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2009年新型甲型H1N1流感病毒进化过程中猪作为宿主及"混合器"的作用
不同种属流感病毒通过基因重排产生变异病毒导致了多次周期性全球流感大流行.2009年爆发流行的新型甲型H1N1流感病毒是猪H1N1流感病毒、禽H5N1流感病毒和人H1N1流感病毒的基因重排病毒,其8条基因片段均有自己的进化特点.禽类流感病毒是导致人类流感流行的流感病毒的起源,其常在猪体内进行基因重排进化为人类流感病毒.猪是流感病毒的中间宿主,也是不同种属流感病毒基因重排的"混合器",在2009年新型甲型H1N1流感病毒进化过程中起重要作用,是未来流感防制的重要环节.
关键词： H1N1甲型流感病毒 猪 进化 基因重排 宿主与病原体相互作用 -
2009年新型甲型H1N1流感病毒聚合酶编码基因进化分析
目的:探讨2009年新型甲型流感病毒(A/H1N1)聚合酶PA、PB1和PB2编码基因的进化规律.方法:从NCBI流感病毒基因数据库下载2009年新型甲型H1N1流行株的PA、PB1和PB2聚合酶编码基因序列以及人、猪和禽流感病毒相应的参考序列,采用Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0(MEGA4.0)软件比对和修剪此次流行株的代表序列及所有参考株序列并构建系统树,再比对和修剪此次流行株的代表序列及人A/H1N1病毒各年代(1918～2008年)参考序列并构建系统树,同时比对此次流行株的代表序列及人A/H1N1各年代(1918～2008年)参考序列编码PB2蛋白的氨基酸序列.结果:不同地区分离的2009年新型甲型H1N1流感病毒的聚合酶PA、PB1和PB2编码基因均具有高度同源性,并聚集在一个独特的进化支上,与猪流感病毒对应基因接近.三者均与2005年美国爱荷华州分离的人A/H1N1病毒基因(A/Iowa/CEID23/2005/H1N1)具有高度的相似性.2009年新型甲型H1N1流感病毒、2005年美国爱荷华州流行的H1N1(DQ889682)病毒PB2蛋白第627位氨基酸与禽类流感病毒相同,均为谷氨酸,而与其他人A/H1N1(1918～2008年)病毒的赖氯酸不同.结论:2009年新型甲型H1N1流感病毒聚合酶基因可能来源干2005年美国爱荷华州分离的人A/H1N1病毒,禽流感病毒可能参与了聚合酶基因的重排过程.
关键词： H1N1甲型流感病毒进化 聚合酶基因 基因重排 -
2009年新型甲型H1N1流感病毒血凝素基因进化分析
目的:探讨2009年新型甲(A)型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因与世界各地不同年代分离的A/H1N1代表株HA基因的进化关系.方法:从NCBI数据库下载2009年新型A/H1N1亚型流感病毒的HA基因序列以及以往流行的人、猪和禽的A/H1N1亚型流感病毒参考序列,采用Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0(MEGA4.0)软件进行序列比对和构建系统进化树,并分别比较2009年新型甲型H1N1流感病毒 HA 基因与北美地区、欧洲地区、亚洲地区A/H1N1流感病毒HA基因编码蛋白的氨基酸序列.结果:不同时期人A/H1N1亚型流感病毒代表株HA基因进化分析显示:2009年新型A/H1N1流感病毒HA基因与1976～2007年北美地区分离的7株人A/H1N1亚型流感病毒具有较高的同源性,与欧洲和亚洲地区的同源性较低.不同种属间A/H1N1亚型流感病毒HA基因进化分析显示:2009年新型A/H1N1流感病毒HA基因与1998和2007年北美地区分离的A/H1N1猪流感病毒的HA基因进化关系较近,与欧洲及亚洲地区分离的A/H1N1猪流感病毒及A/H1N1禽流感病毒进化关系较远.氨基酸比对结果显示2009年新型A/H1N1流感病毒HA基因的重要抗原位点与北美地区分离的A/H1N1猪流感病毒相近,与欧洲和亚洲地区分离的A/H1N1猪流感病毒及人类流感病毒疫苗株相比变化较大.结论:2009年新型甲型H1N1流感病毒HA基因可能是北美地区甲型H1N1猪流感病毒长期进化并与该地区人A/H1N1流感病毒部分基因片段重排的结果,对人H1N1甲型流感病毒疫苗可能并不敏感.
