV DNA(rcDNA)进入肝细胞核后,在宿主酶的作用下,以负链DNA为模板延长正链,形成共价闭合环状DNA(cccDNA),然后以cccDNA为模板,在宿主RNA聚合酶Ⅱ的作用下,转录成几种不同长短的mRNA,其中3.5 kb的mRNA含有HBV DNA序列上全部遗传信息,称为前基因组RNA(pgRNA);第二阶段,在肝细胞质中,pgRNA被转运至肝细胞质,pgRNA和DNA聚合酶一起被核壳蛋白(HBcAg)包裹形成病毒核心,在核心颗粒内,pgRNA作为模板,在DNA聚合酶介导下,合成负链DNA;再以负链DNA为模板,合成正链DNA,形成子代的rcDNA,胞质中的子代rcDNA也可进入肝细胞核内,再形成cccDNA,维持cceDNA池并继续复制.另外一部分mRNA转译病毒蛋白:HBcAg、HBeAg、HBsAg、P蛋白、X蛋白[1].
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乙型肝炎病毒感染患者血清cccDNA检测及其临床应用
在感染乙型肝炎病毒(HBV)的肝细胞核内可检测到一种不同形式的病毒共价闭合环状DNA(cccDNA),不与蛋白共价结合.cccDNA是嗜肝DNA病毒科病毒基因组的复制中间体,是嗜肝DNA病毒mRNA和前基因组RNA的合成模板,是嗜肝病毒持续感染的关键因素[1-2].目前普遍使用的慢性乙型肝炎抗病毒治疗能很好的抑制HBV复制,控制病情,但是一旦停药后HBV很容易再次复制,其原因就在于肝细胞中HBVcccDNA的持续存在,因此,清除HBVcccDNA是真正治愈乙肝的关键,HBV cccDNA的相关研究是医学界的重点和热点之一.HBV cccDNA主要位于感染的肝细胞核中,一般使用肝脏组织来检测.但是肝组织样本采集困难,限制了其使用.近年,有研究检测血清中HBVcccDNA载量,并探讨其在临床中的运用.
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慢性乙型肝炎抗病毒耐药及其处理
乙型肝炎病毒(HBV)是一种DNA病毒,它通过逆转录在肝细胞中进行复制.HBV感染肝细胞后,附着在肝细胞上,然后穿透肝细胞,进入细胞核,形成共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA),宿主RNA聚合酶Ⅱ以cccDNA为模板,转录出长短不一的mRNA,进入细胞质.
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核苷和核苷酸类药物治疗慢性乙型肝炎的长期性
近20年来,临床和流行病学研究表明,持续、活跃的乙型肝炎病毒(HBV )复制是慢性乙型肝炎(CHB)疾病进展的重要因素,只有长期抑制 HBV复制,才有可能防止疾病进展。但 HBV 在复制过程中,在肝细胞核内形成共价闭合环状DNA (cccDNA)并可持续存在[1]。核苷(酸)类药物(NAs )主要抑制HBV复制的逆转录环节,对 cccDNA 无直接抑制或清除作用。此外,CHB患者存在特异性免疫功能障碍[2-5],而NAs无直接的免疫调节作用[5]。因此,现有NAs抗病毒治疗很难彻底清除 HBV,仅部分 HBV e抗原(HBeAg)阳性并伴有明显丙氨酸氨基转移酶(ALT)升高的患者可实现 HBeAg 血清学转换,甚至HBV 表面抗原(HBsAg)消失或 HBsAg 血清学转换,而大部分CHB患者,尤其是HBeAg阴性CHB和肝硬化患者,需要长期抗病毒治疗[6]。因此,目前国内外CHB管理指南或共识均将治疗目标确定为:大限度地长期抑制 HBV 复制,减轻肝细胞炎症坏死和纤维化,延缓和减少肝脏失代偿、肝硬化、肝细胞癌(HCC)及其并发症的发生,从而改善生活质量和延长存活时间[7-10]。为帮助临床医生正确认识 NAs 治疗的长期性,合理选择抗病毒药物,系统监测其疗效和不良事件并长期随访其临床转归,国内部分肝脏病学和感染病学专家根据国内外新研究证据,经过认真讨论和反复修改,终形成本文。