慢病毒载体与基因治疗

载体是供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或复制的运载工具.常用的有SV40衍生载体、逆转录病毒载体、腺病霉载体、腺病毒相关病毒载体、细小病毒载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体等.近几年来,慢病毒载体受到高度重视,慢病霉载体来源于人类免疫缺陷病霉HIV-1、HIV-2、SIV,具有转染分裂和非分裂的T细胞、树枝状细胞、造血干细胞及巨噬细胞[1],基因疗法是一种新方法.Hawley[2]等的文章中指出,由于慢病毒载体可作用于细胞周期的G0/G1期,成为遗传性疾病治疗的有效手段.基因治疗的初目的是传送特殊的基因至预定的靶细胞,并且直接表达该基因的性质,达到治疗效果.在治疗遗传性、代谢性、神经系统疾病、癌症及艾滋病方面有广泛的应用前景[3].

让致病基因"安静"下来

癌症、肥胖症及心脏病等人类大的杀手也许很快就可以用一种革命性的基因疗法来进行治疗,让造成这些疾病的基因"安静"下来.

超声微泡造影剂促进GFP质粒转染喉癌细胞的效果

目的:观察超声微泡造影剂促进GFP质粒转染喉癌细胞的可行性及有效性.方法:将喉癌细胞随机分成4组,分别为A组:空白对照组(PBS);B组:GFP+微泡组;C组:GFP+超声组;D组:GFP+超声+微泡组,转染48h后,采用Western blot和RT-PCR检测喉癌细胞中GFP蛋白和mRNA的表达.结果:通过超声照射微泡造影剂促进GFP质粒转染喉癌细胞,D组中GFP蛋白和mRNA的表达量明显高于其他3组(P＜0.05),这说明D组的转染效率明显高于其余3组.结论:微泡在一定频率和强度的超声作用下能够安全、有效地将GFP质粒转染喉癌细胞.

应用血管内皮生长因子基因治疗股骨头缺血性坏死的实验研究

目的:通过建立犬股骨头缺血坏死模型,探讨应用脱蛋白骨复合转染血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因骨髓基质细胞植入治疗股骨头缺血坏死的可行性.方法:实验选取36只成年犬,随机分为3组,每组12只.A组为脱蛋白异体骨复合转染VEGF基因的自体骨髓基质细胞;B组为脱蛋白异体骨复合未转染基因的自体骨髓基质细胞;C组单纯植入脱蛋白骨材料.采用液氮冷冻法制作狗股骨头缺血坏死模型,将细胞骨材料复合物植入缺血坏死股骨头内.应用微循环灌注方法了解股骨头内的血运情况,组织形态学观察坏死股骨头的修复情况,免疫组化方法检测VEGF的表达,骨密度仪测定股骨头的骨密度.结果:A组4周后股骨头内有VEGF表达,12周后股骨头内有大量的树枝状血管生成,大量新骨形成,骨密度增高;B、C组均无VEGF基因表达,B组有部分新骨及血管生成,C组仅见少量类骨质形成,血管再生不明显.结论:利用脱蛋白骨复合转染VEGF基因的骨髓基质细胞可促进新骨形成与血管再生,有利于促进坏死骨的修复.

基因修饰的组织工程骨修复节段性骨缺损及相关免疫学研究

目的:观察骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因修饰的组织工程骨修复节段性骨缺损效果及异种骨支架体内应用的安全性.方法:①制备去抗原牛松质骨块(BCB),植入小鼠股四头肌袋内,术后行淋巴细胞转化试验和组织学观察.②在腺病毒载体介导下将BMP-2基因导入兔骨髓间质干细胞后,种植到BCB支架中,构建基因修饰的组织工程骨.于兔双侧桡骨中段造成15 mm骨缺损,采用5种方法进行处理:BMP-2基因转染细胞+BCB(A组);未转染细胞+重组BMP-2+BCB(B组);对照基因转染细胞+BCB(C组);未转染细胞+BCB(D组);单纯BCB(E组).术后4、8、12周行X线、组织学和生物力学检测.结果:①BCB具有较低的抗原性和良好的组织相容性;②A组术后4周诱导生成软骨组织并向编织骨转化,12周骨缺损修复,髓腔再通,新骨强度明显优于其他各组(P＜0.01).结论:BMP-2基因修饰的组织工程骨是修复节段性骨缺损的好方法.

基因疗法在骨科运用的可能性

基因疗法是指将外源性基因转移到个体以达到治疗疾病的目的.早期设想是将基因疗法作为一种补偿机制治疗遗传性疾病.近年来,采用基因转移方法将基因疗法作为一种药物转移系统(drug-delivery system)可治疗获得性疾病[1].

