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云南省西南边境登革2型病毒全基因组序列特征研究
为阐明云南省西南边境地区登革2型病毒(DENV-2)流行株的全基因组序列特征及流行病学特点,采用C6/36 细胞培养法分离病毒,用RT-PCR法扩增新分离DENV-2的全基因组序列,采用ClastalX1.83和MEGA6等生物信息学软件进行核苷酸同源性及系统进化分析.结果从登革热患者血清中分离到10株DENV-2,其中德宏州瑞丽市6株(2013年3株和2015年3株),西双版纳州景洪市2015年4株.经RT-PCR和序列测定,获得这10株DENV-2的全基因组序列.基于结构蛋白和非结构蛋白基因的系统进化和同源性分析表明,这10株病毒中5株为亚洲基因Ⅰ型(Asian Ⅰ Genotype,AG-Ⅰ),5株为全球基因型(Cosmopolitan genotype,CG).其中2013和2015年瑞丽流行株均为AG-Ⅰ,景洪市2015年流行株均属CG,它们均与东南亚相同基因型流行株具有较高的同源性和较近的亲缘关系.云南株与DENV-2原型株(New Guinea-C)的E和NS5基因核苷酸同源性分别为93.38%~93.77%和92.80%~94.74%.所有云南株和东南亚参考株与New Guinea-C株在结构蛋白或非结构蛋白的氨基酸位点均存在一定程度的改变.本研究证实,云南省西南边境地区存在DENV-2两种基因型流行,瑞丽和景洪流行株分别为AG-Ⅰ和CG,但它们的输入来源均为相邻东南亚国家.云南株与DENV-2原型株New Guinea-C株间存在明显差异,但决定病毒抗原、致病性和毒力的关键位点未发现明显变化.
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白纹伊蚊基因组中CYP6家族新成员基因片段的克隆与分析
目的：获得白纹伊蚊CYP6基因家族中新成员的基因片段。方法：根据家蝇CYP6A1、CYP6D1以及致倦库蚊CYP6E1同源区氨基酸序列，设计1对简并引物，分别以白纹伊蚊敏感品系和抗性品系基因组DNA为模板进行PCR，产物经T-A克隆转化至JM109大肠杆菌中，经筛选后测序，获得与设计的细胞色素P450基因片段大小相符合的5个基因片段，并将推导的氨基酸序列进行同源性分析。结果：在白纹伊蚊敏感品系中获得了2个基因片段(AEDG-S1，AEDG-S2)，核苷酸序列长度分别为240bp和236bp；在白纹伊蚊溴氰菊酯抗性品系中获得了3个基因片段(AEDG-R2，AEDG-R3，AEDG-R4)，核苷酸序列长度分别为236bp、236bp和239bp。所得序列与昆虫CYP6家族的同源性在23.1%～53.8%之间，与CYP3家族的同源性在25.6%～43.9%之间，而与CYP4家族同源性较低，为13.9%～24.4%。结论：所得5个序列为CYP6家族中5个新成员的基因片段。
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手足口病病毒EV71衣壳蛋白VP1基因特征分析
目的 分析幼童手足口病病毒EV71衣壳蛋白VP1基因特征,为手足口病临床预防和控制提供指导.方法 随机收集604例手足口病幼童患者标本,培养病毒株并分离鉴定.采用RT-PCR扩增EV71及其VP1区基因,经基因产物测序分析毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性.结果 604例手足口病幼童患者标本中,男性患者369例(61.09％)和女性235例(38.91％);(34.60％).1～岁179例(29.64％),2～岁216例(35.76％)和3～岁209例(34.60％).共分离出病毒129株,分离率21.36％,其中EV71 61株(占47.29％),CoxA16 28株(占21.71％),其他肠道病毒40株(占31.01％).61株EV71的VP1区基因序列间核苷酸同源性95.7％～100.0％,氨基酸同源性97.3％～100.0％.与C4a亚型代表株的核苷酸同源性96.4％～98.9％,氨基酸同源性99.0％～100.0％.与CoxA16原始株G-10、A、B基因型代表株VP1区以及C4b、C5亚型代表株的核苷酸同源性分别为66.0％～68.9％、78.6％～82.8％、83.2％～85.5％、95.2％～97.4％和84.5％～87.6％,氨基酸同源性分别为71.4％～75.7％、90.5％～93.6％、95.1％～96.0％、99.0％～99.8％和97.6％～99.4％.结论 手足口病发病以3～4岁男性幼童为主,且以EV71为主.所分离的EV71流行株属于C4亚型.
