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不可分型流感嗜血杆菌 LPD 基因分布及其重组表达产物免疫保护作用
目的：了解无荚膜型流感嗜血杆菌（NTHi）临床菌株中外膜脂蛋白 D（LPD）基因分布及其序列保守性，确定重组表达的 LPD（rLPD）免疫原性和免疫保护性。方法采用 PCR 检测 NTHi临床菌株中 LPD 基因，T-A 克隆后测序。构建 LPD 基因原核表达系统，采用 Ni-NTA 亲和层析法提纯表达的 rLPD。采用 SDS-PAGE 和 Bio-Rad 凝胶图像分析系统检测 rLPD 表达情况及其产量。采用ELISA 和 Western blot 检测 rLPD 的抗原性和免疫反应性。采用小鼠感染模型了解 rLPD 对 NTHi 致死性感染的免疫保护效果。结果所有 NTHi 菌株均检出 LPD 基因，其核苷酸和氨基酸序列相似性分别高达98.0％~99.4％和98.5％~100％。所构建的原核表达系统能高效表达 rLPD。rLPD 免疫家兔可产生高效价抗体，NTHi 全菌兔抗血清及 NTHi 感染患儿血清能识别 rLPD 并与之结合。ELISA 结果显示，93.6％（58/62）和53.2％（32/62）NTHi 感染患儿血清分别 rLPD-IgM 和 rLPD-IgG 阳性。100μg或200μg rLPD 对 NTHi 致死性感染小鼠的免疫保护率分别为60.0％或73.3％。结论 LPD基因在 NTHi 菌株中广泛分布且序列保守，其重组表达产物 rLPD 具有良好的免疫原性及一定的免疫保护作用，可作为 NTHi 基因工程疫苗候选抗原之一。
关键词： 不可分型流感嗜血杆菌 LPD 基因/ 脂蛋白 D 重组表达 免疫原性 免疫保护性 -
问号钩端螺旋体ompA基因分析及其重组表达产物的免疫学鉴定
目的 了解我国15群15株问号钩端螺旋体(简称问号钩体)参考标准株携带ompA基因情况,重组表达OmpA(rOmpA)并鉴定rOmpA的免疫原性和免疫保护性.方法 采用酚-氯仿法提取问号钩体基因组DNA,PCR扩增全长ompA基因,T-A克隆后测序.构建问号钩体黄疸出血群赖型56601株ompA基因的原核表达系统,采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶}冬{像分析系统检测rOmpA表达情况及其产鼍.rOmpA免疫家兔以获得抗血清,采用免疫扩散试验检测抗血清效价.采用Western blot检测rOmpA与其抗血清和问号钩体56601株全菌抗血清的免疫反应性,显微镜凝集试验(MAT)检测rOmpA抗血清对15株问号钩体的交叉凝集情况.分别采用问号钩体黏附J774A.1细胞模型和豚鼠感染模型,了解rOmpA兔抗血清黏附阻断及rOmpA免疫保护作用.结果 15株问号钩体均含有序列保守的ompA基因,双曲钩体Patocl株则否.rOmpA表达量约占细菌总蛋白的20%.rOmpA能诱导家兔产生抗体,其抗血清免疫扩散效价为1:4.兔抗血清及问号钩体56601株全菌抗血清均能与rOmpA产生阳性Western blot信号.rOmpA抗血清对15株问号钩体的MAT效价为1:20～1:320.1:10～1:160稀释的rOmpA抗血清均能阻断问号钩体黏附J774A.1细胞,100μg和200μg rOmpA对豚鼠的免疫保护率分别为50.0%和75.0%.结论 ompA基因仅存在于不同血清群致病性问号钩体基因组中.rOmpA具有较好的抗原性,多种免疫学方法 检测显示,有可能作为通用型问号钩体基因上程疫苗的候选抗原.