卵巢功能早衰致不孕症的治疗现状及进展新研究

女性在40岁之前发生闭经情况代表卵巢功能早衰,该病症的主要特征是高卵泡刺激素及低雌激素水平,卵巢功能早衰会影响女性生育能力,并对内分泌功能造成不利影响.相关的数据调查显示,近年来卵巢功能早衰的发生率逐年上升,其中,以激素替代治疗作为主要的临床应用治疗方式,该种治疗方式能大大改善患者的主要临床症状.卵巢功能早衰致不孕症的临床治疗方式还处于探索阶段,主要的研究治疗方式有:促排卵、供卵、基因治疗、干细胞治疗等,其中基因治疗与干细胞治疗在动物实验中取得了一定的成效,为卵巢功能早衰致不孕症患者提供了恢复生育能力的可能.体外激活是治疗卵巢功能早衰致不孕症的新方式,有一定的成功案例.现将卵巢功能早衰致不孕症的治疗现状及进展新研究以综述形式表述如下.

表达人Fas配体的质粒用于治疗小鼠甲状腺相关眼病

目的 探求表达人Fas配体(hFasL)的质粒在甲状腺相关眼病(TAO)小鼠模型中的治疗作用.方法 小鼠分为3组.对照组(10只)用空质粒pcDNA3.1(+)活化的脾细胞免疫后,以空质粒治疗;模型组和治疗组(各19只)均以人TSH受体(hTSHR)活化的脾细胞进行免疫,前者不予治疗,后者行眼球后注射表达hFasL的质粒pcDNA3.1(+)/hFasL.结果 模型组52.6%的眼眶组织出现了肌纤维变性及溶解断裂、脂肪组织增生、水肿等TAO样改变,与对照组相比,TT4升高、TSH降低(P<0.05).治疗组仅15.8%有类似TAO改变,电镜下见有凋亡细胞,TT4、TSH同复至对照组水平.TRAb在3组间均无差异.结论 眼球后注射表达hFasL的质粒治疗TAO小鼠取得了一定效果.

骨形态发生蛋白-2局部基因治疗骨缺损的研究进展

骨形态发生蛋白-2(BMP-2)局部基因疗法能使骨缺损区持续产生内源性BMP-2,从而促进骨缺损愈合,为治疗大段骨缺损开拓了一个新的领域,应用前景令人鼓舞.

1型糖尿病治疗方法的回顾与展望

1型糖尿病是由包括病毒感染、药物接触及自身免疫在内的各种原因导致的胰岛β细胞凋亡所引起的,主要表现为由血清中胰岛素的绝对缺乏引起的高血糖.在过去数十年中,外源补充胰岛素一直是1型糖尿病的主要治疗方法.随着人们对1型糖尿病机制的深入了解及生命科学相关技术的发展,科研工作者及临床医生开始探索治疗1型糖尿病的新方法,其中包括将分泌胰岛素的外源胰岛或干细胞移植入体内.或将胰岛素基因直接导入体内,合成并分泌体内缺乏的胰岛素等.本文对胰岛移植、干细胞和基因疗法用于治疗1型糖尿病的主要方式做一简要回顾与综述,并重点讨论近年来的研究进展及其临床应用的可行性.

阿霉素诱导Egr-1启动子调控的造血因子GM-CSF基因表达对荷瘤小鼠造血功能恢复的影响

本研究探讨阿霉素(ADM)诱导早期生长因子(Egr-1)启动子调控的造血因子基因表达对荷瘤小鼠化疗后造血功能恢复的作用.将构建的携带有Egr-1启动子的粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)cDNA和增强型绿色荧光蛋白(FGFP)cDNA双顺反子真核表达载体导入基质细胞HFCL后,输入重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠体内.实验小鼠随机分4组:①ADM诱导的HFCL/EG组(HFCL/EG+ADM组),②ADM诱导的HFCL组(HFCL+ADM组),③单纯输注HFCL/EG组(HFCL/EG组)和④单纯输注HFCL组(HFCL组),每组6只动物.观察外周血象动态改变,用流式细胞术检测eGFP+人基质细胞,用RT-PCR和Western blot分别检测GM-CSF mRNA及其蛋白的表达.结果表明:化疗组与未化疗组相比外周血白细胞降低,而且下降幅度较低,恢复加快;各组间CFU-GM数无显著性差异;肿瘤抑制率与化疗相关,而与外源基因表达不相关;ADM处理后实验组小鼠骨髓可见绿色荧光阳性的基质细胞;RT-PCR和Western blot显示GM-CSF mRNA和GM-CSF蛋白表达增强.结论:ADM诱导的Egr-1启动子造血因子基因疗法具有化疗后促进造血恢复作用.

