首页 > 文献资料
-
蛋白质组学在附睾研究中的应用
蛋白质组学是在后基因组时代出现的一个新的研究领域,它从整体水平对蛋白质的表达和功能模式进行分析.附睾是精子成熟和贮存的场所,因其基因表达呈现出高度的区域特异性,可能成为蛋白质组学,尤其是差异蛋白质组学研究的一个理想模型.本文主要对不同物种的附睾蛋白质组以及附睾不同区域的差异表达蛋白的研究进展予以综述,期望为附睾功能研究及开发新型男性避孕药带来新的思路和方法.
-
激光捕获显微切割技术新进展
激光捕获显微切割是一种先进的分离特定同质细胞群进行进一步研究的技术,尤其是在需要研究的细胞占样本细胞数很少时,以及需研究的细胞呈散在分布时,激光捕获显微切割的重要性尤为明显.与免疫组织化学、原位杂交技术、高通量基因分析、蛋白分析技术结合,显微切割技术显示出良好的发展前景.本文简述激光捕获显微切割的基本原理、应用以及可能的发展趋势.
-
应用激光捕获显微切割技术分离肝癌石蜡组织标本中细菌及螺杆菌基因的检测
目的对肝癌石蜡组织标本病理切片中发现的细菌进行分离鉴定. 方法 38例肝癌石蜡组织标本经聚合酶链反应(PCR)扩增螺杆菌16S rRNA,阳性标本病理切片后行石炭酸-碱性品红染色观察幽门螺杆菌(H.pylori),应用激光捕获显微切割技术(LCM)分离光镜下观察到的细菌,分离的细菌经PCR扩增螺杆菌16S rRNA,PCR产物进行测序及同源比较,阳性者再扩增H.pylori的特异基因[相对分子质量(Mr)为26×103蛋白,H.pylori种特异抗原]和相关功能基因(cagA, vacA). 结果15例肝癌石蜡组织标本中检测到螺杆菌16S rRNA,选取观察到细菌数量较多的6例用于LCM分离.分离的6例细菌样本均扩增出螺杆菌16S rRNA,经测序与H.pylori有99%～100%的同源性.4例Mr为26×103蛋白基因阳性,1例扩增出cagA基因,未扩增出vacA基因. 结论肝癌石蜡组织中经PCR检测到的H.pylori就是病理观察到的细菌.
-
SELDI-TOF-MS联合LCM技术筛选大肠癌肝转移早期诊断标志蛋白
目的:应用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱蛋白质芯片(SELDI-TOF-MS)联合激光显微切割(LCM)技术筛选大肠癌及其肝转移标志蛋白.方法:采用LCM技术获取24例大肠癌肝转移患者正常大肠、原发灶及肝转移灶癌细胞；应用SELDI-TOF-MS技术对其行蛋白质谱分析；采用Biomarker Wizard软件分析差异蛋白；通过查询蛋白库对特定分子质量所对应的标志蛋白进行初步确定.结果:比较3组细胞间的SELDI质谱图,发现大肠癌原发灶与正常大肠两组间存在15个标志蛋白,12个表达上调,3个表达下调；大肠癌肝转移灶与原发灶两组间存在9个标志蛋白,5个表达上调,4个表达下调.其中质荷比4 676.63Da,11 740.87 Da,21 063.59 Da和22 783.36Da,蛋白峰差异性明显(P＜0.01).通过查询ExPasy蛋白库筛选出20个差异蛋白,包括整合膜蛋白2C、DNA修复蛋白RAD51同系物4、细胞周期检查点蛋白RAD1、人附睾蛋白4、着丝粒蛋白R、Pleckstrin同源结构域家族成员3等.其中细胞凋亡调节Bax蛋白γ亚型、蛋白质S100A11(Protein S100-All)、Raf激酶抑制蛋白(RKIP)和热休克蛋白27(HSP-27)在正常大肠、原发灶及肝转移灶癌细胞中均呈差异性表达,并且差异性明显(P＜0.01).结论:SELDI蛋白质芯片联合LCM技术有可能筛选出敏感性高、特异性强的大肠癌标志蛋白,筛选出的差异蛋白可能是大肠癌及其肝转移特异性生物标志物.