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CYP2C9基因1300A＞T突变对体外药物代谢活性的影响
华法林是目前临床常用的抗凝药物，自20世纪40年代合成以来，该药广泛应用于临床抗凝和抗血栓治疗，至今仍无有效的替代品出现。华法林的有效治疗范围较窄，不同个体间维持剂量存在很大的差异，用药不当会导致出血或血栓形成等严重不良事件的发生［1-2］。近年来研究发现，基因多态性、药物相互作用及饮食等因素都会影响到华法林的临床药效，其中基因多态性是重要的因素之一［1-4］。我们在临床日常工作中发现1例华法林高敏感患者，其日常稳定服药量仅为常规剂量的1／2，本研究对该患者进行了细胞色素P4502C9（ cytochrome P4502C9，CYP2C9）、维生素K环氧化物还原酶复合物1（vitamin K epoxide reductase complex 1，VKORC1）及细胞色素P4504F2（cytochrome P4504F2，CYP4F2）基因测序分析，发现其CYP2 C9基因携带一种全新的突变类型1300A＞T，并将突变型CYP2C9蛋白在昆虫细胞微粒体中重组表达，体外添加探针底物药，以研究其主要体外药物代谢特性是否发生改变，为临床个体化用药提供理论支持。
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幽门螺杆菌HspA亚基的表达与纯化
目的:利用原核表达载体高效表达幽门螺杆菌热休克蛋白A(HspA),并进行纯化.方法:PCR扩增hspA基因,将其克隆至原核表达载体pET22b,pQE-60,pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析表达.利用镍离子亲和层析对表达产物进行纯化.免疫印迹检测蛋白的抗原性.结果:PCR扩增得到hspA基因,在载体pQE-60中以HspA和HspA-His6两种形式得到表达,表达量高达菌体总蛋白的40%以上.经镍离子亲和层析后,纯化率分别为88.63%和86.32%,但HspA-His6在纯化过程中发生降解.免疫印迹实验表明,HspA和HspA-His6都有很好的抗原性.结论:实现了HspA蛋白的高效表达和纯化,为幽门螺杆菌HspA亚单位疫苗的免疫实验奠定基础.
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幽门螺杆菌黏附素基因babA2的克隆、序列测定及其生物信息学分析
目的:获取幽门螺杆菌黏附素基因babA2,并将他克隆到质粒pET-22b(+)中进行核苷酸序列分析,并对其进行生物信息学分析,为研究Hp黏附素的分子机制和免疫原性提供基础.方法:利用PCR技术扩增babA2,并将其定向插入pET-22b(+)载体,通过DNA序列分析仪进行核苷酸分析,生物信息学软件对其进行生物学特性分析.结果:DNA序列分析表明,所克隆的babA2基因序列与GenBank公布的一致.ANTHEPROT V4.3c软件预测其蛋白质分子量约为78 KD,并显示出了良好的抗原性和疏水性.结论:本研究获得了序列正确的babA2基因,生物信息学分析表明其具有优良的免疫原性,为其重组表达及其相关研究奠定了良好的基础.
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水蛭肽研究应用进展
水蛭素(hirudin)由活血化淤中药水蛭的唾液腺分泌,1955年Markwardt[1]从医用水蛭咽周腺体中成功分离出的水蛭素纯品是迄今为止强的直接凝血酶抑制剂.80年代末,Dodt等[2]测定出水蛭素的氨基酸全序列,使基因重组表达水蛭素的研究取得成功.
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结核分枝杆菌保护性肽表位KLIANNTRV多聚体的免疫原性研究
抗结核病的保护性免疫机制目前仍不清楚,细胞免疫尤其是循环及感染部位的T淋巴细胞应答被认为起着重要作用.我们采用分子生物学的方法重组表达了结核分枝杆菌保护性肽表位KLIANNTRV二聚体、四聚体和八聚体,并采用结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)试验阳性健康个体的外周血单个核细胞验证其免疫原性,为设计新型结核疫苗奠定良技好的基础.
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殊异韦荣菌中乳酸脱氢酶重组蛋白的表达、纯化及活性分析
目的 进一步测定殊异韦荣菌中依赖性乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的活性,以期为研究该酶的具体功能及作用机制奠定基础,并为龋病预防和治疗提供新的思路.方法 重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中,采用不同时间及6种不同浓度的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyhhio-β-D-galactoside,IPTG)诱导乳酸脱氢酶蛋白表达,选择佳条件诱导LDH蛋白表达.并经His-标记蛋白纯化柱(HisTRAP FF柱)提纯,用LDH活性试剂盒测定蛋白活性.结果 pET-28a-LDH转入BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示适表达条件分别为IPTG终浓度0.4 mmol/L、30℃诱导8h,IPTG终浓度0.4 mmol/L、30 ℃诱导6h.经BandScan 5.0软件分析,pET-28a-LDH质粒转化BL21(DE3)表达相对含量为9.0％,高于Rosetta(DE3)的6.1％；LDH活性试剂盒测定的蛋白活性值为13.79.结论 本项研究获得了LDH蛋白的适诱导条件,并测出殊异韦荣菌中依赖性LDH的活性,为进一步研究LDH的功能及在龋病防治中的作用奠定了基础.
