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人类间隙连接蛋白CX58基因的克隆
目的利用同源性分析,克隆定位新的人类间隙连接蛋白基因,并探讨该基因和遗传性耳聋的关系.方法将小鼠Cx57基因的编码区与美国国家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)的表达序列标签数据库(database of expressed sequence tags, dbEST）进行BLAST（basic local alignment search tool）分析，在得到的代表人类新基因的EST序列构建重叠群上设计引物CX58F1/CX58F2和CX58R1/CX48R2分别与cDNA文库及Ready cDNA载体臂上引物行巢式聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）,末端快速扩增（rapid amplification of cDNAends,RACE）,获得cDNA后与大规模测序结果经较，定位该基因，并在常染色体显性遗传性耳聋家系中进行突变分析。结果将利用同源性分析得到的9个人类新的EST，构建重叠群设计引物行巢式PCR、RACE，在肝、肾的Ready cDNA文库中得到1个全长cDNA并命名为CX58。通过与大规模测序结果比较，将该基因定位于1p32.3-p34.1。12个常染色体显性遗传性耳龙家系中未检测到突变。结论通过同源性分析，我们克隆定位了1个新的人类间隙连接蛋白基因CX58。该基因突变可能不是引起常染色体显性遗传性耳聋的常见原因或与该病无关。
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HCV基因同源性分析在输血后丙型肝炎因果关系鉴定中的初步应用
目的在输血后丙型肝炎因果关系鉴定中初步应用HCV基因同源性分析方法,为确定HCV传播途径,有效指导丙型肝炎的预防和控制提供依据.方法使用RT-PCR、限制性酶切长度多态性(RFLP)分析和序列测定等方法,对2名输血相关丙型肝炎患者和献血者感染的HCV中包含2个高变区在内的包膜(E1和E2/NS1)区基因片段同源性进行了分析.结果一名患者与献血者体内HCV同源性为99.21%以上,其同源性显著超过与无关者体内HCV的同源性,证实该病例为输血后丙型肝炎;另一名患者由于在相关献血者的HCV RNA的检测中出现了相互矛盾的结果,其所患丙肝与输血的关系有待进一步探讨.结论使用同源性分析方法能初步鉴定不同来源的病毒,能为正确诊断输血后丙型肝炎提供参考依据.
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RhD抗体ssDNA适配体结构分析
目的 预测RhD抗体核酸适配体序列库中优势适配体,为实验室验证做准备.方法 对以RhD抗体为目标靶分子而筛选出的适配体序列库做克隆测序;使用Clustal Ⅹ软件对阳性克隆子序列做同源性分析;使用DNAfolding form在线分析工具对阳性克隆子碱基序列做小自由能及二级结构分析.结果 RhD抗体28个阳性克隆子碱基序列按照基序的不同可分为3个家族,家族1和2中的适配体又可分为不同的亚家族;可形成由2-4个多分支环组成的二级结构,小自由能在(-7.47--5.09)kcal/mol.结论 RhD家族1中的亚家族3和4适配体二级结构较为稳定,小自由能较低,是RhD抗体适配体库中的优势适配体.
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不同血清型变形链球菌表面蛋白可变区(extended-V)的同源性分析
目的 分析不同血清型变形链球菌表面蛋白可变区(extended-V)的基因及蛋白质的同源性,探讨该区在防龋疫苗研制中的作用.方法 以变形链球菌血清型c、d、f、g参考株及部分c型临床株为模板,PCR扩增SrV+区片段,通过内切酶Dde Ⅰ进行限制性片段长度多态性分析并测序,将其测序结果在NCBI服务器上用blastn搜索软件进行同源性比较.结果 在相同条件下血清c、f型菌株均扩增出约1.13 kb左右的片段,酶切后出现5种基因型(A、B、C、D、E).选取所占比例较多的A、B、C型代表株进行测序,经比较显示其基因型间的同源性达92%-98%.血清d、g型无扩增产物,将g型6715表面蛋白SpaA全片段基因同OMZ175的产物序列在blastn上进行比较,有3个大小不一的片段出现同源性;血清d型OMZ176的表面蛋白基因序列在GeneBank上未能查出,故无法比较,但其相应蛋白质的同源性也在77%-82%之间,显示出相当高的同源性.结论 就c、f型菌株来说,可以将该区纳入疫苗的研究范畴;d、g型虽未能扩增出相应产物,但其基因还是存在部分区域的相似性,且其蛋白质同源性很高,也可以考虑利用d、g型上同c、f型共有的某些肽段进行疫苗的研制.
