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流式细胞术结合TCR基因重排在T细胞非霍奇金淋巴瘤诊断中的应用
目的：探讨流式细胞术（FCM）结合 PCR 技术检测 TCR 基因重排在 T 细胞非霍奇金淋巴瘤（T-NHL）诊断中的作用。方法：对经组织学确诊的32例 T-NHL 的组织学形态、免疫组化、FCM 免疫表型、细针穿刺细胞学形态及 TCR 基因重排情况进行回顾性分析。对照组为18例反应性增生和1例坏死性淋巴结炎。结果：组织学诊断的32例 T-NHL 及19例对照组中，经 FCM / TCR 基因重排确诊的分别有23例和17例。 FCM /TCR 基因重排诊断与组织学诊断比较，敏感性为71．9％，特异性为89．5％，准确率为78．4％。结论：FCM 免疫表型结合 TCR 基因重排可作为诊断 T-NHL 的重要辅助手段之一，尤其对于不能取活检的，需行细针穿刺诊断的患者有较大应用价值。
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荧光定量PCR检测TCR VγI-Jγ基因重排标准品质粒及标准曲线的构建
目的:构建荧光定量PCR检测TCR VγI-Jγ基因标准品重组质粒和标准曲线,为建立实时荧光定量PCR准确检测淋巴系肿瘤微小残留病奠定基础.方法:对TCR VγI-¨基因进行序列分析,利用引物设计软件设计出一对引物和一条荧光探针.提取急性淋巴细胞白血病患者的DNA,经PCR扩增,产物纯化后与pMD 18-T Vector连接,转化到大肠杆菌DH5α,筛选得到标准品的质粒.结果:重组质粒进行荧光定量PCR扩增出现强烈的荧光值增长,表明TCRVγI-Jγ基因已成功克隆.以100～10-5不同稀释水平的标准品进行荧光定量PCR扩增,Ct值分别为21.08、24.34、27.53、30.58和33.25.统计学分析显示Ct值与标准品浓度的对数存在良好线性关系,回归系数为0.998.结论:所构建的TCR VγI-Jγ基因荧光定量PCR检测标准品特异性和线性关系好,准确可靠,利于统一标准.
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竞争性定量PCR检测恶性血液病造血干细胞移植术后克隆性TCRVγI-Jγ基因重排
目的:为提高恶性血液病患者微小残留病(MRD)检测的临床意义.方法:构建竞争性定量聚合酶链反应(PCR)检测技术并定量分析31例恶性血液病患者(包括12例急性淋巴细胞白血病,10例急性非淋巴细胞白血病,6例非霍奇金淋巴瘤和3例慢性粒细胞白血病)造血干细胞移植术后TCRVγI-Jγ基因重排.结果:建立定量PCR方法的灵敏度为10-5水平;31例恶性血液病造血干细胞移植术后1个月MRD的水平为(316±274)×10-5,移植后1个月MRD水平显著低于移植前[(421±327)×10-5](P＜0.025);22例自体造血干细胞移植术后MRD为(347±291)×10-5水平,显著高于9例异基因造血干细胞移植术后[(263±221)×10-5](P＜0.05);MRD＞400×10-5的13例病人中2年内复发率为53.8%(7/13),而MRD＜400×10-5的18例病人中仅有2例(11.1%)出现复发.MRD＞400×10-5患者2年内的复发率显著高于MRD＜400×10-5患者(P＜0.01).结论:所构建竞争性定量PCR技术简便、快速、灵敏;定量检测恶性血液病造血干细胞移植术后MRD水平有利于预后预测.
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抗原受体基因寡/亚克隆重排和克隆演化的研究进展
抗原受体基因如免疫球蛋白重链(IgH)及T细胞受体(TCR)的可变区(V)和连接区(J)片段在干细胞向淋巴系分化时会发生特异性重排,形成V-D-J片段,不同淋巴细胞其V-D-J重排方式是不同的,因此重排后形成V-D-J片段是每个淋巴细胞克隆特有的基因标志.淋巴系肿瘤为单克隆起源,因此其IgH/TCR基因重排方式是单一的,经聚合酶链反应(PCR)或Southern杂交等方法检测可出现特征性的重排带,可作为淋巴系肿瘤克隆的独特基因标志,已较广泛应用于淋巴系肿瘤微小残留病(MRD)及基因分型等研究[1].但多重研究显示应用DNA印迹法及以PCR等方法检测发现在相当一部分淋巴系统肿瘤患者中存在2种或2种以上的抗原受体基因(IgH和/或TCR)重排方式,而且在随后疾病的发展过程中,部分患者Ig和/或TCR基因重排的方式还会发生改变,目前认为上述现象主要是由于寡/亚克隆重排和克隆演化所致[2].