关键词： SELDI-TOF-MS 激光捕获显微切割 大肠癌 肝转移 蛋白质组学 -
激光捕获显微切割技术应用于子宫内膜癌相关基因的研究
目的:摸索一条可行的技术路线,运用激光捕获显微切割技术(laser capture microdissection,LCM)获取无间质混杂的人正常子宫内膜腺管上皮细胞与子宫内膜癌细胞,用于进行子宫内膜癌相关基因差异表达的研究.方法:采用LCM技术分别从正常子宫内膜组织及子宫内膜癌组织冰冻切片中捕获子宫内膜腺管上皮细胞及子宫内膜癌细胞,提取微量RNA,并对微量RNA进行纯化及浓缩,用RT-PCR验证捕获细胞RNA中β-actin基因表达水平.结果:分别从冰冻切片中捕获子宫内膜腺管上皮细胞及子宫内膜癌细胞各50 000 Shootings.对照实验Ⅰ、Ⅱ证实经LCM后RNA完整性较好.确定了LCM Shooting次数与可获得RNA量间对应关系.捕获细胞所提取的RNA中β-actin基因表达完整.结论:通过LCM技术可以从冰冻切片中捕获单一类型的目的细胞,此过程不会造成细胞RNA明显降解,可以应用于下游的实验研究.
关键词： 激光捕获显微切割 RT-PCR 子宫内膜腺管上皮细胞 子宫内膜癌细胞 -
人乳头瘤病毒与子宫颈腺癌病因关系研究
目的：分析人乳头瘤病毒（ HPV）阳性的子宫颈腺癌组织经显微切割后HPV型别的分布状况。方法收集2005—2010年全国7个不同地区9所三级甲等医院诊断为宫颈腺癌的病理组织，进行三明治切片，对全蜡卷和显微切割后的病灶组织进行HPV分型检测，采用HE 染色和免疫组化进行病理诊断。结果 HPV阳性的宫颈腺癌标本169例，其中颈管型腺癌94例，腺鳞癌9例，微小偏离型腺癌19例，透明细胞腺癌14例，宫内膜样型腺癌8例，浆液性腺癌9例，未分型腺癌16例。全蜡卷共检测了14种高危型HPV型别，感染率高为HPV16，其次为HPV18和HPV52。与全蜡卷比较，显微切割后HPV阳性率有不同程度降低，不同病理类型宫颈腺癌显微切割后HPV阳性率差异有统计学意义（P＜0．001）。单一感染和多重感染显微切割后HPV阳性率分别为50．8％和66．7％，差异无统计学意义（P＝0．14）。不同病理类型宫颈腺癌组织中p16的阳性率差异有统计学意义（P＜0．001）。显微切割后HPV阳性和阴性患者的p16阳性率分别为73．9％和38．5％，差异有统计学意义（ P＜0．001）。结论显微切割技术能够更精确地了解和评价宫颈腺癌中的HPV感染及分布状况，宫颈腺癌的发生与HPV感染的关系不是十分密切。
-
激光捕获显微切割及基因芯片技术构建喉鳞状细胞癌全基因组表达谱
目的 通过全基因组寡核苷酸基因芯片构建喉部纯化组织基因表达谱,筛选与喉癌相关的候选靶基因.方法 采用RNA保护技术保护组织标本,激光捕获显微切割纯化分离8例声门型喉癌标本中癌细胞及其相对应的癌旁相对正常的黏膜上皮细胞,结合HG U133.Plus2.0芯片技术,构建16例喉部纯化组织标本全基因组表达谱,筛选出喉癌相关靶基因;选择部分特异性的候选靶基因通过荧光定量PCR在mRNA水平检测基因的表达情况.结果 对16例喉部纯化组织基因组表达谱进行统计学处理及聚类分析,筛选出与喉癌发病相关的候选靶基因2351个;假阳性率为0.63%.对特异性候选基因MMP12、KRT16、RARB、PRB1 mRNA的荧光RT-PCR检测结果与基因表达谱的结果具有一致性.结论 利用全基因组基因芯片构建基因表达谱,可准确、高效地筛选出喉癌相关的候选靶基因,为寻找喉癌临床早期诊断的分子标记物及喉癌潜在的药物作用靶分子奠定坚实的理论基础.
-
口腔鳞癌浸润前沿、中心和癌间质TP53、RPS6基因变化的研究
目的 检测微卫星位点TP53、RPS6在口腔鳞癌浸润前沿、中心及癌间质细胞中的基因变化,揭示口腔鳞癌的生物学行为.方法 运用激光捕获显微切割分别获取同一肿瘤浸润前沿、中心及癌间质足量的细胞,提取DNA,PCR-变性PAGE电泳检测TP53和RPS6位点的基因变化.结果 浸润前沿、中心和癌间质中TP53和RPS6存在杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)和微卫星不稳定(microsatellite instability,MI),发生率从23.5%(4/17)到64.7%(11/17),且LOH和(或)MI的模式存在不同.上皮TP53和RPS6的LOH和MI发生率分别为70.6%(12/17)和64.7%(11/17),间质为43.8%(7/16)和23.5%(4/17),癌实质较间质发生率高,差异有统计学意义(P＜0.05).浸润前沿TP53的LOH发生率为64.7%(11/17),中心为60.0%(9/15).RPS6在浸润前沿的LOH和MI为58.8%(10/17),中心为29.4%(5/17).两位点总发生率分别为62.5%(20/32)和44.1%(15/34),差异有统计学意义(P＜0.05).结论 部分口腔鳞癌样本浸润前沿、中心和肿瘤间质的基因变化不同,癌实质基因变化率与肿瘤分化程度有关.
