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一种改进的荧光定量PCR标准曲线法的建立
目的 对常规实时荧光定量PCR(RT-PCR)的标准曲线法进行改进,以建立一种更为准确的RT-PCR的标准曲线定量法.方法 通过构建β-actin、KLK11的质粒DNA标准品,以β-actin质粒DNA为正常对照,制作内参基因和目的 基因的标准曲线,获得各自的扩增曲线.RT-PCR检测两种基因在恶性前列腺组织细胞LNCAP中的表达,并将改进的标准曲线法与常规的标准曲线法分别对β-actin/KLK11实时定量PCR的结果进行分析,分析两种方法的差异,以衡量新方法的准确性.结果 所得β-actin和KLK11的标准曲线线性相关性良好(β-actin R2=0.991,KLK11R2=0.992),但两种基因的扩增效率有差异(β-actin 123%,KLK11 99%).两种不同的标准曲线法处理后得到不同的结果:常用标准曲线法结果显示KLK11在LNCAP中有表达下调,而改进的标准曲线法得出KLK11在LNCAP中上调4.46倍.目的 基因与内参基因的扩增效率差异有统计学意义(t=4.829,P＜0.05).结论 与常规的绝对定量法比较,改进的标准曲线法避免了因默认目的 基因与内参基因有相同的扩增效率而导致的错误,是一种更为准确的荧光定量PCR分析方法.
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聚合酶链反应方法检测外周血淋巴细胞HLA-A mRNA方法学的建立及在肾移植中的初步应用
目的 通过建立检测宿主外周血淋巴细胞(PBL)表面HLA-AmRNA表达程度的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-FQ-PCR)方法,检测肾移植患者移植后外周血淋巴细胞表面HLA-A mRNA的表达程度,探讨其在诊断移植后早期排斥反应的发生的价值及机体免疫状态的关系.方法 以6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)作内参照,用Taqman探针荧光定量技术,建立检测PBL HLA-A mRNA的RT-FQ-PCR方法;并检测35例随访移植患者的不同时间的60个标本和60名正常人的阈循环数(Ct),然后用REST软件分析PBL HLA-A mRNA的表达水平.结果 正常人和51个移植标本的PBL HLA-A mRNA对G6PDH的相对表达量分别为0.036±0.012和0.026±0.015(双侧t=1.981,P＜0.05),提示服用免疫抑制药(目前临床用药剂量均偏大)后患者PBL HLA-A mRNA表达减弱,机体免疫状态低,无排斥反应发生但易导致感染、肿瘤等并发症的产生;其中9个移植标本的PBL HLA-A mRNA对G6PDH的相对表达量为0.042±0.017(双侧t=2.002,P＜0.05),提示较其他51例移植标本患者PBL HLA-A mRNA表达增强的患者,经病例回访查询发现该5例移植患者在这期间有排斥反应(根据临床表现、肾功能检查、影像学及核医学检查的临床排斥反应期)的发生,其中1例在移植后6个不同时间的标本显示2次有增高,每次经治疗后均降低.结论 建立的宿主PBL HLA-A mRNA RT-FQ-PCR检测方法简便、特异、重复性好、可信度高,可用于肾移植后PBLHLA-A mRNA表达水平的检测,评估机体的免疫状态,预测排斥反应的发生.
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胃癌及癌旁组织p73 基因的表达
p53基因是人类肿瘤中发生变异频率高的抑癌基因,在多种肿瘤的生物学行为中具有重要的作用[1-10].p73基因是近来发现的p53基因家族中新成员,其产物与P53蛋白具有非常相似的结构和功能,被认为是一个候选的抑癌基因[11-16];目前国内外虽有少数对胃癌及癌旁组织中p73基因表达的研究,但意见极不一致.为了解该基因在胃癌发生发展中的作用,我们应用RT-PCR技术对胃癌、癌旁及正常组织标本中p73mRNA表达水平进行了分析.