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免疫球蛋白重链基因重排检测在急性淋巴细胞白血病微小残留病中的应用
近30年来,随着化疗方案的改进,儿童急性淋巴细胞白血病(acute lymploblastic leukemia,ALL)的初治缓解率已达95%以上,但仍然有大约20%～30%的ALL 缓解患儿复发.近十年研究表明,其复发的主要根源是体内仍残留有一定数量的白血病细胞,又称微小残留病变(minimal residual disease,MRD).通过传统的形态学检查,很难发现MRD.克隆性免疫球蛋白重链(IgH)基因重排几乎见于所有的B-ALL,是B细胞系合适的克隆性标志物,因此可做为检测微小残留病的标志分子[1].
关键词： 免疫球蛋白重链 基因重排 急性B淋巴细胞白血病 微小残留病 -
肺腺癌EML4-ALK融合基因的检测及其临床病理特征
目的 探讨荧光原位杂交(FISH)和免疫组化(IHC)两种方法筛选肺腺癌ALK基因突变患者的敏感性和一致性,并讨论ALK基因突变亚型的临床病理特征.方法 收集2012年1月～2013年12月收治的肺腺癌患者标本60例,采用FISH和IHC(克隆号D5F3)检测ALK基因重排状态.结果 FISH检测发现11.7％ (7/60)的患者发生了ALK基因重排,IHC检测发现13.3％(8/60)的患者有ALK蛋白的表达,以FISH为标准检测方法,则IHC检测ALK突变的敏感性和特异性分别是100％和98.3％,与FISH的一致性达98.4％.ALK基因重排患者年龄偏小,且均为EGFR野生型.结论 采用D5F3抗体Ventanna系统进行ALK初筛,再联合FISH进行确认是一种经济、可靠的筛选ALK基因重排肺腺癌的方法.
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间期荧光原位杂交技术检测恶性血液病的11q23/MLL基因重排
目的 分析伴有11q23/MLL基因重排的恶性血液病的细胞遗传学特点,探讨荧光原位杂交技术( FISH)在诊断及鉴定恶性血液病11q23/MLL基因重排中的价值.方法 用间期FISH分析11q23/MLL基因易位细胞的30例恶性血液病患者的核型特征, 用MLL双色分离探针绿色标记在 (5′MLL, 光谱绿) 和 (3′MLL, 光谱桔红).结果 应用常规细胞遗传学及间期FISH分析白血病患者30例,结果显示11q23+/MLL+患者9例(30.0%),11q23-/MLL+患者4例(13.3%),11q23+/MLL-患者2例(6.7%),11q23-/MLL-患者15例,检测到部分病例染色体核型分析与间期FISH方法检测11q23异常与MLL基因重排不一致.结论 FISH在检测11q23/MLL基因重排方面与传统的常规细胞遗传学相比具有检出率高的优势,能更有效、直观地分析恶性血液病的染色体异常,对于恶性血液病的诊断以及异常染色体的检出具有广泛的应用前景.