-
应用单细胞cDNA扩增技术鉴定循环肿瘤细胞
目的 建立单细胞cDNA扩增技术,实现在分子水平鉴定循环肿瘤细胞.方法 建立结肠癌循环肿瘤细胞模型,通过免疫荧光染色和显微切割技术分离出单个血细胞和肿瘤细胞;裂解细胞后利用碱基修饰的P1(dT)24引物反转录出cDNA第一链,并给第一链cDNA加上PolyA尾后利用碱基修饰的P2(dT)24引物合成第二链cDNA,然后利用P1(dT)24和P2(dT)24引物扩增分别得到血细胞和肿瘤细胞的全长cDNA;后通过PCR检测细胞特异的标记物CD45、EpCAM和CK19.结果 改良后的单细胞cDNA扩增方法能够获得高质量的全长cDNA,并能显著增加PCR检测效率;利用扩增得到的cDNA通过PCR检测细胞表面标记物CD45、EpCAM和CK19的表达,能有效鉴定出外周血中混杂的肿瘤细胞.结论 通过单细胞cDNA扩增技术在基因水平识别肿瘤细胞,建立了一种新的循环肿瘤细胞的鉴定方法.
关键词： 单细胞cDNA扩增技术 循环肿瘤细胞 激光捕获显微切割 聚合酶链式反应 -
基因芯片联合激光捕获显微切割技术在脊髓背根神经节基因表达研究中的应用
目的 探索联合激光捕获显微切割(laser capture microdissection,LCM) 与基因芯片技术在大鼠脊髓背根神经节的感觉神经元基因表达研究中的可行性.方法 取大鼠L4、L5、L6节段脊髓背根神经节,用LCM技术获取神经细胞,提取总RNA,甲醛变性凝胶电泳鉴定RNA质量,检测纯度和产量,并以实时RT-PCR方法进行验证.结果 总RNA的完整性较好,经单轮T7线性扩增后得到足量的 aRNA,可用于实时RT-PCR研究和进一步基因芯片杂交实验.结论 结合有效的RNA保护方法和线性扩增,LCM可以分离出纯净的背根神经节的感觉神经元,满足下游基因芯片研究的要求.
-
核苷类似物对小鼠皮层神经元线粒体DNAD-loop区突变的影响
目的 探讨长期使用核苷类似物是否产生皮层神经元线粒体DNA D-loop区损伤.方法 7周龄Balb/C小鼠50只,分为5组(对照组和4个实验组),每组10只.对照组腹腔内注射双蒸水,实验组腹腔内分别注射司他夫定(D4T)50 mg/kg、齐多夫定(AZT) 100 mg/kg、拉米夫定(3TC) 50 mg/kg和去羟肌苷(DDI) 50 mg/kg,每周5次,连续6周.应用激光捕获显微切割技术捕捉小鼠大脑皮层神经元,对其线粒体D-loop区PCR扩增子克隆和测序.结果 与对照组相比,实验组小鼠神经元线粒体D-loop区序列突变增加,与参考序列的平均距离,AZT组为0.0021,D4T组为0.0047,3TC组为0.0024和DDI组为0.0053,对照组为0.0012.D4T组和DDI组的核苷酸距离明显高于对照组(P＜0.001).D-loop序列单碱基的转换率AZT组为0.0018,D4T组为0.0033,3TC组为0.0021,DDI组为0.0037,显著高于对照组(P＜ 0.001).4种核苷类似物诱导的D-loop区序列点突变主要类型是转换,特别是"A→G"和"T→C"的转换.结论 长期暴露于核苷类似物可导致小鼠皮层神经元线粒体DNA D-loop区实变.
-
激光捕获显微切割技术在肿瘤研究中的作用
探索近年发展起来的激光捕获显微切割(laser capture microdissection,LCM)技术形成及发展在肿瘤研完的应用、存在的问题及应用前景.