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登革1型病毒NS1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备
目的 重组表达登革1型病毒NS1蛋白并制备多克隆抗体.方法 通过RT-PCR扩增编码登革1型病毒NS1蛋白的基因序列,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)后经酶切测序鉴定,获得重组质粒pET-NS1.进一步使用IPTG诱导表达,经免疫印迹鉴定后,采用蛋白浸提方法从SDS-PAGE胶中纯化回收融合蛋白,并通过透析对目的蛋白进行复性;纯化复性后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光法测定抗体效价.结果 成功构建了高效表达登革1型病毒 NS1蛋白的原核表达载体,表达的重组NS1蛋白占菌体蛋白总量的50%以上,以包涵体形式存在;免疫印迹表明表达的重组NS1蛋白能够为登革病毒兔抗血清识别,纯化后纯度可达95%以上;免疫小鼠后获得了效价>1:1 000的抗登革病毒NS1蛋白的鼠多克隆抗体.结论 原核表达的重组NS1蛋白具有良好的免疫原性,诱导产生的多克隆抗体能够有效识别天然NS1蛋白,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体的生物学功能奠定了基础.
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产气荚膜梭菌α毒素突变体构建及其卵黄抗体制备
目的 制备特异性的产气荚膜梭菌α毒素(Clostridium perfringens alpha-toxin,CPA)卵黄抗体(yolk immunoglobulin,IgY).方法 利用定点突变技术,将CPA第56位天冬氨酸和第68位组氨酸分别突变为丝氨酸,构建了重组表达载体pTIG-mCPAD56S和pTIG-mCPAH68S,将其转化入E.coli Origami中进行诱导表达.用亲和层析的方法对突变体蛋白进行纯化并对其活性及抗原性进行检测,将获得的突变体蛋白分别免疫健康母鸡,收集鸡蛋;经水稀释法纯化卵黄中IgY;用酶联免疫吸附试验检测IgY效价;通过筛选保护剂而选择佳的IgY冻干条件.结果 与结论 pTIG-mCPA在Origami表达菌株中得到高效表达,经验证,mCPAD56S和mCPAH68S均完全失去生物学活性同时保留抗原性;纯化卵黄后得到较高纯度的特异性IgY,其效价可达到1∶200 000;经过IgY冻干条件的筛选,终选择不添加保护剂大量冻干IgY作为抗体的储备.该研究为研制基于IgY抗体的检测方法奠定了基础.
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蛋白酶体激活因子REGγ的重组表达及其体外功能的初步探讨
目的 蛋白酶体激活因子11S调节蛋白复合物γ亚单位(11S regulator complex gamma subunit,REGγ)的重组表达,初步探讨其与骨形成负调控分子酪蛋白激酶-2相互作用蛋白-1(casein kinase-2 interacting protein-1,CKIP-1)的相互作用.方法 首先以质粒pCMV-Myc-REGγ为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增出765 bp的REGγ cDNA片段,然后亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-2并转化入大肠杆菌BL21经IPTG诱导表达,表达产物超声破碎后进行SDS-PAGE和Western印迹鉴定,进而通过GST Pull-down实验验证REGγ是否与CKIP-1存在相互作用.结果 通过测序证实原核表达载体pGEX-4T-2-REGγ构建成功,进一步表达鉴定发现GST-REGγ蛋白主要以可溶性的形式存在于裂解上清中;GST Pull-down实验表明REGγ与CKIP-1存在明显的相互作用.结论 REGγ与CKIP-1在体外存在相互作用,为进一步深入研究REGγ对CKIP-1的调控作用奠定了基础.
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肺炎链球菌蛋白PLYd和PsaA的制备与鉴定
目的:对2种肺炎链球菌蛋白肺炎链球菌脱毒溶血素(detoxified pneumolysin,PLYd)和肺炎链球菌表面黏附素(pneumococcal surface adhesin A,PsaA)进行全基因合成、重组表达、制备和鉴定.方法:根据GenBank中PLYd,PsaA的基因序列和氨基酸序列,通过密码子优化和全基因合成的方式获得2种蛋白的基因,在PLY基因中引入多位点突变保证表达的蛋白无毒性,构建无标签、高效重组表达菌株,建立2种重组蛋白的纯化制备方法,并进行抗原鉴定及免疫原性检测.结果:人工合成的PLYd,PsaA基因序列经鉴定与预期一致.2种蛋白在大肠杆菌中均获得了高效表达,表达量在40％以上,经2步纯化其纯度均达到95％.2种蛋白均能与阳性血清产生特异性抗原抗体反应,免疫小鼠后均可诱导产生较高水平的蛋白特异性抗体.结论:成功制备2种无标签肺炎链球菌蛋白PLYd,PsaA,且具备与天然抗原相似的抗原性和免疫原性,为开展应用研究奠定基础.