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抗体多样性的研究进展
关于抗体多样性的遗传起因，科学家曾经提出了2种解释理论：一是生殖系理论，认为所有抗体都由专一基因负责，该理论的问题在于，面对如此众多的抗体，生物体内的基因数目无法满足需求；二是体细胞突变理论，认为抗体基因可以发生突变和重组，该理论能够解释较少的基因即可产生大量微小差异的抗体。目前这2个理论都缺乏相关的实验支持。
日本学者利根川进利用限制酶酶切和重组DNA 解决了这个难题，他们首先纯化抗体的mRNA ，然后将其与DNA 杂交，并计算产生抗体的基因数目，结果表明基因数目远远少于抗体数目，因此，否定了生殖系理论［1］。1976年，利根川进将胚胎细胞（不产生抗体）和骨髓瘤细胞（产生抗体）中抗体轻链基因的分布情况进行了比较，发现在胚胎期不同抗体基因的距离较远，而在骨髓瘤细胞中这些基因距离靠近，这个设计精密且令人信服的实验说明生殖细胞在发育成B 淋巴细胞的过程中，抗体基因出现了重分布现象［2］。他们在此基础上对抗体基因的重分布现象及机制进行了全面研究。在随后5年中用一系列证据确定了体细胞突变理论的正确性［3-5］，即抗体多样性是由于B淋巴细胞中抗体基因片段的染色体重组和突变所造成［6］。1987年，利根川进由于“抗体多样性产生遗传机制的发现”而独享了该年度的诺贝尔生理学及医学奖。 -
非霍奇金淋巴瘤IgH基因重排分析及其意义
目的 探讨免疫球蛋白重链(IgH)基因重排的检测在非霍奇金淋巴瘤(NHL)中的诊断价值.方法 用半巢式和混合聚合酶链式反应(PCR)方法,联合使用IgH FR3A、FR2A、FR1家族特异性引物Mixtures(VH1、VH2、VH3)检测44例B-NHL患者、1例未分型淋巴瘤、15例T-NHL患者和5例淋巴结反应性增生患者IgH基因克隆性重排情况.结果 ①采用FR3A引物,44例B-NHL有37例出现克隆性IgH基因重排,检测率为84%(37/44);采用FR2A引物,有27例出现克隆性IgH基因重排,检测率为61% (27/44);采用FR1家族特异性引物Mixtures(VH1、VH2、VH3)与J区(JHb、JHc)引物,有34、33例出现克隆性IgH基因重排,检测率为77%、75% (34/44、33/44);结合FR3A、FR2A、FR1家族特异性引物Mixtures(VH1、VH2、VH3),总检测率为95%(42/44).②15例T-NHL有4例出现克隆性IgH基因重排,而5例LRH未出现克隆性IgH基因重排.③1例免疫组化未分型的NHL经PCR检测后明确了分型,为B细胞性淋巴瘤.结论 联合采用多对引物可提高检测阳性率;IgH基因克隆性重排检测对鉴别B细胞淋巴瘤和淋巴结反应性增生以及T细胞淋巴瘤有重要意义.
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PCR检测非霍奇金淋巴瘤IgH和TCRβ基因重排
目的探讨PCR方法检测IgH和TCRβ基因重排在非霍奇金淋巴瘤(NHL)诊断中的临床意义.方法用PCR方法检测40例非霍奇金淋巴瘤和5例慢性淋巴结炎的基因重排情况.结果 20例B细胞NHL中检测出19例IgH基因重排,20例T细胞NHL中检测出17例TCRβ基因重排.结论 PCR方法检测NHL中IgH和TCRβ基因重排具有敏感、特异的优点,在非霍奇金淋巴瘤的诊断中具有重要价值.
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黏膜相关淋巴组织淋巴瘤中Ig蛋白重链表达与IgH基因重排的研究
目的 探索黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALToma)中Ig蛋白重链表达及IgH基因重排对其与反应性淋巴组织增生(RLH)鉴别诊断的价值,以期找到有助于两者鉴别诊断的新方法.方法 收集30例MAL-Toma、10例滤泡性淋巴瘤(FL)、10例浆细胞瘤(PC)作为试验组,并收集10例RLH作为对照组.应用免疫组织化学和Biomed-2引物系统分别检测两组Ig蛋白重链表达及IgH基因重排情况.结果 Ig蛋白重链在两组表达模式有3种:单种Ig重链表达(模式1)、全阴性Ig重链缺失(模式2)及多种Ig重链表达(模式3).3种肿瘤及试验组中模式1/2及IgH基因单克隆重排检出率均高于对照组(P＜0.05),且两者联合检测的阳性率显著升高.结论 单种Ig重链/全阴性Ig重链缺失表达的检出可以作为B细胞恶性淋巴瘤尤其是MALToma的诊断线索;联合Ig重链及IgH基因重排检测有助于MALToma的鉴别诊断.