-
大肠癌肝转移相关的间质差异表达基因的筛选
目的 联合应用激光捕获显微切割和基因芯片技术,构建伴有肝转移的大肠癌原发灶间质组织和不伴肝转移的大肠癌间质组织基因表达谱,从间质中筛选与大肠癌肝转移相关的基因.方法 分别对上海市第六人民医院于2008年7月至2010年7月收集的4例伴有肝转移的大肠癌原发灶组织和4例不伴肝转移的大肠癌组织行激光捕获显微切割,获取各自的间质组织.提取微量RNA,结合安捷伦人全基因组表达谱芯片(4×44 K 2.0)技术,构建8例间质组织标本全基因组表达谱,筛选出大肠癌肝转移间质相关基因;选择显著上调及下调的前2位基因行实时定量PCR验证.结果 在4对新鲜标本的芯片杂交检测中共筛选出1948条基因发生差异表达,其中上调的有1266条,下调的有682条.对骨膜蛋白(Periostin)/胰岛素样生长因子2(IGF-2)/过氧化物酶体增殖活化受体γ共激活因子(PGC-1)/趋化因子配体21(CCL21)这4个基因的实时定量PCR检测结果与基因芯片筛选的检测结果基本一致.结论 联合应用激光捕获显微切割和基因芯片技术成功筛选出大肠癌肝转移间质相关基因,为寻找大肠癌肝转移临床早期诊断的分子标志物和靶向治疗提供坚实的理论基础.
-
激光捕获显微切割技术结合iTRAQ标记定量蛋白质组在结肠癌筛查中的应用研究
目的 采用激光捕获显微切割技术(LCM)结合iTRAQ标记定量蛋白质组技术,筛查结肠癌间质的差异表达蛋白质.方法 ①选择12对结肠腺癌标本为观察组,其配对正常结肠黏膜(与结肠癌标本至少相距10 cm以上)为对照组,采用LCM技术分别纯化其间质作为生物样本;②iTRAQ标记定量蛋白质组技术鉴定两组间的差异表达蛋白质;③采用Geneontology生物信息学软件(http://pantherdb.org/)对差异表达蛋白质进行细胞成分、生物学途径和分子功能分析.结果 ①鉴定了70个差异表达蛋白,其中37个蛋白在结肠癌间质中高表达,33个蛋白在结肠癌间质中表达降低;②从生物学途径、细胞成分、分子功能三个方面对差异表达蛋白质进行分析.结论 ①首次采用iTRAQ标记定量蛋白质组学和LCM结合的方法筛查结肠癌间质差异表达蛋白质;②GO功能分析显示了差异表达蛋白质的细胞成分、分子功能以及生物学功能.
关键词： 结肠癌 间质 激光捕获显微切割 iTRAQ标记定量蛋白组学 生物信息学 -
用激光捕获显微切割联合蛋白质芯片筛选肺鳞癌和腺癌组织差异蛋白
目的 应用激光捕获显微切割(LCM)联合表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)蛋白质芯片及支持向量机(SVM)方法筛选肺鳞癌和腺癌差异表达蛋白质,探讨二者在蛋白水平的差异,为筛选肺癌分型标志物提供依据.方法 将6例新鲜肺鳞癌及7例腺癌组织标本用LCM选择性获取1.4×105个同质鳞癌细胞和1.2×105个同质腺癌细胞.经PBS Ⅱ+型SELDI-TOF-MS分析仪(IMAC芯片)分析鳞癌及腺癌细胞蛋白质表达谱,比对差异峰;应用SVM筛选并验证候选标志蛋白的判别效能.结果 比较鳞癌和腺癌细胞的SELDI谱图,共筛选出87个蛋白峰.将差异明显的10个蛋白峰作为候选标志蛋白.与腺癌相比,4种蛋白(相对分子质量分别为2505、4004、4847及11 412)在鳞癌中呈高表达;与鳞癌相比,6种蛋白(相对分子质量分别为3333、3592、3848、5036、5191及5211)在腺癌中呈高表达.其中相对分子质量为4847的蛋白在鳞癌和腺癌中表达差异有统计学意义.用SVM建立分类预测模型并评价各模型效能,筛选出一个由3种蛋白质(相对分子质量分别为4847、11 412和3592)组成的分型标志蛋白组合模式,其敏感度和特异度均为100%.结论 肺鳞癌和腺癌在蛋白水平存在差异;LCM联合SELDI蛋白质芯片技术有可能筛选出敏感性高、特异性强的肺癌分型标志蛋白组合模式.