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云南省卵形疟原虫的实验室诊断研究
目的 通过实验室综合诊断一例卵形疟原虫感染,为云南省鉴别当地罕见疟原虫虫种提供借鉴. 方法 对一例尼日利亚务工回国疟疾病例采血,制作厚、薄血涂片,经Giemsa染色后在油镜下观察薄血膜疟原虫形态,鉴定虫种.针对P.v、P.f、P.m、P.o4种疟原虫的18S rRNA基因进行巢式PCR扩增并测序,在GenBank分别与P.f的M19172和P.o的KC866363、HQ697267、KF192072、KF192073、KJ871672、AF145337、KC633223、L48987参比虫株进行Blast比对,应用MEGA5.1软件进行DNA序列同源性比较并绘制系统进化树. 结果 显微镜下可观察到成熟度各异的卵形疟原虫滋养体和裂殖体,薄血膜中被寄生的红细胞大小正常或稍胀大,变形,边缘呈伞矢状或锯齿状,并有凹凸、拖尾、毛刺等卵形疟特征性形态,经巢式PCR扩增出约800 bp的卵形疟特异性基因片段,经Blast比对与GenBank中已知卵形疟部分参比虫株18S rRNA的同源性为89％～91％. 结论 经镜检、巢式PCR、测序及同源性分析,基本证实该例自尼日利亚务工回国的疟疾病例为卵形疟原虫感染.
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实时荧光RT-PCR法快速检测三带喙库蚊中的流行性乙型脑炎病毒
目的：从四川省成都地区采集三带喙库蚊样品，快速检测蚊虫中的流行性乙型脑炎病毒（JEV），并确定JEV基因型别。方法采用实时荧光RT?PCR方法检测蚊体内的JEV。利用一步法RT?PCR试剂盒扩增阳性样品PrM区段特异性核苷酸序列，测序后应用Clustal X1.83和Mega 5.0软件构建系统进化树，并进行基因分型和同源性分析。结果2012年采集三带喙库蚊雌蚊10656只，分为219份，检测出7份JEV阳性核酸样品，阳性率为3.2%。扩增PrM区域特异性核苷酸序列674 bp，经鉴定均为基因Ⅰ型。与国内外部分GⅠ型的相关序列比较，核苷酸同源性为91.5%～100%，氨基酸同源性为94.9%～100%，其中与四川省SC09-X08株同源性高。结论实时荧光RT?PCR法能快速检测三带喙库蚊中的JEV，成都地区存在基因Ⅰ型JEV流行。
关键词： 三带喙库蚊 流行性乙型脑炎病毒 实时荧光RT-PCR 基因分型 同源性分析 -
1例手足口病患者及其密切接触者的病原检测与序列分析
目的 对山东省济宁市手足口病患者及其接触者标本进行病毒分离以及基因组序列测定与分析,捕捉病毒在传播过程中的变异情况.方法 使用RD细胞分离病毒,通过8对位于保守区的首尾重叠的全序列扩增引物进行扩增和序列的测定与拼接,并对全基因序列以及氨基酸序列与肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)各亚型标准株进行同源性分析以及遗传进化分析.结果 自1例患儿及其密切接触者各分离得到1株EV71分离株,分别命名为SDJN2015-01和SDJN2015-01.1;同源性分析显示分离到的两株病毒与C4a亚型株EU703813同源性高;遗传进化分析显示两株病毒同属于C4a亚型.序列比对发现,两株病毒共存在12个核苷酸的差异,导致6个氨基酸的差异,分别为VP1区K98E(全编码区为K663E)和A133T(A698T)以及2C区D48N(D1159N)、V126I(V1237I)、I238V(I1349V)和N314Y(N1425Y).结论 SDJN2015-01和SDJN2015-01.1株同属EV71C4a亚型,其与C4a亚型标准株EU703813具有高度同源性;两株病毒间在VP1和2C区产生的氨基酸的变异对病毒毒力以及感染能力是否有影响有待进一步研究.