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甲状腺素对脾虚小鼠脾细胞和胸腺细胞表达IL-3 mRNA的影响
白介素3(IL-3)是一种多功能造血干细胞刺激因子,因而具有调节体内造血功能的作用[1].甲状腺素可通过神经内分泌免疫调节环路改善造血功能.为探讨甲状腺素对脾虚小鼠脾细胞和胸腺细胞IL-3表达的影响,我们在ConA刺激的脾细胞和胸腺细胞中加入甲状腺素,用斑点杂交法检测其对脾虚小鼠脾细胞和胸腺细胞IL-3 mRNA的影响.
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肝癌和癌旁肝组织中IGF-I,IGF-I受体mRNA的表达
目的 探讨胰岛素样生长因子I(IGF-I)及其受体(IGF-I R)在肝细胞癌变过程中的作用及意义.方法 采用DNA-RNA原位杂交方法观察肝癌(n=30)和癌旁肝组织中IGF-I,IGF-I受体mRNA的表达.结果 在肝癌和癌旁肝组织中IGF-I的表达率分别为40.0%和50.0%,IGF-I受体的表达率分别为46.7%和53.3%;IGF-I,IGF-I受体在分化较差的癌细胞和不典型增生肝细胞中表达为明显. 结论 IGF-I和IGF-I受体可能在肝细胞癌变过程中发挥重要作用.
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大肠癌患者外周血循环癌细胞检测的临床意义
目的探讨大肠癌外周血循环癌细胞检测的临床意义.方法以CK-20 mRNA为靶分子,RT-PCR技术检测3种癌细胞株(结肠腺癌细胞株SW-480、胃癌细胞株SGC-7901、食管癌细胞株TE-11)和67例大肠癌患者外周血细胞CK-20 mRNA的表达.结果三种癌细胞株中,只有结肠癌细胞表达CK-20 mRNA.RT-PCR技术能检出107个单核细胞中的一个肿瘤细胞;67例患者中,35例外周血CK-20 mRNA阳性,阳性率与大肠癌Dukse'分期明显相关:Dukes'A期25%,B期38.46%,C期55.17%,D期70.59%.53例手术治疗患者中,术前25例CK-20 mRNA阳性,术后30例阳性.25例术后早期短程化疗患者,化疗前阳性6例,化疗后仅2例阳性.结论大肠癌循环癌细胞(CK-20 mRNA)的检测可能成为判断大肠癌恶性程度、转移和复发以及疗效监测的客观指标.
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CD44v6及nm23-H1表达与肝细胞癌侵袭转移
目的原位检测肝细胞癌(HCC)中CD44v6 mRNA及nm23-H1 mRNA的表达,了解CD44v6 mRNA及nm23-H1 mRNA的表达与HCC侵袭转移的关系,了解HCC中CD44v6 mRNA表达与nm23-H1 mRNA表达的相关性.方法采用PCR法合成CD44v6 cDNA探针,体外转录法合成nm23-H1 cRNA探针,采用原位杂交法检测HCC 33例 CD44v6 mRNA和nm23-H1 mRNA的表达.结果侵袭转移倾向高危组的10例HCC标本中,CD44v6 mRNA和nm23-H1 mRNA的阳性率分别为80.0%(8/10)和40.0%(4/10);侵袭转移倾向低危组的23例HCC标本中,CD44v6 mRNA和nm23-H1 mRNA的阳性率分别为21.7%(5/23)和91.3%(21/23).CD44v6 mRNA的表达与HCC的侵袭转移倾向具有正相关性(P＜0.01),nm23-H1 mRNA的表达与HCC的侵袭转移倾向具有负相关性(P＜0.01),CD44v6 mRNA及nm23-H1 mRNA的表达具有负相关性(P＜0.01).结论检测CD44v6 mRNA及nm23-H1 mRNA的表达可能成为HCC转移预后判断的指标.
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胃癌组织mdr1基因表达的临床意义
目的探讨多药耐药基因(mdr1基因)在人胃癌组织中的表达及其与临床病理的关系.方法应用RT-PCR法检测了29例手术切除人胃癌组织中的mdr1 mRNA. 术前未用过化疗.结果 mdr1 mRNA的阳性率为48.3%(14/29),mdr1 mRNA的表达在肿瘤浸润浆膜者为33.3%(7/21),明显低于未浸润浆膜者(7/8),基因的表达与年龄、性别、肿瘤大小、组织学类型、淋巴结转移及TNM分期等无关.结论化疗前胃癌组织中mdr1基因即存在较高的表达率,这为选用化疗药物和MDR逆转剂提供了参考指标. mdr1 mRNA表达减少似与肿瘤进展相关.