-
蛋白质组学的相关技术研究进展
目前,生物学研究已进人后基因组时代,一个以"蛋白质组"为研究重点的生命科学新时代已悄然到来.近年来,蛋白质组技术发展迅速,激光捕获微切割、蛋白质芯片、同位素包被亲和标记等新技术,促进了蛋白质组学的发展.综述了近年蛋白质组学相关新技术的进展及其应用情况.
-
激光捕获显微切割技术在肿瘤研究中的进展
激光捕获显微切割技术(LCM,Laser Capture Microdissection)是目前先进的组织纯化技术,LCM结合各种基于细胞、DNA、RNA、及蛋白质的分子生物学技术成功运用于肿瘤学研究的各个方面,通过对切割后细胞的基因组,转录组,蛋白组等分析研究后得到了大量有用的结论.本文就其在肿瘤学研究中的应用进行综述.
-
激光捕获显微切割结合定量PCR检测NES1 mRNA在胃癌中的表达及其甲基化状态
目的:探讨正常上皮细胞特异性-1基因(NES1)在正常胃组织及胃癌组织中的表达和受甲基化调控的影响.方法:利用激光捕获显微切割(laser capture microdissection,LCM)技术分离胃癌患者活检组织中的癌细胞和正常上皮细胞,采用荧光定量PCR检测其中NES1 mRNA的表达,甲基化特异性PCR观察NES1基因外显子3 CpG岛甲基化状态.结果:荧光定量PCR结果显示,NES1 mRNA在胃癌细胞中的表达明显低于正常胃上皮细胞(P＜0.05).甲基化特异性PCR检测胃癌组织癌细胞中NES1外显子3 CpG岛甲基化状态发现,大部分肿瘤患者NES1外显子3 CpG岛均存在不同程度甲基化,其中完全甲基化7例(33.3%),不完全甲基化12例(57.14%);而正常细胞中存在不完全甲基化仅为1例(5%),其余19例均不存在甲基化(95%).结论:激光显微切割结合荧光定量PCR技术可较精确地检测NES1在胃癌组织细胞和正常组织细胞中的表达.NES1在胃癌中表达降低,其表达降低与NES1基因外显子3甲基化有关.
-
激光捕获显微切割技术在胃肠道肿瘤研究中的应用
激光捕获显微切割(IJCM)技术是一种在显微镜直视下,通过激光捕获和切割从异质性组织中获得纯净目的细胞群或单个细胞的技术.该技术既解决了组织异质性问题,又不脱离体内环境,是连接病理学与分子生物学研究不可或缺的桥梁.我国是胃癌高发地区,近年来结直肠癌的发病率亦逐渐升高.为此,本文对LCM的操作步骤及其与多种技术结合,在胃肠道肿瘤研究中的应用作一综述.
-
激光显微切割结合蛋白质组学技术分析DDAH-1在肝细胞癌表达的变化
目的:应用激光显微切割(laser capture microdissection,LCM)结合蛋白组学技术筛查肝细胞癌(hepatocellular carcinoma ,HCC)组织及其癌旁组织的差异表达蛋白,分析二甲基精氨酸二甲胺水解酶1(dimethylarginine dimethylaminohydrolase 1,DDAH-1)在肝细胞癌表达的变化. 方法:选取2003-2006年间东方肝胆外科医院原发性肝细胞癌患者的手术切除标本40例.利用LCM技术分离捕获肝癌组织及癌旁组织的肝实质细胞,应用二维凝胶电泳技术(two dimensional gel electrophoresis,2-DE)筛选全部标本共同差异表达频率>80%、差异强度>3倍的蛋白质点;应用电喷雾串联质谱(electrospray ionisation tandem mass spectrometry,ESI-MS/MS)及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)对差异蛋白点进行质谱鉴定分析;采用Western blotting及免疫组化对差异蛋白DDAH-1进行检测. 结果:2-DE筛查获得在肝癌及癌旁组织差异表达的蛋白质点共20个,通过质谱鉴定获得12个蛋白质,其中5个在肝癌组织表达上调,7个下调;这12个蛋白质与细胞代谢、增殖、分化及信号调控相关,其中的DDAH-1是参与调控一氧化氮相关通路的重要酶.Western blotting检测显示,20例标本中16例DDAH-1表达明显升高;免疫组化检测证实,10例标本DDAH-1全部呈强阳性表达. 结论:肝细胞癌组织细胞中筛查到12个差异表达蛋白质,其中的DDAH-1在肝癌组织中表达上调,其有可能在肝癌发生、发展过程中起重要作用.
关键词： 肝细胞癌 激光捕获显微切割 蛋白质组学 差异表达蛋白 二甲基精氨酸二甲胺水解酶1