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医院感染中产ESBLs大肠埃希菌基因型及同源性研究
大肠埃希菌是目前院内感染的主要病原菌之一，其与腹腔感染、尿路感染、伤口感染及血流感染等多种感染相关。由于广谱抗菌药物，尤其是三代头孢菌素的滥用及不合理使用，产超广谱β-内酰胺酶( ESBLs)大肠埃希菌检出率不断增高，给临床治疗带来很大困难。本研究同时分析采自我院患者和医院环境样本，采用多重 PCR 的方法对试验菌株ESBLs基因 TEM、SHV、OXA、PER、VEB、GES、CTX及β-内酰胺酶基因AmpC进行扩增，确定基因型；脉冲场凝胶电泳技术( PFGE)对患者菌株和环境标本菌株进行同源性分析，以追踪传染源和传播途径。
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脑膜败血金黄杆菌产金属β-内酰胺酶的检测及基因型的研究
目的 了解杭州市脑膜败血金黄杆菌的流行及产金属β-内酰胺酶的情况并对其基因型进行研究.方法 对100株分离自4所综合性医院的多重耐药脑膜败血金黄杆菌,用三维试验、改良三维试验和2-巯基丙酸抑制试验检测金属β-内酰胺酶,用blaB和GOB的通用引物对表型试验阳性的菌株进行聚合酶链反应(PCR)和测序分析金属β-内酰胺酶的基因型.并用脉冲场凝胶电泳对其中的菌株进行同源性分析.结果 用三维试验、改良三维试验和2-巯基丙酸抑制试验检测到61株菌株产金属β-内酰胺酶,用blaB和GOB通用引物进行扩增和测序,有60株菌株扩增到金属β-内酰胺酶,其中有51株检测到blaB基因型,有36株检测到GOB基因型.检测到的blaB基因型主要为blaB-1、2、3、5和blaB-11这5种类型;检测到的GOB基因型主要为GOB-1、2、4、6和GOB-8这5种类型.其中产生一种金属β-内酰胺酶的有33株,产两种金属β-内酰胺酶的有27株.浙江大学医学院附属第一医院和附属第二医院主要是blaB-3和blaB-11型为主,邵逸夫医院主要是GOB-4和GOB-8为主,杭州市中医院主要是GOB-8基因型.其中1菌株表型试验检测阳性而未能检测到基因型,可能为一种新的基因型,有待以后进一步研究.菌株经同源性分析,杭州市中医院的菌株具有很好的一致性,而与其他医院的结果完全不同.结论 杭州市多重耐药的脑膜败血金黄杆菌的耐药机制证实携带的金属β-内酰胺酶基因型主要为blaB和GOB型,4所医院流行的基因型均不相同.而从PFGE结果分析中医院的脑膜败血金黄杆菌具有一定的同源性,有别于其他3所医院,可能为院内感染菌.
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幽门螺杆菌lpp20基因的克隆及序列分析
幽门螺杆菌(Hp) lpp20基因编码Hp外膜上的一种相对分子质量约为18×103的脂蛋白(Lpp20).有研究表明,Lpp20具有良好的免疫原性和免疫保护性,是一种理想的疫苗候选抗原.本研究对Hp郑州分离株MEL-HP27 lpp20基因进行克隆和测序;通过对7株Hp lpp20基因的核苷酸序列及相应的氨基酸序列进行同源性分析,确定Hp lpp20基因的变异性.
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2008年广东省肠道病毒71型分离株全基因组核苷酸序列分析
目的 了解2008年广东省流行的肠道病毒(EV)71型基因特征.方法 选择2008年广东省分离的1株EV71毒株(GDFS-3),进行全基因组序列测定和基因进化特性的分析.结果 GDFS-3株与其他EV71型毒株相比,在编码区没有核苷酸的缺失和插入,其5'UTR和3'UTR的长度和序列有一定的差异.核苷酸同源性比较结果 表明,GDFS-3株与中国台湾流行株(TW984)的同源性高(为96.0%),与新加坡流行株SIN5865及标准株MS、BrCr的同源性则在81.0%左右.氨基酸同源性比较结果 表明,GDFS-3株与TW984同源件高(99.0%).根据VP1基因序列构建亲缘性关系树,GDFS-3株与C4亚型(subgenogroup)聚为一簇,与C4亚型代表株的核苷酸序列同源性为91.0%～95.0%.结论 遗传进化分析表明,GDFS-3株和中国台湾2004年流行的EV71毒株的亲缘关系为密切,属于C4亚型,而与标准株BrCr和MS的亲缘关系较远.5'UTR的突变对于EV71毒力增强可能有重要作用.上述结果 有助于EV71型的基础研究和中国对于EV71所致疾病的预防.
