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转染人CTLA-4细胞的对树突状细胞B7分子表达的影响
从PHA活化的人外周血T细胞中抽提总RNA,经RT-PCR扩增出CTLA-4的全长基因,构建逆转录病毒载体pEGZ-Term/CTLA-4,经PCR及电泳鉴定后感染包装细胞293T.收集培养上清感染L929细胞.用Zeocin选择培养.经免疫荧光及流式细胞术进行筛选,获取稳定表达CTLA-4分子的细胞株CTLA-4/L929.将CTLA-4/L929经丝裂霉素处理后与体外细胞因子诱导的树突状细胞共同孵育.分别于24、48及72 h,用直接免疫荧光法和流式细胞术分析树突状细胞B7-1和B7-2分子的表达.研究结果显示,构建的重组逆转录病毒载体pEGZ-Term/CTLA-4的PCR产物长约700 bp,与人CTLA-4基因的长度一致.经Zeocin选择及多次亚克隆化培养,CTLA-4基因转染细胞CTLA-4/L929稳定表达膜型CTLA-4分子.以其为刺激细胞与树突状细胞共同培养后,可明显下调树突状细胞B7-1的表达,但对B7-2的表达没有影响.本研究获得的CTLA-4基因转染细胞株,为进一步探讨CTLA-4及其配基分子在免疫应答中的作用与机制提供了手段.
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血红素加氧酶1延长异种心脏移植存活的机制研究
探讨血红素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-1)在器官移植中抗急性血管排斥反应的作用.通过建立豚鼠到SD大鼠异位心脏移植模型,用血红素(hemin)分别诱导供者和受者,上调HO-1基因表达;用眼镜蛇毒因子、环孢素A抑制超急性排斥反应;观测供者心脏存活时间,并分别检测心脏组织HO-1表达、受者血清异种抗体IgM的变化及异种抗体IgM和C3在血管内膜的沉积;采用TUNEL方法检测心脏组织细胞凋亡;RT-PCR方法测定组织CD40L mRNA表达水平.结果显示:上调HO-1表达能明显延长心脏移植存活时间,抑制异种抗体IgM表达和在血管内膜的沉积,减少心肌细胞的凋亡并且抑制CD40L mRNA的表达.该结论表明HO-1通过介导CD40-CD40L共刺激途径抑制大鼠异种心脏移植后急性血管排斥反应,延长心脏移植存活时间.
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胃癌组织中PD-L1的表达及其与预后的关系
为探讨共刺激分子PD-L1在胃癌组织中的表达及其临床意义.用免疫组织化学方法检测102例胃癌和10例胃腺瘤PD-L1的表达,并对其表达与患者年龄、性别、胃癌部位、肿瘤大小、组织类型、肿瘤浸润深度、分化程度、淋巴结转移等进行相关分析.结果:胃腺瘤组织和正常胃组织不表达PD-L1分子,胃癌组织中PD-L1呈阳性表达,表达阳性率为42.2%;PD-L1分子在胃癌组织中的表达与胃癌患者年龄、性别、肿瘤部位、组织学类型无关(P＞0.05),与肿瘤大小、肿瘤的浸润深度、淋巴结转移及预后有关.当肿瘤大于5 cm(P＜0.05)、肿瘤浸润达深肌层、淋巴结转移阳性、生存期＜2年时,PD-L1表达阳性率明显升高(P＜0.01).多变量分析还显示,PD-L1分子可作为评估胃癌预后的独立因素.胃癌组织PD-L1分子的检测有助于胃癌预后的判断和作为个体化治疗选择的生物学指标.