关键词： H1N1甲型流感病毒 血凝素基因 进化 基因重排 -
L6565白血病克隆细胞培养上清液的病毒特性和致病性
目的探讨小鼠L6565克隆细胞株培养上清液中病毒的特性及其致病性。方法从XC试验、逆转录酶活性、NB嗜性等方面了解培养上清液中病毒的特性；将培养上清液和超离心浓缩液分别皮下注射SSB系新生小鼠，观察其致白血病活性。结果L6565克隆细胞培养上清液的XC试验呈阳性，并具有逆转录酶活性和NB嗜性。培养上清液能诱发T淋巴细胞白血病/淋巴瘤(TL)和B淋巴细胞白血病/淋巴瘤(BL)，发病率为50%(5只/10只)；超离心浓缩液可诱发TL、BL和粒细胞白血病(GL)，发病率为100%(10只/10只)。结论小鼠L6565白血病克隆细胞株培养上清液中存在具NB嗜性的、可诱发SSB系新生乳鼠TL、BL及GL的小鼠白血病病毒。
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多发性骨髓瘤患者免疫球蛋白重链基因重排的检测及意义
目的探讨免疫球蛋白重链(IgH)基因重排在多发性骨髓瘤(MM)诊治中的应用.方法采用半巢式PCR技术,分别用MM患者的IgH基因的CDR2和CDR3区的两组引物,对61份MM患者的骨髓和外周血单个核细胞进行扩增.结果 27份骨髓标本中,IgH基因重排Fr2A阳性率为70.4%(19/27),34份外周血标本阳性率58.8%(20/34).骨髓标本的Fr2A阳性率略高于外周血标本,而Fr3A的阳性率两者无明显差异.MM患者的IgH基因重排与Ig型别、临床分期及浆细胞数有关.IgG型IgH基因重排阳性率高于IgA型及轻链型;III期患者IgH基因重排阳性率高于I、II期患者;浆细胞数大于5%时,IgH基因重排阳性率略高;7例达临床完全缓解的患者中,仅有1例IgH基因重排Fr2A、Fr3A均转为阴性.结论 PCR技术检测MM患者IgH基因重排可作为诊断、疗效观察、预后判断及微小残留病监测的参考指标之一.
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TEL-AML1阳性及阴性儿童急性淋巴细胞白血病基因重排的特点分析
目的 比较TEL-AML1融合基因阳性及阴性急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿的基因重排特点和其临床特点.方法 儿童ALL患儿111例,应用多重PCR技术检测IgH、Ig κ、TCR γ基因重排,双色间期FISH检测TEL-AML1/t(12;21)融合基因.分析不同TEL-AML1基因型与基因重排的相关性.结果 在41例TEL-AML1阳性儿童ALL患儿中,多数年龄介于2～10岁,其中3～5岁比例高;与儿童B系ALLTEL-AML1阴性组相比,TEL-AML1阳性患儿Ig κ和TCR γ的基因重排阳性率增高分别为54%(22/41)和71%(29/41).两者差异有统计学意义(P分别为0.001、0.007),但IgH重排和至少发生-个重排均无显著差异.结论 t(12;21)是儿童ALL常见的染色体易位,具有与TEL/AML1融合基因共存的亚克隆,该特点可作为微小残留病的辅助检测,值得在临床中推广使用.
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多重PCR检测基因抗原受体重排在儿童急性淋巴细胞白血病诊断中的应用
目的 建立多重PCR方法检测免疫球蛋白(Ig)和T细胞受体(TCR)基因重排,探讨在儿童急性淋巴细胞白血病诊断和鉴别中的作用.方法 参照BIOMED-2协作组制定的Ig和(或)TCR检测方法,对儿童ALL患儿114 例,分别检测患者骨髓单个核细胞的IgH、IgK、TCRG和TCRB基因重排.结果 在105例B系儿童ALL患者中,克隆重排的检出率分别为IgH 73%、IgK34%、TCRG 44%和TCRB 35%,所有B-ALL患者Ig基因重排检出率可达85%;在11例T系ALL患者中,克隆重排的检出率分别为TCRB 82%和TCRG 73%,T-ALL 患者TCR基因重排检出率可达100%.结论 BIOMED-2引物系统可以检测出绝大多数儿童ALL患者的Ig/TCR基因重排,是一种有效的检测工具,值得在临床中推广使用.
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IgH重排在B-细胞淋巴瘤诊断和治疗中的临床意义
恶性淋巴瘤是常见恶性肿瘤,其发病率有逐年升高趋势,非霍奇金淋巴瘤(NHL)组织学形态多样,形态学结合免疫组化仅能确诊70%～80%的病例,其余20%～30%常与反应性病变难以区分,通过分子检测对这些难以区分的病例有进一步的辅助诊断意义.