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浙江省首次发现新型布尼亚病毒感染病例及分离病毒分子鉴定
目的 了解浙江省是否存在新型布尼亚病毒潜在自然疫源地,分离疑似病例血清中新型布尼亚病毒并进行鉴定.方法 免疫荧光法检测浙江省台州地区野生啮齿动物不同组织标本中新型布尼亚病毒抗原.实时荧光定量RT-PCR检测疑似病人血清中新型布尼亚病毒核酸,扩增产物进行序列测定.Vero细胞分离疑似病人血清中新型布尼亚病毒,以新型布尼亚病毒株核衣壳蛋白编码基因为靶基因,采用RT-PCR及扩增产物测序对分离的疑似新型布尼亚病毒株进行鉴定,另对该序列进行同源性分析和比较.结果 70只野生啮齿动物中,免疫荧光法检测阳性率为5.71%.实时荧光定量RT-PCR检测结果显示,4例疑似病人血清中有两例检测结果阳性.1例阳性血清样本中分离出1株疑似新型布尼亚病毒,RT-PCR和测序结果证实该病毒确为新型布尼亚病毒,其核衣壳蛋白编码基因序列与湖北省新型布尼亚病毒分离株相似性高达92.2%,但与国内其他地区新型布尼亚病毒分离株序列差异较大.结论 首次证实浙江省存在新型布尼亚病毒自然疫源地及感染病人,不同群新型布尼亚病毒分布可能存在一定的地理差异.
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荧光原位杂交法检测双歧杆菌
细菌的分类鉴定按常规需通过细菌形态观察、菌壁成份分析和发酵产物的鉴定,以及遗传特征如DNA的G+C百分含量和DNA的同源性分析来完成.这些方法对于某些细菌尤其是那些目前尚无法培养的细菌鉴定并不理想.自从Delong等首次采用荧光素标记的寡核苷酸基因探针成功地对单个完整细胞进行分类鉴定以来,国外许多研究者对这种新方法作了各种尝试,从纯培养细菌到混合物中的细菌,原位荧光杂交法都获得了令人满意的效果.
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2017年深圳地区冬季诺如病毒基因分型与流行病学分析
目的 对深圳地区2017年冬季诺如病毒(Norovirus,NoV)流行株基因型、流行病学特点及同源性进行分析和研究.方法 通过提取313份粪便样品的核酸后利用NoV特异性引物进行逆转录PCR(RT-PCR),将阳性PCR产物测序.根据样品测序序列及NoV参考株序列,利用软件Mega 4.1及Clustal W构建系统发生树.结果 NoV阳性样品共26份且均为GⅡ.4型,分别与GⅡ.4(KY407156)、GⅡ.4(KY580757)及GⅡ.4(KX372682)具有较高的同源性.此外,88.46％ 的NoV样品与本地区历年流行株同源性较低,且46.15％ 与我国其他地区流行株存在差异.结论2017年冬季深圳地区诺如病毒流行株以GⅡ.4型为主,且其在流行性及同源性上具有自身的特点,在当地公共卫生工作中需加强关注.
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耐碳青霉烯类肠杆菌的同源性分析
目的 研究耐碳青霉烯类肠杆菌科的基因分型,为医院预防和控制耐碳青霉烯类肠杆菌的感染和暴发流行提供相关依据.方法 收集2012年1月—2016年11月山东省阳信县人民医院临床分离的89株耐碳青霉烯类肠杆菌,其中69株为肺炎克雷伯菌、20株为大肠埃希菌,建立肠杆菌基因间重复一致序列聚合酶链反应(ERIC-PCR)基因分型方法,进行分子流行病学研究.结果 ERIC结果显示,耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌分为7个基因型(E1～E7),重症医学科(ICU)和急诊科主要存在2个基因型(E3和E4);耐碳青霉烯类大肠埃希菌分为8个基因型(A1～A8),均散在分布于临床的各个科室.结论 本研究耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌主要分布于ICU和急诊科,耐碳青霉烯类肺炎克雷伯杆菌可能存在局部暴发流行的趋势.
