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基因重排检测技术的建立及其在淋巴瘤诊断中的应用
目的:建立基于克隆性分析技术的B和T淋巴细胞产生的抗原受体分子基因重排检测技术,探讨B淋巴细胞免疫球蛋白及T淋巴细胞受体基因重排在恶性淋巴瘤临床诊断中的应用. 方法: 从组织蜡块中切取组织片5～10张,提取基因组DNA,PCR扩增,聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染显示基因重排结果. 结果:20例良性淋巴组织反应性增生病例中, 淋巴细胞IgH及TCR基因重排均为阴性;18例T细胞非何杰金氏淋巴瘤中TCRγ基因重排12例, TCRβ基因重排3例,未见有IgH基因重排;32例B细胞性非何杰金氏淋巴瘤标本中有28例IgH基因重排阳性,有2例TCRγ和IgH基因重排均阳性;3例未确诊的疑难病例均为IgH基因重排;IgH及TCR基因重排检出率在淋巴瘤组与良性组之间,差异有显著意义(P<0.05). 结论:应用PCR法检测B淋巴细胞IgH和T淋巴细胞TCR基因重排可作为淋巴细胞来源的良、恶性病变的一种辅助诊断手段,且适用于石蜡标本以进行回顾性研究.
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弥漫性大B细胞淋巴瘤bcl-2/IgH基因重排与GCB分子亚型的相关性
目的: 探讨弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)bcl-2/IgH基因重排与分子亚型生发中心样(GCB)的相关性.方法:采用自行设计的半巢式PCR对60例DLBCL的bcl-2/IgH基因重排进行了检测,并对阳性产物进行克隆、测序.同时采用免疫组化SP法在组织微阵列上同步观测CD20,CD10,Bcl-6,黑色素瘤相关抗原(突变体)1 (MUM1)的表达,进行GCB和非生发中心样(non-GCB)分子分类.结果: 经常规法扩增bcl-2/IgH,有6/60例DLBCL bcl-2/IgH阳性;在6例阳性样本中,采用本组设计的半巢式PCR扩增,经克隆及测序证实5例bcl-2/IgH基因重排阳性,1例为人类第19号染色体BAC 331191基因的片段.60例DLBCL CD20表达全部阳性;CD10,Bcl-6, MUM1的阳性表达率分别为43.3%,46.7%,61.7%;GCB 32(53.3%)例,non-GCB 28(46.7%)例.bcl-2/IgH基因重排阳性的病例均属GCB分子亚型, 且与CD10表达有显著性相关(P=0.012),而与Bcl-6及MUM1表达无相关性.结论:使用本组设计的半巢式PCR可提高bcl-2/IgH基因重排检测的准确性.bcl-2/IgH基因重排的检测可协助确定部分GCB分子亚型的DLBCL.
关键词： 弥漫性大B细胞淋巴瘤 Bcl-2 基因重排 -
基因重排检测技术诊断脾脏淋巴瘤
目的:利用B和T淋巴细胞产生的抗原受体分子基因重排检测技术,探讨1例原发性脾脏恶性淋巴瘤(PLS)基因重排检测结果.方法:从组织蜡块中切取组织片5～10张,提取基因组DNA,PCR扩增,聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染显示基因重排结果.结果:脾脏淋巴瘤免疫组化证实为B细胞性滤泡性淋巴瘤.从24个不同部位取得的组织经PCR均扩增成功,所有部位组织T细胞受体基因重排阴性,22个部位组织B细胞单克隆性免疫球蛋白基因重排阳性,基因重排阳性率91.7%.结论:应用PCR法检测B淋巴细胞IgH和T淋巴细胞TCR基因重排可作为淋巴细胞来源的良、恶性病变的一种辅助诊断手段,对脾脏淋巴瘤有较高的诊断价值.
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鼠疫菌基因组与脉冲场电泳图型
目的 利用PFGE图形来了解鼠疫菌基因组重排现象.方法 PFGE分析并与全基因组序列进行比较.结果 计算PFGE各条带大小可初步判断鼠疫菌基因组序列重排结构.结论 利用PFGE图型来判断鼠疫菌基因组序列重排结构,可以大大节约测序所需花费的成本.