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共刺激分子在小鼠叶酸性肾病组织中的表达及其免疫病理意义
观察共刺激分子在小鼠叶酸性肾病组织中的动态表达并分析叶酸肾病的免疫病理的可能机制.以小鼠叶酸性肾病为研究对象,采用免疫组织化学方法检测肾脏组织中CD40/CD40L、B7-1/CD28和4-1BB等共刺激分子的表达,免疫荧光标记和流式细胞术分析脾脏T淋巴细胞及其亚群,并行肾功能等常规检测.实验结果表明,病变先后涉及两个时期即急性期和慢性期.在早期,小鼠免疫应答增强,肾脏组织呈现CD40、B7-1、4-1BB的异常表达,CD28、CD40L在浸润淋巴细胞中表达,同时伴有炎症细胞浸润,表现为急性肾功能衰竭;在晚期,表现为慢性肾功能衰竭.同时肾脏组织呈现共刺激分子的异常表达和脾脏T淋巴细胞数量明显下降.这些均表明共刺激分子在小鼠叶酸性肾病不同阶段的发生发展中起着重要的作用.
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4-1BBL逆向信号促进单核细胞的增殖和分泌细胞因子的作用
采用抗人4-1BBL单克隆抗体1F1包被24孔培养板,加入经免疫磁珠阴性选择获得的高纯度人外周血单核细胞,动态观察细胞的生长状态,并用3H-TdR掺入法分析单核细胞增殖,应用ELISA动态测定培养上清中IL-6、IL-10、M-CSF和FL等细胞因子水平.结果发现1F1非常有效地促进单核细胞的增殖,1F1组单核细胞分泌高水平的M-CSF以及IL-6和FL增加,但1F1组单核细胞分泌IL-10水平低于对照组(P<0.05).由此表明,抗人4-1BBL单克隆抗体1F1通过激发单核细胞4-BBL逆向信号,介导单核细胞分泌M-CSF、IL-6和FL.上述细胞因子联合作用,从而促进了单核细胞的增殖.
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人B7-H3基因转染及其生物学功能的研究
B7-H3是新近发现的B7家族新成员.为探讨其体外生物学功能及单克隆抗体的研制构建了B7-H3基因转染细胞.利用PCR的方法扩增出B7-H3基因,继而插入逆转录病毒载体pGEZ-Term,重组逆转录病毒载体与两个辅助病毒载体脂质体法共转染包装细胞293T,经用含有完整病毒颗粒的293T细胞的培养上清感染L929细胞,Zeocin筛选获得B7-H3的基因转染细胞.RT-PCR、Western blot和流式细胞仪表型分析等方法鉴定表明,B7-H3/L929基因转染细胞能稳定表达人B7-H3蛋白.继而基因转染细胞对T细胞体外培养试验显示该基因转染细胞与T细胞共培养可抑制其体外增殖.ELISA法分析表明该基因转染细胞抑制活化T细胞IFN-γ及IL-10的分泌.CD28信号可以逆转B7-H3对活化T细胞的抑制效应.综上结果证实,B7-H3对体外活化的T细胞具有负性调控作用.
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ICOS/GL50信号在T细胞依赖性体液免疫应答中的作用
研究ICOS/GL50信号在T细胞体外增殖、细胞因子分泌以及B细胞抗体分泌中的作用,进一步探讨该信号途径在机体体液免疫应答中的作用机制.采用3H-TdR检测GL50-L929转染细胞和特异性鼠抗人GL50单抗对T细胞体外增殖的作用;ELISA法检测GL50-L929转染细胞和抗人GL50单抗对T细胞分泌IL-2、IL-10以及ICOS-L929转染细胞和特异性鼠抗人GL50单抗对PWM介导的B细胞分泌抗体的效应.结果提示GL50-L929转染细胞能够促进经抗CD3单抗活化的T细胞增值和分泌IL-10,而抗GL50单抗可以阻断这些效应.ICOS分子与B细胞上GL50分子的结合上调PWM介导的B细胞分泌抗体而抗GL50单抗则下调这一效应.这些表明,ICOS/GL50信号途径在机体T细胞依赖的体液免疫应答反应中发挥着重要的调节作用.
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人OX40转基因细胞株的建立及其对树突状细胞的促分化作用
应用RT-PCR方法,从PHA活化的扁桃体T细胞的mRNA中,扩增获得编码人OX40分子的cDNA,并将其克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切和测序鉴定确证.进而构建pcDNA3.1-OX40重组真核表达载体,脂质体法转染L929细胞,经G418筛选,获得能稳定高表达OX40分子的细胞株.经OX40-FITC单抗标记和FCM检测,阳性表达率为89.1%.转基因细胞在可溶性CD40L共存条件下,与未成熟DC共育,能促进DC的进一步分化成熟,使DC膜分子CD40、CD86和CD83呈上调性表达.