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以IgH bcl-2/IgH为分子标志检测B细胞淋巴瘤微小残留病研究进展
肿瘤的复发与停止治疗时患者体内仍存在用常规方法无法检测出的微小残留病(minimal residual disease,MRD)有关,关于MRD的研究已成为肿瘤研究领域的热点.B细胞所特有的基因重排等遗传学特征为我们提供了可用于检测B细胞淋巴瘤(B-NHL)MRD的分子标志,本文就这一方面的研究进展进行综述.
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TCR基因重排在皮肤T细胞淋巴瘤中的应用
T细胞在成熟过程中通过T细胞表面受体基因重排,从而具有特异性识别抗原的能力,在这一过程中的任何失调都会导致疾病.皮肤T细胞淋巴瘤是由于单个淋巴细胞的恶性增殖所导致的,病变组织表现出T细胞受体基因重排克隆性.蕈样肉样肿和Sézary综合征为常见的皮肤T细胞淋巴瘤.T细胞受体基因重排的检测在皮肤T细胞淋巴瘤的发病机制研究、分类、诊断、判断预后上有重要的作用.
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早期蕈样肉芽肿采用激光捕获显微切割及基因扫描分子诊断基因重排的研究
目的:研究激光捕获显微切割及基因扫描定性检测T细胞受体(TCR)_γ基因重排在早期蕈样肉芽肿(MF)细胞中表达的可行性.方法:激光捕获显微切割(laser capture microdissection,LCM)分离早期MF中的肿瘤细胞,荧光标记引物双重聚合酶链反应(PCR)和基因扫描(GeneScan)分析TCR _γ基因重排.结果:9例早期MF的TCR_γ/基因重排检出率为66.7%(6/9).2例肿瘤期MF的检出率为100%.结论:激光捕获显微切割技术可用于诊断早期MF的TCR_γ基凶重排检测.
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原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤T细胞γ受体、IgH基因重排
目的:探讨原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤(C-ALCL)临床病理特点和基因诊断方法.方法:对6例C-ALCL的临床表现、病理形态学和免疫组化染色进行观察,并用PCR方法对石蜡标本进行T细胞γ受体(TCRγ)和重链免疫球蛋白(IgH)基因重排检测.结果:临床起病以孤立性结节多见,病情进展缓慢,个别可自行消退.5例患者经治疗病情稳定,1例死于淋巴结及肝脏转移.镜下以75%以上CD30+间变性大细胞弥漫浸润真皮及皮下脂肪组织为特点,多数瘤细胞表达T细胞免疫表型.5例标本TCRγ基因重排阳性.结论:C-ALCL是少见的原发皮肤的低度恶性T细胞性淋巴瘤,预后较好.综合临床表现、组织病理改变、免疫组化及基因重排检测有助于本病的正确诊断.
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副银屑病皮损及外周血TCRγ基因重排的检测及其临床意义探讨
目的：检测副银屑病患者皮损及外周血TCRγ基因重排并探讨其临床意义。方法20例副银屑病患者，采用BIOMED?2多重PCR扩增体系检测其皮肤及外周血TCRγ链基因重排，分析TCRγ基因重排与患者一般资料、临床类型、组织病理表现（非特异表现和非典型表现）的相关性。结果20例副银屑病患者皮损中，7例TCRγ基因重排阳性。11例外周血TCRγ基因重排检测中3例阳性，其中2例皮损检测亦阳性。皮损及外周血TCRγ基因重排与患者性别、年龄、病程、临床类型均无关（P>0.05），而皮损TCRγ基因重排阳性与蕈样肉芽肿相关不典型表现有关（P<0.05）。20例患者平均随访（44.85±18.48）个月，1例进展为蕈样肉芽肿，2例痊愈。结论副银屑病患者皮损TCRγ基因重排阳性可能与蕈样肉芽肿相关不典型表现有关，结合组织病理不典型表现，提示有进展为蕈样肉芽肿的可能。
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T细胞受体γ引物组合检测蕈样肉芽肿基因重排的研究
目的 探讨BIOMED-2系统T细胞受体(TCR)γ引物组合在蕈样肉芽肿(MF)患者不同来源标本中TCRγ基因重排检测中的价值.方法 收集28例MF患者15份石蜡组织样本、14份新鲜皮损及18份全血组织样本,提取DNA,利用BIOMED-2系统TCRγ引物组合进行TCRγ基因重排检测,比较3组不同来源样本的检出率并进行统计学分析.用SPSS13.0软件进行统计分析.各组之间阳性率采用x2检验或Fisher确切概率法检验.结果 15份石蜡包埋组织标本3份TCRγ基因重排阳性,18份血液标本11份阳性,14份新鲜皮损标本12份阳性,3组之间阳性率差异有统计学意义(x2=13.047,P＜ 0.01),新鲜皮损TCRγ基因重排阳性率显著高于石蜡组织.201 1年的6例石蜡标本3份基因重排阳性,阳性率显著高于其余9例2011年之前的石蜡标本(Fisher精确概率法,P=0.044),与14例新鲜组织标本TCRγ基因重排阳性率(12/14)相比差异无统计学意义(Fisher精确概率法,P=0.131).血液标本TCRγ基因重排阳性率低于新鲜皮损,两组之间差异无统计学意义(x2=2.358,P＞0.05).结论 BIOMED-2系统TCRγ引物组合适用于检测MF患者不同组织样本的TCR基因重排,更适用于新鲜的组织标本.