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采用改进的差示PCR技术分离胃癌差异表达基因的研究
目的建立优化的mRNA差示PCR条件;运用建立的条件及GQS-9600分离胃癌GC7901与胃粘膜GES-1细胞株之间的差异表达基因片段;根据获取的序列,设计引物并运用于胃癌组织、血、活检胃粘膜标本检测,拟从中筛选出检出率与符合率高的数对引物,建立胃癌基因诊断方法.方法以胃癌GC7901与胃粘膜GES-1细胞株为研究对象,探索mRNA差示PCR的佳反应条件,运用优化的条件分离细胞株之间的差异表达基因片段;以回收的片段作探针,打点杂交证实为真正的差异片段后,对纯化产物进行直接序列分析及GenBank同源性检索,同源性低的序列递交给GenBank;设计引物,采用RT-PCR方法对胃癌组织、血、活检胃粘膜进行检测,筛选出检出率与符合率高的5对引物建立多重PCR诊断胃癌方法.结果①优化的差示PCR条件为:前5轮PCR循环采用94℃ 35s,40℃ 2min,72℃ 30s,后35轮PCR循环采用94℃ 45s,55℃ 2min,72℃ 1min,后在72℃延伸7min;②确认并分离出差异条带154条,胃癌细胞株泳道中存在而胃粘膜细胞株泳道中缺失的有82条,胃粘膜细胞株泳道中存在而胃癌细胞株泳道中缺失的有35条,胃癌细胞株泳道中表达高于胃粘膜细胞株泳道中的有23条,胃粘膜细胞株泳道中表达高于胃癌细胞株泳道中的有14条,分别来自于H-T11G,H-T11A,H-T11C锚定引物的差异条带为61条,47条及46条;③从胃癌细胞株泳道中存在而胃粘膜细胞株泳道中缺失的82条带中随机挑选出17个差异片段作探针,进行打点杂交,证实在两细胞株之间呈差异表达;④对17个片段进行直接测序及同源性检索分析,其中7个新序列被GenBank接受,接受号为AF071052至AF071058;⑤GCYS-1,GCYS-4,GCYS-8,GCYS-10,GCYS-11号序列引物在26例胃癌标本中检出覆盖率为100%,在9例病理确诊的胃癌患者活检胃粘膜中检出率为100%,在17例病理确诊为胃癌患者血标本中检出率为53%,在其他组织中检出率较低.结论①建立了优化的mRNA差示PCR技术的条件;②分离出了154个差异表达的基因片段;③对17个差异片段进行了测序及分析,其中7个新序列被GenBank接受;④建立多重PCR诊断胃癌方法.
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转化生长因子-β1在肝细胞性肝癌中表达增强
目的转化生长因子-β1(TGF-β1)在细胞生长的负性调节上有重要作用,是肝细胞生长和增殖的强抑制物但肝癌(HCC)患者肝组织中TGF-β1 mRNA表达高. 现检测HCC患者外周血中TGF-β1 mRNA表达,血清TGF-β1水平,以及肝组织中TGF-βⅡ型受体(TGF-β-RⅡ)的表达.方法 HCC患者外周血分离单个核细胞(PBMC),提取总RNA,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增TGF-β1 mRNA. 血清TGF-β1水平测定用Promega公司产的试剂盒. 肝组织TGF-β-RⅡ表达的分析用原位杂交法.结果 HCC患者20例PBMC TGF-β1 mRNA用RT-PCR检测阳性率达70%,对照组阴性. HCC患者40例血清TGF-β1水平(27.58mg/L±8.10mg/L)明显高于对照组(8.27mg/L±3.72mg/L). 原位杂交表明,TGF-β-RⅡ在HCC细胞的胞质中有弱表达.结论 HCC患者TGF-β1基因在转录水平和翻译水平上均显示表达增强. PBMC有可能代替肝组织用以检测TGF-β1 mRNA的表达应用于基础与临床的研究.