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急性白血病中MLL基因重排研究进展
MLL基因位于11号染色体长臂2区3带(11q23),是HOX基因转录的上游调节因子[1-2].研究显示,恶性血液病及拓扑异构酶Ⅱ抑制剂诱导均可导致MLL基因重排[3-4].在急性白血病中常见MLL基因重排,其甚至作为急性白血病的标志之一[3].MLL重排阳性多见于急性髓细胞白血病(acute myeloblastic leukemia,AML)、急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)、骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)及治疗相关性白血病.MLL基因重排在儿童AML中占14％,其中65％与婴儿AML相关;该重排基因在ALL中发病占6％,其中大约80％为婴儿(＜1岁)ALL患者;该重排基因也常在MDS及经拓扑异构酶Ⅱ治疗后的相关性白血病中发现,特别是AML[5].
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IgH/TCR基因重排与EB病毒原位杂交联合分析在淋巴瘤诊断中的应用
目的：探讨免疫球蛋白重链/T细胞受体（IgH/TCR）基因重排检测联合EB病毒（EBV）原位杂交在淋巴瘤诊断中的应用，分析EBV+-B细胞淋巴瘤的细胞学及基因组学特征、鉴别诊断要点，以缩短诊断时间，减少误诊。方法采用IgH/TCR基因重排与EB原位杂交联合分析诊断EBV+-B细胞淋巴瘤1例，分析其免疫组化特征、EBV原位杂交、基因重排结果。结果 EBV+-B细胞淋巴瘤临床上主要表现为淋巴结增大，常伴骨髓和外周血浸润。淋巴结活检显示其结构破坏，淋巴滤泡减少，淋巴结高度增生性病变，可见轻至中度异型淋巴细胞，淋巴窦扩张，组织细胞增生。免疫组化证实EBV感染的细胞毒性B细胞构成病变主体；EBV原位杂交显示部分淋巴细胞核阳性；基因重排提示IgH、免疫球蛋白轻链（Igκ）基因发生克隆性重排，TCRγ无克隆性重排。结论 EBV+-B细胞淋巴瘤从形态学上难以与伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病等淋巴瘤区分，早期诊断困难。联合应用IgH/TCR基因重排与EBV原位杂交技术对EBV+-B细胞淋巴瘤的诊断有较高准确性。
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Jurkat(E6-1)细胞TCR alpha和beta链重排基因家族取用分析
目的 探讨人T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat(E6-1)TCR alpha和beta链的重排基因家族的取用及基因、氨基酸序列与结构,为Jurkat细胞做为单克隆T细胞研究的模型提供基础.方法 采用T细胞TCR的免疫扫描谱型分析技术(im-munoscope spectratyping),监测Jurkat细胞的alpha和beta链各基因家族的取用,ABI测序仪测序出各取用家族基因的序列,并分析其氨基酸组成(DNA tools软件),模拟H{TCR的结构(CPH modle 2.0 Server和Informax 9.0).结果 Jurkat细胞TCR alpha链的基因家族取用为:可变区为TRAV1,连接区为TRAJ3;beta链的基因家族取用为:可变区为TRBV8S1,连接区为TRBJIS2.结论 Jurkat(F6-1)细胞的TCR alpha和beta链基因、氨基酸序列和结构的确定,将为Jurkat做为效应T细胞、TCR重排模型等方面的研究提供基础.
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T-ALL中两种新的TCRδ基因重排δRec151051-Jδ1和δRec151298-Jδ1
目的分析T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞中TCRδ基因新的重排形式及其在正常人外周血和胸腺细胞中的分布情况.方法利用半巢式PCR扩增2例T-ALL、10例正常人外周血和7例正常人胸腺细胞DNA的TCRδ基因组片段,了解其重排情况,克隆性PCR产物进一步进行核苷酸序列分析确定重排位置,并进一步经RT-PCR检测其重排基因的表达情况.结果在2例T-ALL病人白血病细胞发现两种新的TCR δRec-Jδ1基因重排方式,称为δRec151051-Jδ1和δRec151298-Jδ1,该新的TCR δRec基因重排同时见于大多数正常人外周血和胸腺.RT-PCR显示该两种TCR δRec-Jδ1基因重排的产物可见于2例T-ALL中,而正常人为阴性. 结论本研究发现两种新的TCR δRec151051-Jδ1和δRec151298-Jδ1基因重排.该重排基因表达于T-ALL中,而正常人不表达该重排基因,提示该重排形式可能与T细胞白血病的形成有一定的关系.