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hBMP-7基因重组腺相关病毒载体的构建及人牙髓细胞转染的研究
目的:构建人骨形成蛋白-7(hBMP-7)基因重组腺相关病毒载体,并转染牙髓细胞,为牙组织损伤修复的基因治疗做探索性研究.方法:以含hBMP-7全长cDNA的载体PTcDNA-hBMP-7为模板进行PCR扩增,将回收产物和pAAVIRES-hrGFP分别双酶切后连接、转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,获得重组质粒pAAVIRES-hrGFP-hBMP-7.采用磷酸钙共沉淀法转染293细胞进行病毒包装,收获的病毒液按氯仿处理、PEG/NaCl沉淀、酚:氯仿反复抽提法浓缩纯化,斑点杂交法测病毒滴度,并转染体外培养的牙髓细胞.结果:酶切鉴定和测序结果表明,hBMP-7基因成功克隆入pAAVIRES-hrGFP载体中.在293细胞中包装出重组腺相关病毒载体rAAVIRES-hBMP-7,物理滴度为3.0×1011 v.g/ml.rAAV转染牙髓细胞后GFP表达逐渐增强,可持续表达到4周以后.结论:重组腺相关病毒载体rAAVIRES-hBMP-7,能有效转染牙髓细胞表达目的基因.可用于牙组织工程基因治疗的研究.
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脑室镜加溶凝治疗脑室内出血60例临床分析
目的: 研究脑室镜用于脑室内出血(IVH)病人中的治疗效果.方法: 选择60例IVH病人,随机分为实验组30例,采用脑室镜清除血肿加基因重组链激酶(r-SK)溶凝治疗;对照组30例,采用常规侧脑室外引流加尿激酶(UK)灌洗.两组分别进行CT显示血肿清除情况对比,按临床治疗时间、并发症及神经功能缺损评分标准进行疗效判断.结果: 实验组脑室镜清除血肿均达80%以上,明显高于对照组;剩余血肿用r-SK排除血肿,治疗效果明显好于对照组.结论: 采用脑室镜清除脑室内血肿加r-SK局部溶凝引流治疗IVH能减少并发症、缩短病程、提高患者的生存质量.
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弥漫大B细胞淋巴瘤BCL-2、BCL-6基因重排特点及预后分析
目的 探讨宁夏地区弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)中BCL-2、BCL-6基因重排特点,了解DLBCL的临床特征及对预后影响因素.方法 选择确诊并临床资料完整的DLBCL患者,将DLBCL分为生发中心B细胞型(GCB)和非生发中心B细胞型(non-GCB),应用荧光原位杂交(FISH)技术检测BCL-2、BCL-6基因重排情况;同时,构建Kaplan-Meier生存曲线,采用Cox模型对有统计学意义的参数进行多因素回归分析.结果 临床资料完整的DLBCL患者59例,其中男性34例,女性25例;中位年龄54岁(26～ 81岁),＞60岁26例;GCB组20例,non-GCB组39例.发生BCL-2基因易位2例,BCL-6基因断裂15例;出现B症状31例,血清LDH升高29例;临床分期Ⅰ～Ⅱ期30例,Ⅲ～Ⅳ期29例;IPI评分≥3分25例,ECOG评分＞2分25例;结外受累＞1个病灶25例.中位随访时间22.71个月,中位总生存期33.36个月;随访期间死亡30例,总死亡率50.8％,5年死亡率56.91％,5年生存率69.78％.结论 FISH技术可以提高淋巴瘤诊断分型的准确性,是淋巴瘤分子诊断的有效手段.宁夏地区患者中,发生BCL-2基因重排的病例预后不良,BCL-6基因重排与预后无相关性;患者GCB分组、年龄(＞60岁)、临床分期、IPI评分,均与预后存在相关性.
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眼附属器淋巴组织增生性病变基因重排分析
目的 探讨眼附属器淋巴组织增生性病变的免疫球蛋白重链(IgH)基因重排特点及应用价值.方法 收集22例眼附属器淋巴组织增生性病变,其中淋巴瘤8例,非典型淋巴组织增生病变6例,反应性增生的淋巴组织8例.运用标准试剂盒提取DNA,采用半巢氏PCR技术、2对引物进行IgH基因重排检测,同时运用免疫组化2步法标记抗体(LCA,CD3 CD20,CD79a,CD45RA,CD45RO,Bcl-2等).结果 6例非典型淋巴组织增生性病变中IgH基因单克隆重排4例阳性(67%),8例淋巴瘤中IgH基因单克隆重排8例阳性(100%),反应性增生的淋巴组织基因重排阴性.所有12例病例均经免疫组织化学染色,全部为非霍奇金B细胞淋巴瘤,其中黏膜相关淋巴组织结外边缘区淋巴瘤(MALT)B细胞淋巴瘤8例,弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)2例,滤泡性淋巴瘤(FL)1例,淋巴浆细胞淋巴瘤(LPL)1例.结论 基因重排检测是眼附属器疑难淋巴组织增生性病变和淋巴瘤鉴别诊断的有效方法,可以有效地提高诊断的准确率.