关键词： 变形链球菌 血清型 extended-V区 同源性分析 -
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合菌鉴定及同源性分析中的应用
目的 评价基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对我院血流感染样本中醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合菌的鉴定及同源性分析中的应用.方法 收集2011年4月-2015年4月我院非重复血流感染标本,对VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定仪初步鉴定为醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合菌的菌株,开展基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定,用MALDI-Biotyper软件和ERIC-PCR进行同源性分析,并用16S rRNA及recA基因测序技术进行验证.结果 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对20株VITEK 2无法鉴定到种的醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合菌展开了有效的鉴定,其中9株为医院不动杆菌(Acinetobacternosocominalis),11株为皮特不动杆菌(Acinetobacter pittii),两种细菌的质谱图中均含有特异性的峰图,能有效地将两类细菌进行区分.同源性分析结果将菌株分为2大簇(Ⅰ型11株,Ⅱ型9株),Ⅱ型又分为3小簇(Ⅱa4株,Ⅱb3株,Ⅱc2株).Ⅰ型、Ⅱ型分布在我院4个病区.结论 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合菌鉴定方面具有精准、快速的优点,可以鉴别出皮特不动杆菌和医院不动杆菌,MALDI-Biotyper软件进行同源性分析十分便捷.
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成都市售辣椒中产黄曲霉毒素菌株的分离及其基因分析
目的 从成都市售辣椒粉中,分离产黄曲霉毒素的菌株,探究产毒基因aflR、omt-1和ver-1与产黄曲霉毒素B1 (AFB1)能力的关系.方法 采用传统培养法分离菌株,多重PCR方法筛查潜在产黄曲霉毒素菌株,对潜在产黄曲霉毒素菌株进行产毒培养,以ELISA方法检测潜在产毒株7d产毒培养液中AFB1含量;同时基于潜在产毒株的产毒关键基因aflR、omt-1和ver-1构建系统进化树,分析其同源性.结果 64份辣椒样品中,分离到17株潜在产AFB1的黄曲霉菌株,有11株分离株产毒,产毒黄曲霉分离率为64.71％;且基于aflR、omt-1和ver-1基因与产毒标准菌株有较高同源性;有6株分离株不产毒,与米曲霉序列有较高同源性.结论 控制黄曲霉污染是黄曲霉控制中重要的环节之一.并非含有产毒基因的黄曲霉都会产AFB1毒素,产AFB1能力与产毒基因aflR的序列有着直接联系,而AFB1合成量的高低与omt-1和ver-1基因有关.
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藏羚羊α-珠蛋白基因编码区的克隆及同源性分析
目的:克隆藏羚羊α-珠蛋白基因编码区, 并进行同源性分析.方法:从藏羚羊肝组织中提取总RNA, 通过RT-PCR获得藏羚羊α-珠蛋白cDNA, 将其与pGEM-T Easy载体连接, 构成重组质粒, 并转化大肠杆菌TOP10扩增培养后, 鉴定阳性质粒并进行测序.将测序的结果与NCBI 数据库进行同源性比较.结果:获得α- 珠蛋白编码区cDNA序列, 提交GenBank数据库并取得注册号为DQ650713.与绵羊α-珠蛋白基因相比较, 其在16、53、132、134处出现核苷酸密码子突变(GAC→GGC)、(TCG→TCC)、(AGC→GGC)、(AAC→GC).推导的氨基酸序列比较发现,132位的天冬酰胺酸(Asn)突变为丝氨酸(Ser), 134位的丝氨酸(Ser)突变为甘氨酸(Gly);与人类的α-珠蛋白相比较, 有19处的氨基酸发生改变.结论:成功地克隆出藏羚羊α-珠蛋白基因编码区, 为高原低氧适应相关基因的研究提供了实验依据.