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共刺激分子B7-H1转染角朊细胞对T细胞增殖、细胞因子分泌和表面标记的作用
分析B7-H1共刺激分子阳性细胞激活的T细胞亚群表面标志和细胞因子分泌格局的变化,初步鉴定所诱导具有调节功能的人体T细胞亚群生物学特性.用抗CD3、CD28抗体分别作为第一和第二信号的来源,建立了T细胞体外增殖体系,引入B7-H1阳性A431细胞.结果表明B7-H1阳性A431细胞提供第二信号并加入抗CD3分子时,引起纯化的T细胞中等程度增殖,IL-10和TGF-β升高,CD45BBlow T细胞亚群比例增加.而在阳性对照组(同时加抗CD3和抗CD28抗体)可见T细胞高度增殖,此时再加入B7-H1阳性A431细胞,增殖反应受到抑制,加入B7-H1封闭型单抗,抑制缓解.认为B7-H1阳性A431细胞具有双向效应:当CD28不参与共刺激时,由B7-H1发挥共刺激作用,协同抗CD3抗体引起T细胞增殖;一旦T细胞从抗CD3和抗CD28抗体获得第一和第二信号出现高度增殖时,B7-H1阳性A431细胞发挥抑制作用.B7-H1阳性A431细胞提供第二信号的T细胞增殖,含有呈现典型Tr1细胞表型.针对增殖性T细胞应答(如移植排斥),表达B7-H1的非专职性抗原递呈细胞KC,可选择性诱导人体调节性T细胞(Tr1)的分化,发挥负向调节作用.
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TPA和IFN-γ活化角朊细胞对T淋巴细胞增殖和细胞因子分泌的作用
角朊细胞激活对T淋巴细胞增殖和细胞因子分泌的作用.TPA和IFN0联合作用,激活角朊细胞表达表面分子,FACS检测MHC Ⅰ、Ⅱ类分子和CD80、CD86分子水平,BT-PCR检测B7-H1共刺激分子表达.由激活角朊细胞提供T淋巴细胞激活的第二信号;绵羊红细胞花环沉淀分离纯化T细胞,抗CD3单抗提供第一信号,建立体外混合培养系统,3H-TdR渗入法检测T细胞增殖,ELISA检测培养上清细胞因子浓度.结果显示,TPA和IFN-γ联合作用可诱导角朊细胞表达B7-H1共刺激分子,并上调其MHCⅡ类分子.以B7-H1为第二信号,可以协同抗CD3单抗对T细胞的增殖作用,并呈现独特的细胞因子分泌格局.因此角朊细胞激活后表达B7-H1共刺激分子,此第二信号可刺激T淋巴细胞增殖,对其功能分化具有调节作用.
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B7-1mAb对B系淋巴瘤Raji细胞的生长抑制和凋亡诱导作用
为了研究B7-1分子功能性mAb(6H2)对表达B7-1分子的B系淋巴瘤Baii细胞的生物效应.分别运用免疫荧光标记和流式细胞仪技术(FACS)、台盼蓝拒染试验、MTT试验和RT-PCB半定量分析,分析6H2对Raji细胞的生长抑制和凋亡诱导作用.结果显示,6H2能抑制天然表达B7-1分子的人B系淋巴瘤Raii细胞的生长,产生细胞周期G2/M的阻滞,上调细胞表面CDl8和CD95(Fas)的表达,且能使Raji细胞中Bax的相对转录表达显著增加,从而诱导Raji细胞的凋亡.6H2为功能性抗人B7-1分子特异性mAb,具有抑制Raii细胞生长和凋亡诱导作用,在B系淋巴瘤研究和生物治疗中具有应用价值.