关键词： 肺炎链球菌 肺炎链球菌脱毒溶血素 肺炎链球菌表面黏附素 重组表达 免疫原性 -
基因重组沙蚕纤溶活性蛋白的克隆、表达和活性检测
目的 从双齿围沙蚕消化道中克隆并表达具有纤维蛋白溶解活性的蛋白.方法 提取沙蚕消化道上皮细胞RNA,逆转录获得cDNA.根据丝氨酸蛋白酶家族基因保守序列设计兼并引物,筛选包含丝氨酸蛋白家族保守位点的阳性克隆,进行核苷酸测序.根据该序列利用5'RACE技术进行扩增,将获得的基因片段克隆到pMAL-p2载体中,在大肠杆菌BL21中进行融合表达.表达的融合蛋白经过直链淀粉树脂亲和色谱和DEAE-Sepharose 4B纯化后,纤维蛋白平板法检测其溶栓活性.结果 cDNA经5'RACE扩增获得长度为260 bp的基因片段,推测其包含可编码83个氨基酸的完整序列(约9.0×103);重组pMAL-p2表达出51.0×103的融合蛋白,经过测定具有明显的溶栓活性.结论 从双齿围沙蚕中克隆获得的基因片段表达的融合蛋白具有溶栓活性,有望成为一种新型的纤溶药物.
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蚯蚓溶栓酶基因的克隆及非融合性表达
目的克隆和表达我国特有的双胸蚓属蚯蚓(Lumbricus bimast us)体内一种具有纤溶活性的蛋白质.方法通过蛋白质N-末端测序、引物设计及合成、RT-PCR得其对应的cDNA,随后构建了pBV220-P30重组质粒,在大肠杆菌DH5α中进行非融合性表达,再经亲和色谱柱纯化复性,得到重组蚯蚓溶栓酶蛋白.结果克隆cDNA全长888 bp,编码含242个氨基酸的成熟肽,SDS-PAGE电泳显示分子量在30×103左右,因此将其命名为P30,经活性测定,具有纤溶活性.结论 P30为首次发现的新基因,在国际基因库的输入号为Genebank AF 109648,并获得国家专利,专利号为98102257.X.
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结核分枝杆菌CFP10和ESAT6优势肽段融合蛋白的表达及其免疫学研究
目的:构建结核分枝杆菌分泌蛋白的重组质粒及工程菌,获得纯化的CFP10-ESAT6P蛋白抗原,制备初步用于检测结核病患者的特异性抗体.方法:根据编码结核分枝杆菌基因序列设计引物,克隆表达结核CFP10-ESAT6重组蛋白,表达产物免疫新西兰大白兔,其中80%可产生高价的抗体.利用产物建立IgG间接ELISA方法鉴定其抗原性及实用性.结果:应用ELISA法,通过检测113例结核病患者、82例非结核病患者及健康献血员,CFP10-ESAT6P和对照PPD对结核病患者血清检测的敏感性分别为89.4%和79.6%,特异性分别为96.3%和93.9%.结论:高效表达纯化的CFP10-ESAT6蛋白抗原性强,可用于结核病患者抗体的检测,用于结核病的辅助诊断.
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β2肾上腺素受体遗传多态性与夜间哮喘的相关性研究
人类β2肾上腺素受体(β2AR)基因位于染色体5q31.目前已检测出该基因编码区存在着9个突变位点(遗传多态性),其中4 个可导致氨基酸序列的改变,从而使编码的第46、79、100、491位氨基酸分别发生Arg16→Gly、Gln27→Glu、Val34→Met、Thr164→Ile的改变[1].夜间哮喘是哮喘的一种特殊类型,其夜间症状及气道阻塞加重,对其发生机制尚不清楚.但已了解到夜间哮喘其夜间β2AR下调,而非夜间哮喘者患者和正常人无此下调[2].而在定位诱变和重组表达研究中已发现,β2AR16位点上的Arg突变为Gly具有增强激动剂所促发的受体下调作用[3].于是人们推测:Gly16与夜间哮喘的β2AR下调可能有关.为了探讨这一问题,本研究利用聚合酶链反应-等位基因特异性寡核苷酸杂交法(PCR-ASO),从分子水平对夜间哮喘和非夜间哮喘的β2AR16和27位的遗传多态性进行分析,并探讨这一多态性与夜间哮喘的关系.