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临床血流感染沙门菌的分型及同源性与耐药性分析
目的 探讨临床血液感染沙门菌血清分型、基因同源性及耐药质粒和细菌耐药性的关系.方法 收集武汉大学中南医院2015～2017年临床血流感染分离的10株沙门菌.采用法国梅里埃Vitek 2 Compact全自动鉴定药敏检测系统进行鉴定和药敏实验,按国家标准对沙门菌进行血清学分型,用肠杆菌科基因间重复序列的聚合酶链反应(ERIC-PCR)对其进行基因分型,采用Cluster 3.0软件对PCR扩增产物进行聚类分析.结果 10株沙门菌分为3种血清群,A群1株,B群3株,D群6株,D群是优势血清群,约占60.0％;10株沙门菌中2,3,4,5和8号菌株含有质粒,不含质粒的是1,6,7,9和10号菌株;10株沙门菌对氨苄西林耐药率为80.0％,左氧氟沙星中介率80.0％,对三、四代头孢及碳青霉烯类100.0％敏感,对复方磺胺类敏感率为80.0％;4号和10号菌株、8号和9号菌株的同源性超过80.0％,1号和2号,5号和6号菌株的同源性大于70.0％.结论 沙门菌存在耐药质粒,质粒的多少表明耐药程度的高低;沙门菌对氨苄西林及氨苄西林/舒巴坦耐药率较高,对头孢他啶敏感率高,因此治疗血流感染时可选用三、四代头孢或亚胺培南,采用降阶梯治疗.
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2012～2016年广东省中山社区鼠伤寒沙门菌同源性分析及对喹诺酮类药物耐药机制研究
目的 研究广东省中山社区鼠伤寒沙门菌(STM)的同源性及对喹诺酮类药物的耐药机制.方法 收集中山大学附属中山医院2012年3月～2016年12月临床分离鼠伤寒沙门菌78株(排除同一病人重复送检菌株).通过琼脂稀释法检测鼠伤寒沙门菌对喹诺酮类药物的敏感度;脉冲电场凝胶电泳(PFGE)方法分析耐药菌株的同源性;使用PCR和DNA测序法分析gyrA,gyrB,parC和parE基因喹诺酮耐药决定区(QRDRs)的突变;PCR检测质粒介导喹诺酮类药物耐药基因qnr(qnrA,qnrB,qnrS,qnrD)和aac(6')-Ib-cr.结果 33株鼠伤寒沙门菌对环丙沙星产生耐药.33株鼠伤寒沙门菌共产生33种不同的PFGE图谱,相似度小于90％.29株耐药株gyrA位点发生单突变导致在第83或87位存在唯一氨基酸替代,其中第83位突变率占93.1％(27/29).4株喹诺酮高耐药菌株的gyrA同时存在83和87号位双突变导致两个氨基酸发生替代,其中2株菌额外出现parC基因单碱基突变导致第80号位出现氨基酸替代.所有菌株中均未检测到qnr基因,但有15株鼠伤寒沙门菌检出aac-(6')-Ib-cr基因.结论 中山社区鼠伤寒沙门菌对喹诺酮类药物耐药性较高,主要机制是gyrA基因的单突变和携带aac-(6')-Ib-cr耐药基因.