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胰腺癌MUC1 mRNA转染树突细胞疫苗诱导特异性抗肿瘤的免疫反应
目的 研究人胰腺癌MUC1 mRNA转染树突细胞(DC)诱导的特异性抗肿瘤免疫反应,为DC疫苗治疗胰腺癌提供实验依据.方法 从外周血中分离单核细胞(PBMC)并培养成DC,从细胞形态和表面标志进行鉴定.通过RT-PCR扩增胰腺癌MiaPaCa-2细胞的MUC1 mRNA后用电穿孔法将其转染DC.采用实时定量PCR和蛋白质印迹法检测培养不同时间点DC的MUC1的表达.用四甲基偶氮唑蓝法检测DC存活率.采用51Cr标准细胞毒实验观察转染MUC1 mRNA的DC诱导的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应；应用ELASA法检测CTL的IFN-γ释放量.结果 培养获得的细胞呈现典型的DC形态特征和表面标志(CD40+、HLA-DR+、CD83+、CD86+).MUC1 mRNA转染DC48 h后,细胞MUC1 mRNA表达水平高,为38.43(36.89 ～48.06),蛋白表达亦强.转染后DC的存活率稳定在80％左右.转染MUC1 mRNA的DC可有效诱导HLA-A2 +/MUC+特异性CTL免疫反应；胰腺癌Capan-2细胞与转染MUC1的DC刺激MUC1特异性CTL的24 h IFN-γ释放量分别为(28.44±4.96)和(16.31 ±2.54) U/ml,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 人胰腺癌MUC1 mRNA体外转染DC后可诱导CTL产生特异性抗肿瘤免疫反应.
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血清肝素结合表皮生长因子mRNA水平与急性冠状动脉综合征的关系
目的:探讨血清中肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)信使核糖核酸(mRNA)水平与急性冠状动脉(冠脉)综合征的关系.方法:采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测50例急性冠脉综合征患者(ACS组)及100例正常对照组(NC组)血清中HB-EGF mRNA的表达水平,运用Logistic回归分析评估其与急性冠脉综合征的关系.结果:与NC组相比,ACS组患者的HB-EGF mRNA水平较高(0.22±0.73 vs 0.46±0.14,P<0.05).校正高血压、吸烟、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、体重指数等单因素分析中有意义的因素后,HB-EGF mRNA水平与急性冠脉综合征有关(比值比=5.813,95%可信区间:2.342~14.426,P<0.001),即HB-EGF mRNA每增加0.1个灰度值,急性冠脉综合征风险增加4.813倍.结论:血清中HB-EGF mRNA水平升高与急性冠脉综合征有关.
关键词： 肝素结合表皮生长因子 RNA 信使 急性冠状动脉综合征 -
mRNA作为结核分支杆菌活菌检测标志的可行性研究
目的探讨mRNA作为结核分支杆菌活菌检测标志的可行性.方法采用定量聚合酶链反应(PCR)方法测定结核分支杆菌H37RV在利福平﹑异烟肼﹑乙胺丁醇﹑链霉素﹑氧氟沙星处理后24﹑48﹑72 h 85B mRNA表达水平的变化,并与活菌计数方法对比.结果在异烟肼﹑利福平和链霉素处理24 h时,结核分支杆菌H37RV活菌数下降明显;在异烟肼、链霉素、乙胺丁醇及氧氟沙星各药各浓度处理72 h时,活菌数相似,但利福平处理后活菌数较它们低.利福平处理24 h后85B mRNA下降到无药对照的0.02%,其他药物处理分别下降到无药对照的1%～10%;各药处理72 h后85B mRNA均下降到1%以下.结论 mRNA表达水平可以在短时间内反映出用药与无药的区别,并与菌落形成单位(cfu)几乎呈平行关系.mRNA是检测和判定结核分支杆菌"死""活"的分子标志物.