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CTLA-4与超抗原对SEA诱导T细胞无能的关联研究
在建立超抗原SEA诱导T细胞无能的体外模型基础上,观察了无能T细胞受SEA刺激时共刺激分子CD28和CTLA-4的表达.结果发现,与活化组相比,在SEA加入后的不同时相点无能T细胞上CD28的表达都是正常的,而CTLA-4分子在SEA加入的第60小时细胞表面有高水平的表达.这些结果表明,超抗原SEA诱导的这种无能状态与CTLA-4所介导的抑制作用增强有关.
关键词： 共刺激分子 CD28/CTLA-4 无能 超抗原SEA -
慢性肾炎患者外周血T细胞亚群和共刺激分子的表达及其意义
为研究慢性肾炎患者外周血T细胞亚群和共刺激分子的表达特点及其在慢性肾炎免疫病理机制中的作用,本文采用免疫荧光标记和流式细胞仪分析,对35例慢性肾炎患者外周血T淋巴细胞亚群和共刺激分子CD28、4-1BB等的表达进行研究.结果表明:(1)慢性肾炎患者T细胞亚群明显失衡,表现为CD4减少,CD8增加,CD4/CD8比值显著降低;(2)共刺激分子CD28表达显著低于正常对照组(CD28表达百分率分别为45.95±5.67和66.42±4.58,P＜0.001),且CD4+CD28+T细胞和CD8+CD28+T细胞均显著减少.治疗后缓解期患者T细胞亚群失衡明显纠正,CD28+T细胞,尤其是CD4+CD28+T细胞显著增多,而且CD4+CD28+T细胞数与患者的24h尿蛋白定量呈负相关(r=-0.47,P＜0.01);(3)慢性肾炎患者共刺激分子4-1BB在T细胞中的表达显著高于正常对照组(表达百分率分别为30.57±8.12和0.74±0.28,P＜0.001),治疗后的4-1BB表达水平显著降低,而且4-1BB异常高表达与CD8+T细胞数呈正相关(r=0.63,P＜0.05).从而表明慢性肾炎外周血T细胞亚群失衡和T细胞活化所必需的共刺激分子CD28、4-1BB异常表达,可能在慢性肾炎发生和病变进展中起着重要作用.
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Graves病患者外周血T细胞亚群和共刺激分子的表达及其意义
为研究Graves病患者外周血T细胞亚群及共刺激分子的表达,并探讨其在Graves免疫病理机制中的作用,本文采用免疫荧光标记和流式细胞仪术检测了19例Graves病患者和11例正常人外周血T细胞亚群及共刺激分子(CD28、B7、CD40、CD40L、4-1BB、0X40)的表达.结果表明,19例初诊Graves病患者外周血T细胞亚群呈现异常改变,表现为CD3+和CD4+T细胞显著下降(P＜0.05,P＜0.01),CD4+/CD8+T细胞比值倒置(P＜0.01),共刺激分子CD28在T细胞中的表达水平明显下降(P＜0.01),T细胞亚群CD4+CD28+、CD8+CD28+细胞数量均减少(P＜0.05,P＜0.01),而4-1BB分子表达显著地升高(P＜0.05).随防10例治疗后缓解患者,T细胞亚群失衡明显改善,共刺激分子CD28的表达水平上调(P＜0.01).而4-1BB分子的表达明显下降(P＜0.01),T细胞亚群CD4+CD28+、CD8+CD28+细胞数量均增加(P＜0.01),甲状腺自身抗体甲状腺球蛋白抗体(TGAb)和甲状腺微粒体抗体(TMAb)的表达水平均下降(P＜0.01,P＜0.01).从而表明,T细胞亚群的异常及共刺激分子CD28、4-1BB的表达改变与Graves病的免疫病理机制相关.
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PD-1/PD-L信号通路在免疫调节及免疫相关性疾病中的研究进展
免疫调节是指免疫应答过程中免疫系统内各组分之间构成一个相互协调、相互制约的网络结构,从而维持机体内环境的稳定.共刺激分子在免疫调节中的作用,越来越受到重视.其中程序性死亡受体-1 (programmed cell death-1,PD-1)及其配体(PD-L)是发现较晚的共刺激分子,PD-1/PD-L信号通路在机体免疫系统中的地位以及其与多种疾病之间的关联性是近年来免疫学研究的热点,有望成为慢性感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤和移植排斥反应中免疫干预治疗的有效靶分子.