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耐亚胺培南的肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因检测及其同源性分析
目的 了解南京市鼓楼医院碳青霉烯酶在耐亚胺培南的肺炎克雷伯菌中的分布情况,并进行其同源性分析.方法 收集耐亚胺培南的肺炎克雷伯菌34株,K-B纸片法测定菌株对药物的敏感性;采用改良Hodge试验及EDTA协同试验进行A,B类碳青霉烯酶初筛试验;PCR法扩增碳青霉烯酶基因并进行序列分析,ERIC-PCR后进行同源性分析.结果 34株肺炎克雷伯菌对β-内酰胺类抗生素呈现泛耐药现象,耐药率达100％,仅对丁胺卡那、复方新诺明、左氧氟沙星敏感性相对较高,分别为17.6％,50％和23.5％.ERIC分析结果显示34株菌株主要分为两型,其中A型27株,B1型2株,B2型5株.结论 南京市鼓楼医院的肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素耐药的首要原因是产KPC-2酶.
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全长细粒棘球蚴95抗原基因的克隆及DNA疫苗的构建
目的：克隆分析新疆地区细粒棘球蚴95(Eg95)抗原全长基因的结构特点，并构建Eg95 DNA疫苗。方法：根据细粒棘球蚴95抗原基因序列设计PCR引物，应用PCR方法从新疆株细粒棘球蚴cDNA文库中克隆获得Eg95全长抗原目的基因。利用定向克隆技术将全长Eg95抗原基因片段克隆至真核表达质粒pcDNA3上，构建DNA疫苗pcDNA3-Eg95，测序确定基因碱基序列。利用DNAman软件及GeneBank／Blast功能，对其进行基因全序列分析及同源性比较。结果：从新疆株细粒棘球蚴cDNA文库中克隆出全长Eg95抗原基因。所克隆的全长Eg95抗原基因长度为471 bp，编码156个氨基酸。pcDNA3-Eg95阳性克隆均为正确连接全长Eg95抗原基因的重组质粒，可作为DNA疫苗作进一步的研究。新疆株全长Eg95抗原基因与GeneBank中已登录的新西兰株Eg95抗原基因序列一致。结论：成功克隆并构建了新疆株全长细粒棘球蚴95抗原基因DNA疫苗。
关键词： 细粒棘球蚴95(Eg95)抗原基因 DNA疫苗 同源性分析 -
SARS冠状病毒刺突蛋白编码基因及氨基酸序列的同源性分析
①目的分析严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒刺突蛋白(S蛋白)编码基因及氨基酸序列的变异情况,并在GenBank中寻找其同源序列.②方法将网上公布的具有全基因序列的12株SARS冠状病毒S蛋白的编码基因序列及氨基酸序列应用Clustal W方法对排分析变异情况,并应用GenBank的Blast对排功能寻找被GenBank收录的同源序列.③结果 SARS冠状病毒S蛋白相对比较保守,变异率较低,其氨基酸序列与鼠的肝炎病毒氨基酸序列有较高的同源性,某些核苷酸序列与人的基因组有同源性.④结论 S蛋白编码基因及氨基酸序列相对保守,为预防性疫苗的研发提供了可行性;据其同源基因及蛋白序列可以预测S蛋白的二、三级结构,对推测SARS可能的发病机制有积极作用.
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一株引起病毒性脑炎的柯萨奇B组5型病毒全基因组分析
目的 对一株病毒性脑炎病原柯萨奇病毒B5 (coxsackievirus B5,CV B5)分离株KMA2/YN/CHN/2010的全基因组及其遗传特性进行分析.方法 对297份病毒性脑炎患者脑脊液在RD细胞进行病毒分离;提取病毒RNA,采用RT-PCR移步法分段扩增CV-B5全长基因,经测序和拼接后,利用MEGA7.0和SimPlot 3.5.1等软件进行分析.结果 通过分离获得一株阳性分离株,经鉴定为CV-B5 KMA2/YN/CHN/2010株,其基因组全长为7 395 bp,编码含2 185个氨基酸残基的多聚蛋白.与其他CV B5病毒分离株的全基因组的核苷酸和氨基酸同源性分别为79.6％～98.8％和93.1％～98.1％;KMA2/YN/CHN/2010与其他CV-B5株在各区段核苷酸和氨基酸同源性分别为75.0％ ～ 100.0％和88.8％～ 100.0％.其中与A210/KM/09株同源性高.进化分析发现CV B5分4个基因型,KMA2/YN/CHN/2010属于C基因型.通过重组分析发现KMA2/YN/CHN/2010可能为重组株.结论 KMA2/YN/CHN/2010与其他中国株一样同属于C基因型.