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mRNA定量法用于结核分枝杆菌利福平敏感性分析的研究
目的评价应用mRNA定量法进行结核分枝杆菌利福平敏感性分析的可行性和应用价值.方法定量检测结核分枝杆菌85B mRNA,分别以mRNA拷贝数百分比(使用利福平药物后mRNA拷贝数占用药前的百分比)为1%和10%作为耐药临界指标分析53株结核分枝杆菌临床分离株对利福平的敏感性,并与绝对浓度法作比较,其中29株为利福平耐药株、24株为利福平敏感株.结果53株结核分枝杆菌l临床分离株mRNA定量法检测:在利福平浓度为1μg/ml的条件下分别以1%和10%为耐药临界比例时,与绝对浓度法相比准确性分别为70%、81%,敏感性分别为100%、100%,特异性分别为33%、58%;在利福平浓度为2μg/ml的条件下分别以1%和10%为耐药临界比例时,与绝对浓度法相比准确性分别为85%、93%,敏感性分别为100%、97%,特异性分别为67%、88%,在利福平浓度为4μg/ml的条件下分别以1%和10%为耐药临界比例时在与绝对浓度法相比准确性分别为93%、93%,敏感性分别为93%、93%,特异性分别为92%、92%.结论mRNA定量法用于结核分枝杆菌药物敏感性分析具有快速、可定量等优点,建议mRNA定量法测定利福平敏感性采用临界药物浓度为2μg/ml、耐药临界比例为10%.
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单核细胞组织因子在急性缺血性脑卒中的动态变化
目的 观察急性缺血性脑卒中(AIS)患者急性期及恢复期组织因子(TF)的变化.方法 选择发病48 h内的AIS患者30例为AIS组,健康体检者61例为对照组.采用RT-PCR检测单核细胞TF mRNA;采用ELISA法检测血浆TF抗原.结果 与对照组比较,AIS组急性期患者单核细胞TF mRNA(0.254±0.04 vs 0.312±0.09)和血浆TF抗原[(197.18±94.91)ng/L vs (276.64±106.01)ng/L]均明显增高,呈同步上升趋势(P＜0.05)；与急性期比较,AIS组恢复期单核细胞TF mRNA及血浆TF抗原呈同步下降,差异均有统计学意义(P＜0.05).AIS组恢复期血浆TF抗原与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 AIS患者发作期血液呈高凝状态,血栓形成风险增加;动态观察AIS患者单核细胞TF mRNA与血浆TF抗原含量,对了解疾病的发生、发展有辅助作用.
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阿托伐他汀对老年亚临床动脉粥样硬化患者单核细胞环氧化酶2活性的影响
目的 探讨阿托伐他汀对老年亚临床动脉粥样硬化患者单核细胞环氧化酶2活性的影响.方法 采用高分辨超声检测技术,筛选在我院体检的老年亚临床动脉粥样硬化患者48例(亚临床组),并选择体检正常者48例(对照组).采用逆转录聚合酶链反应的方法,检测所有研究对象外周血单核细胞环氧化酶2的表达,同时观察亚临床组单核细胞在不同浓度阿托伐他汀干预24 h后环氧化酶2表达的变化.结果 亚临床组空腹血糖、收缩压、舒张压、LDL-C、吸烟指数、环氧化酶2mRNA表达较对照组明显增高,HDL-C较对照组明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01).不同浓度阿托伐他汀明显抑制老年亚临床动脉粥样硬化患者外周血单核细胞环氧化酶2mRNA表达,且呈浓度依赖性(P＜0.05).结论 阿托伐他汀通过降低外周血单核细胞环氧化酶2的表达,在老年亚动脉粥样硬化患者发挥调脂外的抗炎作用.