烷基化低分子量聚乙烯亚胺作为基因递送载体的初步研究

目的考察烷基化低分子量聚乙烯亚胺作为基因递送载体的安全性和有效性。
　　方法以1-溴十二烷和分子量为1800的分枝状 PEI （bPEI1.8K）为原料，合成 bPEI1.8K-C12，并用1H-NMR 对其结构进行确认；采用 MTT 法考察 bPEI1.8K-C12的细胞毒性；红细胞溶血实验考察 bPEI1.8K-C12的生物相容性；测定bPEI1.8K-C12/DNA 复合颗粒的粒径分布和 zeta 电位；采用激光共聚焦显微镜观察 bPEI1.8K-C12/DNA 复合颗粒的细胞摄取行为；采用琼脂糖凝胶阻滞电泳考察 bPEI1.8K-C12对DNA 的固缩能力；并用荧光素酶报告基因和绿色荧光蛋白报告基因考察 bPEI1.8K-C12的体外转染效率。
　　结果经1H-NMR 确认，成功合成了 bPEI1.8K-C12；MTT结果表明 bPEI1.8K-C12对人乳腺癌 MCF-7细胞的毒性与bPEI1.8K 相当；红细胞溶血实验结果表明高浓度 bPEI1.8K-C12静脉注射时具有潜在溶血性；质量比相同时，bPEI1.8K-C12/DNA 复合颗粒的平均粒径和 zeta 电位均比相应的bPEI1.8K/DNA 大；烷基化修饰后，bPEI1.8K-C12对 DNA 的固缩能力降低，MCF-7细胞对 bPEI1.8K-C12/DNA 复合颗粒的摄取效率大大增加，bPEI1.8K-C12递送报告基因质粒的体外转染效率显著高于 bPEI1.8K，甚至与 lipofectamine2000相当。
　　结论 bPEI1.8K-C12是一种安全高效的基因递送载体，具有较高的进一步开发前景。

使用热休克蛋白基因启动子调控靶基因在肿瘤局部表达

目的利用人热休克蛋白基因启动子结合加热选择性诱导目的基因在肿瘤局部表达,建立肿瘤基因治疗新方法.方法分离不同大小的人热休克蛋白70基因5'端调控顺序作为启动子,以绿色荧光蛋白(GFP)作报告基因,构建热诱导型GFP表达质粒.转染体外培养的肿瘤细胞,或将稳定转导GFP表达质粒的肿瘤细胞移植到大鼠皮窗内,或将热诱导型GFP腺病毒注射到肿瘤内,加热后直接利用荧光显微镜观察GFP表达水平.结果 400 bp人热休克蛋白70基因5'端调控顺序背景表达水平低,加热后可被显著激活,能作为启动子有效驱动下游目的基因的表达.GFP作报告基因使体内外肿瘤细胞内目的基因的表达水平仅通过荧光显微镜便能直接观察到.结论利用热诱导型启动子结合加热能选择性诱导目的基因在肿瘤局部表达,为肿瘤基因治疗提供了一种新方法.

重组腺病毒介导的BCL-Xl基因过表达治疗急性肝衰竭大鼠的研究

目的 明确肝细胞凋亡与急性大鼠肝衰竭模型肝组织损伤程度的关系;明确BCL-Xl过表达对急性肝衰竭大鼠肝脏的治疗保护作用.方法 将60只Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型组、处理组三组.正常对照组及模型组给予门静脉注射生理盐水,处理组予门静脉注射重组BCL-Xl腺病毒.预处理7 d后模型组及处理组予D-氨基半乳糖+脂多糖建立肝衰竭模型,观察各组大鼠的BCL-Xl蛋白的表达、ALT、AST水平、肝细胞凋亡率及死亡率.结果 BCL-Xl基因在处理组的表达高于在模型组中的表达;建立大鼠肝衰竭后6 h,处理组的血清ALT、AsT水平低于模型组(P<0.05).处理组的肝细胞凋亡率低于模型组(P<0.05).处理组的大鼠死亡率低于模型组(P<0.05).结论 在急性肝衰竭大鼠中,肝细胞的凋亡率与大鼠的死亡率呈正相关;BCL-Xl在肝组织中的过表达能减少急性肝衰竭模型大鼠的肝细胞凋亡率,降低急性肝衰竭大鼠的死亡率.