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8株霍乱弧菌耐药状况及RAPD同源性分析
目的 分析蚌埠市2010年霍乱弧菌对抗生素的敏感性和同源性,为霍乱防控提高依据.方法 选取2010年安徽省蚌埠市O1/O139群霍乱病例分离株8株,采用WHO推荐的改良Kirby-Bauer纸片法,分析霍乱弧菌对15种抗生素在体外的药物敏感性；应用随机引物扩增多态性(RAPD)技术对其作分子流行病学分型和同源性分析.结果 所有O1/O139群霍乱弧菌对氨苄西林、头孢唑啉、丁胺卡那、庆大霉素、舒普生、氧哌嗪青霉素、头孢曲松、亚胺培南均100％敏感,对复方新诺明、四环素、强力霉素均100％耐药.O139群霍乱弧菌在氯霉素、诺氟沙星、环丙沙星等的敏感度上与O1群霍乱弧菌有一定的差异.根据随机扩增多态DNA聚类分析可以将检出的O1/O139群霍乱弧菌分为2个型别.结论 O139群霍乱弧菌耐药率较O1群霍乱弧菌高,应根据不同菌型选择相应的抗生素药物进行治疗.分离的O1群霍乱弧菌有同源性.
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奥尔森派琴虫和北海派琴虫ITS基因测序及同源性分析
通过设计能扩增奥尔森派琴虫和北海派琴虫ITS序列的特异性引物，对我国东南沿海8个地区养殖牡蛎中常见的两种派琴虫相应基因进行扩增、克隆和测序，并进行同源性分析。国内不同地区奥尔森派琴虫ITS序列的同源性超过99.3%，与国外分离株的同源性也在98.8%以上；种间同源性分析发现，奥尔森派琴虫与海水派琴虫和P.honshuensis的同源性较高，分别为94.2%和95.0%，与P.qugwadi的同源性低，仅62.9%。深圳和三亚分离的北海派琴虫ITS序列有18个碱基存在差异，其中ITS-1有3个碱基差异，ITS-2有15个碱基差异，而5.8S高度保守，没有碱基差异；北海派琴虫与其他种类之间的差异主要表现在ITS-1和ITS-2区域；同源性比较发现，北海派琴虫的同源性在100%-97.9%之间，其中深圳北海派琴虫的同源性较低，为97.9%。种间同源性分析表明，北海派琴虫与奥尔森派琴虫的同源性较高，为89.4%，其次为海水派琴虫和P.honshuensis，与P.qugwadi同源性低，仅71.9%。
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多重耐药鲍曼不动杆菌的耐药性和同源性分析
目的:研究大连地区多药耐药鲍曼不动杆菌的耐药性并对其进行同源性分析.方法:纸片扩散法测定110株鲍曼不动杆菌对12种抗菌药物的药物敏感性,应用肠杆菌科基因组内重复序列ERIC-PCR进行同源性分析.结果:鲍曼不动杆菌对头孢菌素类、氨基甙类、喹诺酮类和β-内酰胺类等抗菌素均显示出高水平的多重耐药性,对亚胺培南的耐药率高达87.27％；110株鲍曼不动杆菌来自18个不同克隆株,其中第二孔道菌株为流行株,有51株为该菌株,占实验总菌数的46.36％,并且分离自多个病区的多种标本,其它菌株散在分布.结论:多重耐药的鲍曼不动杆菌具有高度同源性.