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蕈样肉芽肿T细胞受体γ单克隆性基因重排研究
目的 探讨T细胞受体γ(TCR-γ)基因重排在蕈样肉芽肿(MF)诊断中的意义,寻找一种较为敏感的基因诊断方法.方法 以TCR-γ基因的Vγ8、Vγ9、Vγ10、Vγ11、Jγ1-2为引物,利用PCR-琼脂糖凝胶电泳方法检测共50份标本的基因重排情况,其中30例MF患者的皮损标本33份,淋巴结标本2份;15例炎症性皮肤病患者的15份皮损标本.结果 30例MF患者的33份皮肤标本,共有29份检测到TCR-γ基因单克隆性重排的条带,总阳性率为88%.15份炎症性疾病皮肤标本中,共有5份检测到TCR-γ基因单克隆性重排的条带,阳性率为33%.结论 TCR-γ基因重排检测可以应用于MF的诊断与鉴别诊断,但只能作为一种辅助诊断方法.
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毛囊黏蛋白沉积症与蕈样肉芽肿T细胞受体基因重排的对比研究
目的 研究毛囊黏蛋白沉积症与蕈样肉芽肿的关系.方法 从8例特发性毛囊黏蛋白沉积症、3例毛囊黏蛋白沉积症合并蕈样肉芽肿和1例蕈样肉芽肿患者获得病变组织,将其埋于石蜡中.设计T淋巴细胞受体(TCR)可变区引物Vγ1-8/A,Vγ10,Vγ11及β,利用PCR方法分析了12例患者组织中T淋巴细胞受体基因重排的情况.结果 8例特发性毛囊黏蛋白沉积症中1例,3例毛囊黏蛋白沉积症合并蕈样肉芽肿和1例蕈样肉芽肿患者皮损TCR Vγ1-8/A呈单克隆性.结论 对于年龄较大、病程较长的毛囊黏蛋白沉积症患者,应行TCRγ基因重排检查,以排除淋巴瘤.
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儿童皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤的研究
目的 探讨儿童皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤(SPTL)的临床病理、免疫表型、基因重排及EB病毒(EBV)感染情况.方法 将收集的5例儿童SPTL作临床病理和免疫组化分析,采用PCR检测TCRγ、IgH基因重排,运用EBER1/2原位杂交检测EBV感染.结果 男4例、女1例,年龄9～13岁,主要表现为无症状的结节、斑块或肿块.组织学上肿瘤在皮下脂肪内呈脂膜炎样浸润,细胞大小不等、异形性明显,瘤内可见豆袋细胞、上皮样肉芽肿和小片状坏死.瘤细胞表达T细胞标记βF1、CD2、CD3、CD8、CD45RO和细胞毒颗粒相关蛋白标记TIA-1、粒酶B,不表达CD4、CD20.4例检出单克隆性TCRγ基因重排,未检出IgH基因重排.EBER1/2原位杂交阳性2例.获随访的3例中1例死于本病,该例EBER1/2阳性.结论 儿童SPTL面部易受累,全身症状多见,噬血细胞综合征发生率与死亡率较高.伴有EBV感染者可能预后较差.
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伴发Castleman病的副肿瘤性天疱疮发病机制研究
目的研究Castleman病在副肿瘤性天疱疮患者(PNP)发病机制中的作用.方法肿瘤组织常规免疫组化染色.RT-PCR扩增6例患者肿瘤组织中RNA,将PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳及克降测序;并以原位杂交法与6例无皮肤黏膜损害的Castleman病和3例淋巴结反应性增生患者肿瘤B细胞克降相比较.以RNA印迹法了解重排基因的表达情况.结果6例PNP患者RT-PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳皆获得1条约124 bp的锐利条带;克隆测序得到2种高度同源的序列,分别为128 bp,122 bp,其中6例患者皆具有长序列,4例患者同时还有相同短序列.以128 bp的重排基因为探针进行原位杂交,阳性信号仅见于PNP患者肿瘤组织切片的淋巴滤泡样结构中;RNA印迹示该探针与6例PNP患者肿瘤组织mRNA皆有较强的杂交信号.结论6例PNP患者肿瘤组织中主要B细胞克隆是相同的.这种B细胞克隆的免疫球蛋白重排基因在肿瘤组织中有丰富表达,所产生的免疫球蛋白可能直接与皮肤中的抗原发生作用,引起皮肤黏膜的免疫损伤.