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医务人员手与医院环境物体表面分离多重耐药菌的同源性分析
目的 调查医务人员的手及医院环境物体表面多重耐药菌的分布情况,并探讨多重耐药菌在医务人员的手与医院环境物体表面的同源性.方法 应用琼脂直接接触培养法,对来自4个科室的112名医务人员的手和120例医院环境物体表面采样,采用脉冲场凝胶电泳和多位点序列分型技术对分离出的耐药菌进行同源性分析.结果 所有送检标本中,分离出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(meticillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)、高水平庆大霉素耐药肠球菌(high-level gentamicin resistant Enterococcus,HLGR)和多重耐药鲍曼不动杆菌(multidrug-resistant Acinetobacter baumannii,MDRA)等多重耐药菌菌株.对MRSA和MDRA进行脉冲场凝胶电泳(pulse-field gel electrophoresis,PFGE)检测,发现多重耐药菌在医务人员手和医院环境物体表面存在同源性.同时,对MDRA进行多位点序列分型,发现其分型ST92同全球其他地区一致.结论 多重耐药菌在医务人员手和医院环境物体表面污染较严重,存在两者之间的交叉传播,应加强医务人员手卫生并提高医院环境物体表面的清洁.
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某院多重耐药鲍曼不动杆菌同源性研究
目的 研究某院某时间段内临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌(MDRAB)的同源性及β-内酰胺类耐药基因存在情况,探讨患者感染的临床特点及感染危险因素.方法 采用VITEK2全自动微生物仪对2013年10～12月某院临床分离的15株MDRAB进行细菌鉴定和药敏试验,部分抗菌药物的敏感性采用纸片扩散法.采用脉冲场电泳(PFGE)来检测MDRAB的同源性,用PCR法检测β-内酰胺类耐药基因,对部分阳性基因进行测序.结果 15株MDRAB中,PFGE谱型有2种(A和B),β内酰胺类耐药基因OXA23qc、OXA51、OXA64gp组基因都阳性,6株(6/15) TEM基因阳性.14株(14/15) MDRAB的标本分布在ICU重症监护病房,1株(1/15)标本分布在神经外科病房.所有标本来源于痰液.15例感染或定植MDRAB的患者中,14例(14/15)接受气管插管,其中7例(7/15)行气管切开.结论 某院某段时间内ICU重症监护病房存在MDRAB克隆株流行,应进一步加强感染控制.
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肝移植术后感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的随机扩增多态性DNA分析
肝移植术创伤及免疫抑制剂使用等是术后易发生感染的原因,其术后感染发生率高达37%～86%[1].国内外大量研究均表明金黄色葡萄球菌(SA)是肝移植术后感染的主要病原菌之一[2-4],且耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的检出率呈升高趋势.本研究分析肝移植术后感染SA的耐药性,用随机扩增多态性DNA技术(RAPD)对MRSA菌株进行同源性分析,可为预防与降低肝移植术后SA的感染,正确合理运用抗生素,制定有效控制医院感染措施提供依据.
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甲氧西林耐药溶血葡萄球菌耐药性及脉冲场凝胶电泳分型研究
甲氧西林耐药溶血葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus haemolyticus, MRSH)是目前临床常见的重要凝固酶阴性葡萄球菌,常呈多重耐药.特别是MRSH的流行,如得不到及时控制,病死率高.因此早期发现MRSH感染的流行极为重要.本研究采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术对我院临床分离的MRSH做同源性分析,为溶血葡萄球菌感染的防治提供基础.
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应用抑制性消减杂交技术筛选rhALR调节基因
目的:筛选与克隆重组人肝再生增强因子激活基因,了解其在体内的调节功能线索及机制.方法:应用大肠杆菌系统,表达、纯化重组人肝再生增强因子蛋白.刺激HepG2细胞,以溶剂PH7.8的磷酸盐缓冲液为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建重组人肝再生增强因子激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到30个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-1000 bp插入片段.对插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得19种编码基因,包括15种已知基因和4种未知基因.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、肿瘤免疫发生及物质代谢密切相关的蛋白编码基因,推测了重组人肝再生增强因子在体内可能存在的调控机制的线索,尚需进一步的实验证明.
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应用抑制性消减杂交技术克隆HBV全S蛋白反式激活蛋白1的反式激活基因
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)全S蛋白反式激活蛋白1(CSTP1)的反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HBV CSTP1反式激活相关基因.方法:以HBV CSTP1表达质粒pcDNA3.1(-)-CSTP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人HBV CSTP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到86个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到100-1000 bp插入片段.挑取25个含有插入片段的阳性克隆测序分析,获得23个已知基因序列和2个未知基因.未知基因的功能还正在研究中.结论:应用SSH技术成功构建了HBV CSTP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为进一步阐明HBV CSTP1反式调节的靶基因及致肝病发生的分子生物学机制提供理论依据.