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PD-1/PD-L信号通路:研究现况与展望
程序性死亡受体-1 (programmed cell death-1,PD-1)及其配体(PD-L1,PD- L2)是CD28/B7超家族成员,广泛表达于各种组织.PD-1/PD-L共刺激信号视机体的炎症程度、免疫状态和遗传背景不同而激活或抑制,主要参与T细胞的中枢及外周免疫耐受.与其他CD28超家族成员相比,PD-1信号通路发挥着更广泛和复杂的免疫调节作用,与自身免疫病、肿瘤、慢性感染及炎症密切相关.因此,能否通过PD-1/PD-L信号通路来调节自身免疫状态,从而治疗相关疾病,成为人们研究的热点.本文将对近年来的研究做一总结.
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CD4+ CD28- T淋巴细胞与自身免疫性疾病
CD4+ CD28- T细胞是一个具有特殊生物学效应的细胞亚群,高频出现于某些自身免疫性疾病中,具有细胞毒样的侵蚀特性、T细胞活化的不平衡性及抗凋亡特征,与疾病的发生、发展及转归密切相关.
关键词： CD4+ CD28- T细胞 共刺激分子 自身免疫性疾病 -
rIL-2对T细胞CD69、CD137和CD28表达的影响
T细胞的活化是体内特异性免疫应答的重要环节,且T细胞的活化需双信号刺激.起始信号可使T淋巴细胞初步活化,共刺激信号的存在使初步活化的T淋巴细胞进入完全活化状态,发挥免疫效应,本研究用流式细胞仪检测健康人PBMC经rIL-2刺激后对T细胞及其亚群活化和共刺激信号分子表达的影响.
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慢性乙型肝炎患者外周血CD80、CD86及其受体CD28的表达
目的 研究慢性乙型肝炎患者外周血CD80、CD86及其受体CD28与其病情状态、乙型肝炎病毒复制的关系.方法 用流式细胞术检测了24名健康体检者和92例慢性乙型肝炎患者外周血CD80、CD86、CD28的表达和CD8+CD28+、CD8+CD28-亚群淋巴细胞,并与病毒载量和乙型肝炎e抗原(HBeAg)进行相关分析.结果 慢性乙型肝炎CD80和CD86表达明显高于正常对照组和乙型肝炎病毒携带组(P<0.01);肝炎后肝硬化组明显高于慢性乙型肝炎组(P<0.05);慢性乙型肝炎轻、中、重度3组间差异也有统计学意义.慢性乙型肝炎组CD28的表达明显低于正常对照组和乙型肝炎病毒携带组(P<0.05).病毒载量高低和HBeAg是否阳性与外周血CD80、CD86、CD28及CD8+CD28+和CD8+CD28-亚群淋巴细胞差异无统计学意义.结论 CD80、CD86及受体CD28可能在慢性乙型肝炎免疫损伤过程中起重要作用,但与血清中病毒载量的变化和HBeAg阳性与否无关.
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哮喘患者外周血单个核细胞表面共刺激分子检测及意义
目的 探讨共刺激分子在哮喘发病免疫学机制中的作用.方法 选取28例哮喘患者和15名对照者,采用三色标记的流式细胞术检测哮喘患者外周血单个核细胞表面共刺激分子的表达水平.结果 与对照组相比,哮喘患者T细胞各亚群所占比例及B细胞、单核细胞占外周血单个核细胞的比例差异未见显著性,但CD4/CD8明显高于对照组(P＜0.05).CD4和CD8阳性T细胞表达的CD28及CTLA-4分子在两组间差异无显著性.哮喘组单核细胞(CD14阳性)CD80表达水平低于对照组(P＜0.05).而B细胞(CD19阳性)表面表达的CD86低于对照组(P＜0.05).结论 哮喘患者体内存在的T淋巴细胞功能紊乱可能与T淋巴细胞活化过程中共刺激信号的异常有关.