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18F-FDG PET/CT结合C-MYC基因重排在弥漫性大B细胞淋巴瘤化疗中判断预后的价值
目的 分析弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL) PET/CT显像大摄取值变化率(△SUVmax％)和C-MYC基因对DLBCL化疗后预后的判断价值,寻找合适的PET/CT检查时间.方法 2010年9月至2016年2月间171例病理证实的DLBCL患者[男87例,女84例,平均年龄(50.66±2.56)岁],包括化疗早期(1、2周期,60例)、化疗中期(3、4周期,55例)及化疗后期(5、6周期,56例)显像组.于化疗前1周及相应化疗周期结束后17～ 21 d行18F-脱氧葡萄糖(FDG) PET/CT显像,勾画感兴趣区,计算△SUVmax％[(SUVmax前-SUVmax后)/SUVmax前×100％],采用Deauville五分法对患者评分,采用原位荧光杂交(FISH)检测C-MYC基因.随访6～71个月,计算无进展生存(PFS)期.采用x2检验、Spearman相关、单因素方差分析及Kaplan-Meier法分析数据.结果 171例DLBCL中42例C-MYC基因重排,有或无C-MYC基因重排患者在年龄、Ann Arbor分期、国际预后指数(IPI)评分、血清乳酸脱氢酶(LDH)水平及治疗反应方面差异有统计学意义(x2值:6.139～98.339,均P＜0.05).化疗早、中、后期显像组△SUVmax％佳界值分别为62.5％、87.0％和92.0％,按≥界值和＜界值各分为2组,组间PFS差异均有统计学意义(x2值:21.983 ～33.674,均P＜0.001);C-MYC基因重排阳性患者的PFS明显差于阴性患者(x2值:53.649～61.899,均P＜0.001).△SUVmax％与C-MYC基因重排间呈负相关(rs=-0.801,P＜0.001).化疗早期、中期、后期显像组间△SUVmax％差异有统计学意义(F=6.509,P＜0.01),Deauville评分结果差异有统计学意义(F=19.897,P＜0.001);但化疗中期显像与后期显像间2个指标差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 不同化疗周期△SUVmax％和C-MYC基因重排对DLBCL均有预测价值,化疗中行PET/CT检查早选择在化疗1周期结束时,晚选择在化疗4周期结束时.
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克隆性基因重排检测BIOMED-2系统中内对照体系的改进
目的 监测克隆性基因重排各检测管中PCR反应体系的完整性及反应条件的稳定性,避免基因重排的假阴性结果.方法 利用多重PCR方法,检测免疫球蛋白(Ig)中IgH-FR1、IgH-FR2、IgH-FR3、IgK-VJ、IgK-V/i克隆性基因重排和T细胞受体(TCR)中TCRβ-VJ1、TCRβ-VJ2、TCRβ-DJ、TCRγ-VJ1和TCRγ-VJ2克隆性基因重排.①选择GC100和GC300作为管内对照,在各反应管中加入适当的内对照引物,浓度分别为0.625 μmol/L、1.25 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L,PCR扩增后行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),分析结果.②根据①的实验结果,在各反应管中加入适浓度内对照,以制备好的突变浓度为20%、10%、7.5%、5%、2.5%的基因重排样本为模板,PCR扩增后行PAGE,分析结果.结果 克隆性重排检测引物工作液浓度均为10 μmol/L;检测IgH-FR1、IgH-FR2、IgK-VJ、IgK-V/i、TCRβ-VJ1、TCRβ-VJ2、TCRβ-DJ和TCRγ-VJ1各管中,加入管内对照基因的扩增片段大小均为100 bp,引物浓度均为5 μmol/L;检测IgH-FR3管中,管内对照基因的扩增片段大小为300 bp,引物浓度为5 μmol/L;检测TCRγ-VJ2管中,管内对照基因的扩增片段大小为300 bp,引物浓度为1.25 μmol/L.改进后体系检测敏感度在2.5%~5.0%之间.结论 在BIOMED-2系统中增加合适的管内对照,能够监测每个检测管中PCR反应体系的完整性及反应条件的稳定性.