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正常人外周血和胸腺T细胞中TCR δRec151051-Jδ1和δ Rec151298-J δ 1基因重排的分布特点
目的分析正常人外周血和胸腺细胞中TCR δRec151051-Jδ1和δRec151298-Jδ1基因重排分布特点.方法利用半巢式和巢式PCR扩增10例正常人外周血单个核细胞(PBMCs)、4例分选的外周血CD3+T细胞和7例正常人胸腺细胞DNA的TCR δRec基因与J δ 1、Dδ3和ψJα重排的基因片段,从不同含量DNA的PCR分析,了解其重排分布频率.结果 TCR δRec151051分别与Jδ1、Dδ3和ψJα的重排和TCR δRec151298-Dδ3重排见于大多数外周血T细胞和胸腺细胞中,而TCR δRec151298与Jδ1和ψJα的重排则多见于胸腺细胞中.对不同含量的DNA的PCR分析显示δRec重排的分布频率在外周血和胸腺细胞有所不同.结论 TCR δRec151051、TCR δRec151298与Jδ1、Dδ3和ψJα的重排均存在于多数正常人T细胞中,TCR δRec151051-Dδ3常见于成熟和未成熟T细胞中,而TCR δRec151298-J δ 1和TCR δRec151298-ψJα则主要见于未成熟T细胞中.
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急性单核系白血病M4/M5中MLL基因重排的间期荧光原位杂交研究
目的探讨间期荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技术对混合谱系白血病(mixed lineage leukemia, MLL)基因重排检测的价值;评估MLL重排在急性单核系白血病M4/M5中的发生率和预后意义.方法采用骨髓直接法或短期培养法制备染色体,应用R显带技术进行核型分析.采用地高辛标记的跨越11q23断裂位点的单色MLL探针和间期FISH技术对23例急性单核系白血病M4/M5病例进行MLL重排检测.结果 R显带揭示23例中7例有涉及11q23的易位,5例有其他核型异常,10例核型正常,1例核型分析失败.FISH研究显示12例有MLL重排,包括R显带检出11q23异常的7例.结论 FISH技术检测MLL重排的敏感性明显高于常规细胞遗传学技术;MLL重排与急性单核系白血病M4/M5高度相关,是预后不良的指标.
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免疫球蛋白重链基因重排与急性B淋巴细胞白血病
免疫球蛋白重链(IGH)基因重排被认为是急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)的特异性的指标,几乎所有的急性B淋巴细胞淋巴细胞白血病病人IGH-PCR检测都是阳性.IGH基因重排阳性可以用于辅助诊断B-ALL.而且对IGH-PCR动态观测可反应化疗的效果,同时是重要的预后指标,并能用于指导实施个体化治疗和BMT治疗.本文就免疫球蛋白重链基因重排与急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)的关系作一综述.
关键词： 免疫球蛋白重链 基因重排 白血病 急性B淋巴细胞白血病 -
经典霍奇金氏病与滤泡型淋巴瘤的同源性研究
经典霍奇金氏病与滤泡型淋巴瘤发生于同一个病人的机率很高,通过免疫表型研究和免疫球蛋白基因重排分析发现,两者具有许多共同的特征,证实这两种不同的疾病具有相同的前体细胞--都来源于生发中心的B细胞.但二者在免疫表型及基因表达方面仍存在着差异,该差异的出现可能与B细胞转化机制有关.
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1例伴48,XY,t(2;12)(p14-p15;p11),t(7;12)(q11;p13),+8,+22易位的AML累及TEL基因
染色体异常是与恶性血液病发生相关的重要事件,其中以染色体易位为多见.TEL基因在急、慢性白血病,骨髓异常增生综合征(MDS)和恶性淋巴瘤中均可受累,多种染色体易位均可导致TEL基因重排.