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重组HIV-1跨膜蛋白gp41在大肠杆菌中的表达
①目的构建重组HIV-1SF2株跨膜蛋白gp41基因片段的原核表达克隆并在大肠杆菌中表达.②方法通过聚合酶链反应(PCR)扩增目的基因,然后用限制性内切酶将其与原核表达载体pMAL-p2定向连接,构建成重组质粒转入大肠杆菌DH5α菌中.经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析有无重组蛋白表达.③结果获得了重组的原核表达质粒及其表达产物.④结论在pMAL-p2中构建的HIV-lgp41重组质粒可在大肠杆菌中表达.
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基因重组人生长激素在儿科的临床应用
生长激素(GH)是垂体前叶分泌的一种肽类激素,主要作用是促进人体生长.1958年首次应用来自人垂体的GH(phGH)治疗儿童垂体性侏儒症,取得初步疗效.1984年报道首例Creutzfeldt-Jacob病(CJD,痉挛性假性硬化),怀疑与phGH应用有关,1985年宣布停用.同期基因重组人GH(r-hGH)应用于临床.20世纪90年代初国产r-hGH问世,临床应用日益广泛.1 基础研究1.1 GH分泌与调节GH生理情况下由腺垂体嗜酸细胞分泌,每个腺垂体含GH 5～10 mg,GH是由191个氨基酸组成的单链多肽,含二硫键,相对分子质量为2 200.GH基因簇由5个成员组成:GH1,CSHp1,CSH1,GH2,CSH2,定位于染色体17q22-24区带,其中仅GH1基因在垂体前叶GH分泌细胞中表达.GH分泌调节主要受下丘脑分泌的生长激素释放激素(GHRH)和生长激素释放抑制激素(SRIF)的调控,也受GH-IGF轴反馈调节,性腺、甲状腺功能也对GH分泌有影响.主要影响因素见表1.
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急性粒细胞白血病TCRγ基因重排的检测及其意义
①目的探讨急性粒细胞白血病(AML)中T细胞抗原受体γ链(TCRγ)基因重排的发生情况及其与AML临床特征的关系.②方法以构建的TCRγ基因片断为内参照模板,用聚合酶链反应(PCR)法扩增TCRγ基因重排片断.③结果 TCRγ基因重排在AML中发生率为24.4%,在急性单核系白血病中发生率高达48.1%,差异有极显著性(χ2=12.32,P＜0.001).有TCRγ基因重排的AML病人的外周血白细胞计数高于无TCRγ基因重排的AML病人(t=2.535,P＜0.05);有TCRγ基因重排的AML病人的肝大程度大于无TCRγ基因重排的AML病人(t=2.357,P＜0.05);TCRγ基因重排阳性的AML病人达到第1次缓解的时间长于TCRγ基因重排阴性的AML病人(t=2.532,P＜0.05).④结论 TCRγ基因重排可发生于部分髓系白血病病人,急性单核系白血病的发生率高,这部分病人临床体征明显,对标准化疗不敏感,不易获得缓解.
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血管免疫母细胞性淋巴结病病变性质的研究
①目的通过对血管免疫母细胞性淋巴结病(AIL)较系统的研究,进一步认识AIL的病变性质,探讨其可能的发病机制和病因,筛选对判定AIL病变性质有临床实用价值的方法和指标.②方法在临床病理研究的基础上,采用PCR技术、免疫组化技术、图像分析技术,对44例符合AIL组织学诊断标准病例的免疫表型、基因重排、bcl-2/IgH融合基因、EBV-DNA、DNA含量、P53蛋白、bcl-2、c-myc、EB病毒潜伏膜蛋白(LMP-1)、PCNA等多项指标进行检测分析;同时选择非何杰金淋巴瘤(NHL)20例和淋巴结反应性增生10例作为对照.③结果44例AIL的临床表现十分复杂,呈多系统、多脏器受累的复杂的临床表现;有在某季节(春季)集中发病的倾向.AIL的免疫表型表现为以T细胞增生为主.在组织学上,AIL表现为良恶性增生兼有的特征,片巢状透明细胞增生的出现是诊断恶性的组织学特征.44例AIL中有16例(36.7%)为克隆性基因重排阳性,其中12例为TCRγ克隆性重排,2例为IgH克隆性重排,2例为TCRγ和IgH双重排,其克隆性重排的检出率在AIL、NHL和反应性增生间的差异均有显著意义(χ2=8.218～26.036,P<0.01).44例AIL P53蛋白阳性表达率为31.8%,20例NHL P53蛋白阳性表达率为70.0%,反应性增生者无阳性表达,三者间的差异均有显著意义(χ2=8.145、28.033,P<0.05).AIL的DNA含量分析、bcl-2、PCNA的表达均与NHL和反应性增生不同,其差异均有显著意义.44例AIL中31例(70.5%)检出EBV DNA基因组,其潜伏膜蛋白LMP-1的阳性检出率为60.9%.④结论AIL不是一种独立的疾病,而是一组不同原因、不同病变性质的疾病所致的具有相似临床表现和具有共性组织学特征的临床病理综合征;基因重排检测能准确地在分子水平判定其病变性质;P53蛋白为认定AIL病变性质的有重要临床价值的免疫形态学指标;EBV感染是AIL发病的重要原因之一.