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心外膜脂肪脂联素水平与冠状动脉病变程度的关系
目的：探讨冠心病患者心外膜脂肪脂联素水平与冠状动脉病变程度的关系。方法选择冠心病及心脏瓣膜病手术患者168例，分为冠心病组86例和瓣膜病组82例，同时冠心病组按冠状动脉病变程度积分分为＜30分23例、30～90分35例、＞90分28例，分别采集患者的心外膜脂肪及血清标本，采用酶联免疫法及RT‐PCR分别测定血清脂联素及脂肪脂联素mRNA的表达。结果冠心病组血清脂联素低于瓣膜病组[（9．1±3．1）mg／L vs （13．5 ± 3．9）mg／L ，P＜0．05]，冠心病组积分＜30分、30～90分、＞90分患者血清脂联素分别为（12．3±4．8）mg／L、（9．1±4.5）mg／L和（7．2±5．1）mg／L ，差异有统计学意义（P＜0．05）。与瓣膜病组比较，冠心病组心外膜脂肪脂联素mRNA表达降低（P＜0．05）。结论老年冠心病患者随冠状动脉病变程度加重，血清及心外膜脂肪脂联素水平下降。
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SORL1基因表达与阿尔茨海默病关系的研究
目的 研究中国汉族人迟发散发型阿尔茨海默病(sporadic Alzheimer's disease,SAD)外周血SORL1 mRNA的表达,为临床诊断提供依据.方法 选择迟发SAD患者23例(SAD组),根据WHO疾病分类第10修订版临床诊断标准为迟发SAD,另选健康体检者12例(对照组).分离2组外周血白细胞,提取总RNA,反转录合成cDNA,采用实时荧光定量PCR检测,以SORL1和磷酸甘油醛脱氢酶的mRNA含量比值作为评价SORL1 mRNA表达水平的指标,并计算出待测样本中SORL1 mRNA表达的准确含量.结果 SAD组外周血SORL1 mRNA表达明显高于对照组,差异有统计学意义(1.17±0.33 vs 0.39±0.29,P＜0.01),与性别、年龄无明显相关性.结论 汉族人外周血SORL1 mRNA表达水平与迟发SAD密切相关;通过实时荧光定量检测外周血SCIRL1 mRNA表达,对迟发SAD早期诊断可起到辅助的指导作用.
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人脐静脉内皮细胞衰老过程中细胞膜钠泵α亚单位基因表达的变化
目的 探讨体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)衰老过程中,细胞膜表面钠泵α亚单位各异构体基因表达的改变.方法 提取原代HUVEC,体外传代培养,第1代起分组干预.实验分对照组(未干预)和干预组(D-半乳糖10 g/L干预),按细胞传代的不同代数,观察第2、5和8代细胞形态,于不同群体倍增数(PD)行β-半乳糖苷酶染色初步判定细胞衰老,利用免疫细胞荧光染色法、实时定量PCR法和Western blot法检测各组细胞膜表面钠泵α1、α2、和α3亚单位mRNA及蛋白的表达水平.结果 钠泵α1、α2和α3亚单位mRNA及蛋白表达水平随PD增加而降低(P＜0.01);与对照组比较,干预组同一PD钠泵α2和α3亚单位mRNA和蛋白表达降低(P＜0.01),而2组α1亚单位表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论 细胞膜表面钠泵α亚单位mRNA及蛋白表达水平的失衡,可能是HUVEC复制性衰老的分子机制之一;D-半乳糖诱导可能构建HUVEC亚急性衰老模型.
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脑卒中后抑郁大鼠海马和丘脑神经生长因子及其受体的表达变化
目的 探讨脑卒中后抑郁(post stroke depression,PSD)大鼠海马和丘脑神经生长因子(nerve growth factor,NGF)及其高亲和力受体TrkA mRNA和蛋白的表达变化.方法 选择健康成年SD大鼠52只,随机分为对照组、抑郁组、脑卒中组和PSD组,每组13只.应用RT-PCR检测各组大鼠造模后第29天海马及丘脑NGF和TrkAmRNA的表达变化;利用免疫组织化学方法检测各组大鼠海马及丘脑NGF和TrkA免疫阳性细胞数的表达变化.结果 各组海马及丘脑均有NGF和TrkA mRNA的表达.PSD组海马NGF mRNA表达较对照组明显降低(0.646±0.264 vs 0.956±0.263,P＜0.05);各组TrkA mRNA在海马的表达无统计学差异(P＞0.05);各组丘脑NGF和TrkA mRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05).PSD组海马NGF阳性细胞较对照组明显减少[(14.46±2.64)个vs (19.56±2.63)个,P＜0.05];各组丘脑NGF阳性细胞差异无统计学意义(P＞0.05);各组海马TrkA阳性细胞及丘脑TrkA阳性细胞数无统计学差异(P＞0.05).结论 PSD大鼠海马NGF mRNA及蛋白表达减少可能与PSD发病相关.