潮霉素抗性HBV包装细胞系的构建

目的配合HBV载体的研究,为HBV载体提供包装.方法HBV全基因经删除包装信号ε区后,插入到潮霉素抗性pMEP4载体,转染HepG2细胞系,用潮霉素筛选形成细胞克隆.检测表达HBsAg及HBcAg较多者作为HBV包装细胞系,进一步转染稳定表达复制缺损型HBV的质粒,PCR方法观察上清液中病毒的形成.结果包装细胞系高表达HBsAg和HBcAg;携带重组HBV的G418抗性重组逆转录病毒感染潮霉素抗性包装细胞系后,经两种抗生素同时筛选,在细胞培养上清液中能检出突变型HBV,未检出野生型HBV.结论删除了包装信号的HBV次全基因,失去了形成完整HBV颗粒的能力,但能为复制缺损型HBV提供包装所需的结构蛋白.

丁型肝炎病毒基因组RNA包埋锤头状核酶的活性研究

目的探讨用丁型肝炎病毒(HDV)基因组来包埋HBV靶向性核酶对核酶体内外活性产生的影响.方法用和HBV靶基因体外转录产物在不同反应条件下温育对HDV-核酶重组体的体外切割活性定量分析;与HBV基因组共转染Huh-7细胞以考察核酶在细胞内对HBV基因表达水平的抑制.结果体外实验发现,温度及核酶和底物的二级结构对包埋于HDV序列的核酶体外切割活性均有较大的影响.提高反应温度或消除二级结构都可使HDV包埋核酶的体外活性达到明显效果,与相同条件的裸露核酶活性没有太大差异.而细胞实验则表明,活性明显优于裸露核酶,可以将靶基因的表达抑制到极低水平.结论HDV RNA序列对所包埋核酶体外活性有一定的抑制作用,在细胞内则使核酶的活性得到显著增强.

逆转录病毒载体介导人类G6PD基因在人红白血病细胞中的表达

目的探讨逆转录病毒载体介导人类G6PD基因在人白血病细胞中的表达.方法构建G6PD cDNA的逆转录病毒表达载体pLG6PDSN,转染包装细胞PA317,病毒上清感染人红白血病细胞K562,以PCR方法检测病毒载体是否整合于细胞基因组,定量法测定G6PD表达.t检验比较转染组与对照组间的表达差异.结果酶切鉴定表明,G6PD cDNA准确插入pLXSN相应位点,载体构建成功.转染后PCR扩增NeoR基因,证明细胞DNA整合有逆转录病毒载体.转染组与对照组酶活性测定差异有显著性(P<0.01).结论本试验所构建的重组载体pLG6PDSN为严重G6PD缺陷症的基因治疗提供了表达载体.

通过grp启动子调控的可诱导性自杀基因疗法增强光动力治疗效果

超声靶向破坏微泡在糖尿病基因治疗中的应用

糖尿病是以高血糖为特征的代谢性疾病,常伴有各种组织,特别是眼、肾、心脏、血管、神经慢性损害和功能障碍,为治疗带来困难.近年来,糖尿病的基因治疗成为热点.超声靶向破坏微泡(UTMD)安全性高、重复性好,组织靶向高,已经成为基因潜在传递方法.本文就UTMD技术及其在糖尿病基因治疗中的研究进展进行综述.

涂层支架局部导入c-myc反义核酸防治再狭窄的实验研究

目的:探讨铂-铱合金明胶蛋白涂层支架局部导入c-myc反义寡核苷酸的可行性及对新生内膜的抑制作用.方法:将携带c-myc反义寡核苷酸的国产铂-铱合金明胶蛋白涂层支架置入兔颈动脉(n=16),在术后7、14、30、90 d处死动物行HE和Weigert染色,图像分析测量新生内膜厚度和面积,c-myc蛋白免疫组化染色并与对照组(n=16)进行对比分析.结果:随观察时间延长两组新生内膜面积和平均新生内膜厚度呈持续增加趋势,且不同观察时间点给药组新生内膜面积和平均新生内膜厚度均显著小于对照组(P均＜0.001).c-myc免疫组化染色给药组为弱阳性和阴性,对照组为阳性.14 d时透射电镜观察显示血管平滑肌细胞呈过渡型改变.结论:国产铂-铱合金明胶蛋白涂层支架可携带c-myc反义寡核苷酸于兔颈动脉局部,并抑制新生内膜的形成,提示支架可作为局部给药防治再狭窄的工具.