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野生型RET与RET/PTC融合基因在甲状腺乳头状癌的表达
目的 探讨野生型RET(wild type RET,WT-RET)和RET/PTC融合基因的表达与安徽地区人群PTC发生、发展的关系.方法 收集新鲜的35例PTC和相应的35例癌旁组织及10例甲状腺良性病变旁正常组织,巢氏PCR检测RET/PTC 1、2和3的表达,DNA测序检测融合基因序列.实时荧光定量PCR检测WT-RET和RET酪氨酸激酶区(RET tyrosine kinase,RET-TK)mRNA表达水平.原位杂交法检测RET的表达位置.结果 35例PTC中,RET/PTC阳性组织17例,其中RET/PTC1阳性15例,RET/PTC2阳性0例,RET/PTC3阳性2例,并运用DNA测序证实.WT-RET与RET-TK 2者在癌旁组织都几乎不表达,2者在RET/PTC阴性组的表达都是各自癌旁组织的2倍(P＜0.01,P＜0.01),2者在RET/PTC阳性组的表达分别是各自癌旁组织的3倍(P＜0.01)和64倍(P＜0.01).WT-RET在RET/PTC阳性与阴性2组之间表达差异无统计学意义(P＞0.05),RET-TK在RET/PTC阳性组表达明显高于阴性组,差异有统计学意义(P＜0.01).原位杂交结果显示RET表达于PTC滤泡细胞膜和细胞浆.RET/PTC与PTC临床参数如性别、年龄、肿瘤直径、淋巴结转移及临床分期等均差异无统计学意义(P＞0.05).结论 ①安徽地区人群散发性PTC中RET/PTC表达率不高,其对PTC的诊断和判断预后的价值不大.②散发性PTC中滤泡细胞表达WT-RET,可能促进了RET/PTC的发生,并共同参与了甲状腺肿瘤的发生.
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BIOMED-2体系检测免疫球蛋白重链基因重排在黏膜相关淋巴组织结外边缘区B细胞淋巴瘤诊断中的应用
目的 探讨BIOMED-2标准化体系检测免疫球蛋白重链(IGH)基因重排对黏膜相关淋巴组织结外边缘区B细胞淋巴瘤(MALT淋巴瘤)诊断的应用价值.方法 45例标本包括不同部位原发的MALT淋巴瘤36例、淋巴结外淋巴组织增生性病变3例、幽门螺杆菌(HP)感染相关性重度胃炎6例.用DNA提取试剂盒从石蜡包埋组织中提取所选病例的基因组DNA,通过BIOMED-2体系质控混合引物检测其质量,应用IGH VH-JH 3组引物组合进行IGH基因克隆性重排检测；比较分析该体系在MALT淋巴瘤诊断中的敏感性和特异性.结果 45例中31例(MALT淋巴瘤22例,淋巴组织增生性病变3例、重度胃炎6例)提取的基因组DNA可扩增出300 bp片段,其余14例DNA均严重降解.22例MALT淋巴瘤中,16例检测出IGH基因重排,灵敏度为72.7 ％;6例严重胃炎病例未检测出IGH克隆性重排,其特异度是100 ％;3例淋巴组织增生性病变中1例检测出IGH克隆性重排,2例未检测出重排.结论 在MALT淋巴瘤的诊断和淋巴组织增生性疾病的鉴别诊断中,BIOMED-2标准化体系检测IGH基因克隆性重排是一种快速可靠的方法,具有重要的临床应用价值.