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结核分枝杆菌CysA2抗原的基因克隆、表达及在血清诊断中的应用
目的 克隆并构建结核分枝杆菌CysA2基因原核表达系统,建立基于rCysA2的ELISA并检测rCys A2-ELISA在肺结核患者血清学诊断中的敏感性和特异性.方法 采用PCR扩增CysA2基因,构建CysA2基因原核表达系统.采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白rCysA2表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯rCysA2,免疫印迹鉴定rCysA2的免疫反应性.以rCysA2为包被抗原,建立rCysA2-ELISA并用于检测132例血清抗体,其中涂片阳性和阴性肺结核患者血清分别占96例和36例,非肺结核肺部疾病病人血清抗体30例,健康对照血清50例.结果 克隆的CysA2基因与GenBank中相关序列相似性为100％.rCysA2表达量为细菌总蛋白的25.4％.提纯的rCysA2在SDS-PAGE后显示为单一的蛋白条带.rCysA2-ELISA检测涂片阳性和涂片阴性的肺结核患者血清抗体检出率分别为63.5％和61.1％,50例健康对照全部阴性、30例非肺结核肺部疾病患者1例呈现阳性,此方法的灵敏度为62.9％(83/132),特异性为98.8％ (79/80).结论 本研究成功地克隆并构建了结核分枝杆菌CysA2基因及其原核表达系统.以rCysA2为包被抗原的rCysA2-ELISA方法有较高的灵敏度和很好的特异性,能有效检测涂片阴性患者血清抗体,rCysA2有望成为结核病血清诊断的有效候选抗原之一.
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结核分枝杆菌Rv0309抗原的重组表达、纯化和鉴定
目的 重组表达结核分枝杆菌Rv0309蛋白,以进一步探讨其免疫效应.方法 将结核分枝杆菌抗原Rv0309的全长cDNA插入到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建成Rv0309重组质粒.将重组质粒转人大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达,进一步经GST亲合层析柱纯化,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定重组表达蛋白.结果 获得了pGEX4T-Rv0309重组子,并在大肠埃希菌BL21中诱导表达重组Rv0309蛋白,其条带大小约23 000,与预期结果相符.结论 成功地进行了结核分枝杆菌抗原Rv0309的基因克隆与重组表达,为进一步研制新型结核病疫苗打下了基础.
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两种具有双功能活性蝎毒蛋白融合体的构建
目的 首次报道利用东亚钳蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽-BmKAGAP产生两种不同的融合蛋白,目的是获得镇痛和抗肿瘤的双功能活性.方法 融合蛋白是以嵌合毒素的形式进行构建,由三部分组成,包括促性腺激素释放激素(luteinizing hormone-releasing hormoneL,HRH),两种不同类型的柔性连接物,以及BmKAGAP.克隆编码两种融合蛋白的基因并在大肠杆菌中实现可溶性表达.通过金属离子螯合亲和层析和阳离子交换层析方法对融合蛋白分离纯化,采用小鼠醋酸扭体法和MTT法测定融合蛋白的镇痛活性与细胞抑制活性.结果 融合蛋白在小鼠模型中体现出镇痛活性(rLHRH-Tag(His)-AGAP＞rTag(His)-LHRH-L8-AGAP＞rBmKAGAP),同时对肝癌细胞株Hep3B具有细胞毒活性(rLHRH-Tag(His)-AGAP＞rBmKAGAP＞rTag(His)-LHRH-L8-AGAP).结论 得到优化的双功能融合蛋白候选者为嵌合毒素rLHRH-Tag(His)-AGAP.
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凡纳滨对虾过敏原蛋白Lit v 1.2的原核表达与纯化
目的:诱导表达凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)过敏原蛋白Lit v 1.2,并利用6-His标签获得纯化蛋白.方法:用NdeⅠ和PstⅠ双酶切实验室前期构建保存的pGEM-T-Lit v 1.2质粒,将目的基因与表达载体pET44a连接,转入表达菌株Rosetta,通过氨苄青霉素( Amp)抗性基因筛选,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷( IPTG)诱导表达,获得Lit v 1.2蛋白. 通过亲和层析纯化蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化效果. 结果:成功构建了重组质粒pET44a-Lit v 1.2,SDS-PAGE结果显示Lit v 1.2基因在大肠杆菌Rosetta中获得高效的可溶性表达,蛋白质分子量与理论值相符,且获得的目标蛋白纯度高. 结论:本研究通过原核表达及亲和层析获得高产量、高纯度的凡纳滨对虾过敏原蛋白Lit v 1.2 ,为进一步研究Lit v 1.2的免疫学特性奠定基础.