关键词： 基因重排 淋巴瘤 B细胞 边缘区 BIOMED-2体系 -
免疫球蛋白kappa基因重排在B细胞增生性疾病中的检测及其应用
目的:评价免疫球蛋白kappa基因重排检测在B淋巴细胞增生性疾病中的价值.方法:选取93例B淋巴细胞增生性疾病及反应性增生标本(其中包括43例甲醛固定,石蜡包埋标本),运用降落PCR方法扩增Ig kappa CDR3区,以异源双链分析鉴别扩增产物以分辨其克隆性.结果:在所有确诊的72例B淋巴细胞增生性疾病中Ig kappa扩增的阳性率为47%,其中14例急性B淋巴细胞白血病中有2例阳性(14%);3例慢性淋巴细胞白血病中有2例阳性(67%);55例B细胞恶性淋巴瘤中有30例阳性(55%).在11例不典型增生的病例中,Igκ单克隆检出率为2/11(18%).10例反应性增生中无一出现单克隆重排.石蜡组织中扩增成功率为32/43(74%).结论:作为一个独立的分子标志,以PCR方法扩增Ig kappa确定B淋巴细胞增生性疾病的克隆性在其临床诊断及生物学特性研究方面是一种有前途的方法,且适用于石蜡标本以进行回顾性研究.
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B细胞非霍奇金淋巴瘤TCR基因重排及CDR3谱型分析
目的 分析B细胞淋巴瘤穿刺标本中T细胞受体(TCR)B链克隆性基因重排及互补决定区3(CDR3)谱型.方法 应用RT-PCR扩增TCR VB24个亚家族的CDR3区基因,并经基因扫描确定T细胞克隆性,对提示单克隆或寡克隆增生亚家族的PCR产物进行测序.结果3例淋巴瘤患者TCR存在限制性取用,仅表达2～5个V β亚家族.所有患者均存在克隆性增生T细胞,增生形式包括寡克隆及寡克隆增生趋势.CDR3区序列分析证实增生的T细胞克隆具有不同的氨基酸序列.结论 B细胞淋巴瘤患者存在T细胞克隆性增生,其TCRVβ呈限制性取用,不同克隆T细胞的CDR3序列不同.
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七例伴有TLS-ERG融合基因的儿童急性白血病临床和实验研究
目的 位于染色体16p11的TLS基因与位于21q22的ERG基因融合形成TLS-ERG融合基因,分析伴有TLS-ERG融合基因的儿童急性白血病形态学、免疫学、细胞遗传学和临床特点.方法 采用巢式反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测TLS-ERG融合基因转录本,联合染色体反带核型分析和流式细胞仪免疫表型进行分析.结果 TLS-ERG融合基因在急性髓细胞性白血病(AML)和急性淋巴细胞性白血病(ALL)中均有表达;未发现典型的t(16;21)(p11;q22)染色体核型;行免疫分型的7例白血病患儿中,除2例外其余均有CD34表达;3例AML和1例ALL患儿分别在确诊后1～3个月内死亡,1例临床分型为标危的ALL患儿在持续缓解28个月接受系统正规治疗中出现复发,复发时检测TLS-ERG融合基因由原来的持续阴性转为阳性.结论 伴有TLS-ERG融合基因的白血病细胞发生在造血分化的较早阶段;有该基因表达的AML患儿病情进展快;可将其作为白血病患儿治疗过程中微小残留病灶检测的一项指标.
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弥漫性大B细胞淋巴瘤t(14;18)易位和c-myc基因重排研究进展
弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是一组B淋巴细胞来源常见的、且具有异质性的非霍奇金淋巴瘤(NHL).就DLBCL中t(14;18)易位和c-myc基因重排及其诊断分型、治疗和预后评价方面的新研究进展进行综述.
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慢性粒细胞白血病CD+34细胞的生物学特性
慢性粒细胞白血病(CML)是一种起源于骨髓多能造血干细胞的恶性克隆性疾病,其中90%以上的病例具有ph染色体,其分子基础是bcr/abl基因重排.CD34抗原是一种表达于造血干/祖细胞的膜表面糖蛋白,正常CD+34细胞亚群中90%以上为祖细胞和干细胞,骨髓中约1.5%的单个核细胞表达CD34抗原,未经刺激的外周血中0.1%～0.2%的单个核细胞为CD+34,体内单独或联合应用造血生长因子能够提高外周血中CD+34细胞的数量,并有效地应用于外周血干细胞移植(PBSCT).
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多参数联合检测诊断以骨髓侵犯为唯一表现的淋巴瘤三例并文献复习
目的：探讨多参数联合检测诊断以骨髓侵犯为唯一表现淋巴瘤的价值。方法报道3例经多参数联合检测诊断的淋巴瘤，并复习相关文献。结果结合临床病史、血液生化等检查结果进行分析，多部位骨髓穿刺，行免疫学检查、骨髓活组织检查和基因重排等，可及早获取骨髓实验诊断结果，提高临床诊断率。结论多种技术联合应用的检测体系可提高不典型淋巴瘤诊断率。
