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铜绿假单胞菌耐药机制及中医药治疗研究进展
随着抗生素的不规范使用,近年细菌耐药率越来越高.临床尤以感染性疾病的多见病原菌——铜绿假单胞菌为突出,不仅是临床急危重症的棘手问题,也是国际医学界的难题和焦点.为此,作者综述了近5年来铜绿假单胞菌耐药机制研究进展,并对β-内酰胺酶、主动外排系统、密度感应系统等主要耐药机制着力阐述,进而阐释相关的中医药治疗措施,以期为抗生素治疗无果时探索中医药治疗思路提供依据.
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铜绿假单胞菌密度感应系统自体诱导因子3OC12-HSL对人肠道上皮细胞Caco-2凋亡的影响及其机制
目的 探讨铜绿假单胞菌密度感应系统自体诱导因子3OC12-HSL对肠道上皮细胞Caco-2凋亡的影响及其深入机制.方法 3OC12-HSL干扰Caco-2细胞4 h后,采用MTT法检测Caco-2细胞干扰前后细胞活性变化;Annexin V-FTTC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡率的变化;Western blot检测Caco-2细胞中凋亡相关蛋白p-p38/MAPK及NF-κB表达变化.结果 MTT结果 显示,3OC12-HSL可以抑制Caco-2细胞活性,并呈剂量依赖性(P<0.05).流式细胞术结果 表明,Caco2细胞凋亡率随3OC12-HSI干扰浓度增加而增加(P<0.05).Western blot结果 显示,3OC12-HSL处理后,细胞p-p38/MAPK及NF-κB蛋白表达水平增加.结论 3OC12-HSL可以抑制肠道上皮细胞Caco-2活性,诱导细胞发生凋亡,这种作用可能和p38/MAPK通路激活以及NF-κB的激活有关.
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铜绿假单胞菌密度感应信号分子OdDHL对小鼠肥大细胞作用观察
目的 通过化学合成铜绿假单胞菌密度感应(quorum sensing,QS)信号分子OdDHL,并观察该分子对小鼠肥大细胞生物学作用.方法 通过化学方法 合成OdDHL分子,经质谱、磁共振和高效液相色谱确定其结构和纯度,并采用OdDHL分子感应菌株检测其生物活性.以不同浓度OdDHL分子作用于小鼠肥大细胞系P815,观察不同时间点细胞活力改变、凋亡现象以及胞内钙离子变化.结果 成功合成具有生物活性的OdDHL分子,该分子能以时间、剂量依赖方式抑制细胞活力,并能诱导细胞凋亡,同时可上调胞内钙离子浓度.结论 铜绿假单胞菌OdDHL分子可诱导P815细胞凋亡并上调胞内钙离子浓度.
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红霉素对铜绿假单胞菌QS调控毒力因子的干预作用
目的 研究红霉素(ERY)对铜绿假单胞菌QS调控毒力因子分泌的干预作用.方法 弹性蛋白-刚果红法测定弹性蛋白酶活性；偶氮酪蛋白法测定蛋白水解酶活性；氯仿萃取法测定绿脓菌素；苔黑酚法测定鼠李糖脂；测定早期及成熟生物被膜细菌(BF)对H2O2敏感性.结果 ERY组弹性蛋白酶活性(0.03)、蛋白水解酶活性(0.37)、绿脓菌素浓度(0.06)、鼠李糖脂浓度(48.8μg/ml)均明显低于空白对照组(分别为:0.47、0.48、0.18、153.9 μg/ml)(P＜0.01),弹性蛋白酶活性、蛋白水解酶活性及绿脓菌素浓度高于PA-JP3株组(分别为:0.04、0.16、0.01)(P＜0.05),而鼠李糖脂浓度与PA-JP3株组(34.8 μg/ml)相当,ERY组(早期1.81cm,成熟期3.8cm)及PA-JP3株组(早期2.6 cm,成熟期2.87 cm)生物被膜细菌对H2O2敏感性高于空白对照组(早期1.36cm,成熟期1.44 cm)(P＜0.01).结论 红霉素可以抑制铜绿假单胞菌毒力因子的产生.
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细菌生物膜的形成及影响因素
1 细菌生物膜1.1 定义细菌生物膜(BF)是细菌为了适应生存环境黏附于非生物或活性组织表面,并包被于自身产生的黏液性不均一聚合基质中,形成一种与浮游细菌不同生长方式的细菌群,由细菌和自身分泌的胞外基质组成[1].
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细菌密度感应系统及其介导的信号传输
有关细菌信号机制研究有3个发展阶段,上世纪60年代以前,研究大都集中在对细菌本身的认识,主要是分析细菌自身理化和生物学特征;自从上世纪60年代发现细菌生物膜中的细菌能够随菌群密度改变而发生菌间信号交流的机制以后,有关细菌密度感应(quourm sensing)系统机制的研究方兴未艾.近年来,随着相关研究的不断深入,已经从同物种的细菌间密度感应信号机制研究扩展到了原核生物与真核生物细胞之间的跨物种信号交流机研究,这种跨越必然对揭示感染性疾病的发生发展机制、寻找抗菌新方法等具有深远意义.
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左氧氟沙星对铜绿假单胞菌密度感应系统及毒力因子的调控
目的：评价铜绿假单胞菌在亚抑制浓度（ SIC）的左氧氟沙星作用下毒力因子表型及基因表达的变化并探索其可能的调控途径。方法用临床标准菌株PAO1及其密度感应系统（ QS）的基因突变株，测定不同浓度下菌株生长曲线，以不影响细菌生长的高抗菌素浓度为亚抑制浓度。分别测定各菌株在SIC的抗菌素作用下生物膜形成、绿脓菌素和鼠李糖脂的变化。用实时定量聚合酶链式反应（ RT－PCR）测定菌株毒力蛋白编码基因以及QS基因在SIC的左氧氟沙星作用下表达的变化。用生物发光法测定QS信号分子在SIC的抗菌素作用下的变化。结果在SIC的左氧氟沙星作用下，PAO1的毒力因子编码基因和QS调控基因（lasR、rhlR）表达均显著增加，PAO1野生株的毒力因子也增加，但lasR、rhlR突变株无此变化，同时QS信号分子水平也无显著变化。结论亚抑制浓度的左氧氟沙星促进铜绿假单胞菌毒力因子的产生，这一效应是通过lasR和rhlR调节实现的，但这一调控作用可能并不是直接通过AHL信号分子完成。
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羊布氏菌vjbR基因的克隆及原核表达
目的 克隆并原核表达羊布氏菌强毒株16M vjbR基因.方法 PCR扩增羊布氏杆菌16M株vjbR基因,亚克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组原核表达质粒pET-28a-vjbR,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达的重组蛋白经His Trap FF纯化后,进行Western blot分析.结果 扩增的vjbR基因大小为708 bp,与预期一致；重组原核表达质粒pET-28a-vjbR经双酶切及测序证明构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量约为29 000,诱导4h表达量可达6.84 mg/ml;纯化的重组蛋白纯度为65.7％,能被羊布氏杆菌阳性血清所识别.结论 成功在大肠杆菌中表达了羊布氏菌VJBR蛋白,为其功能的研究、羊布病诊断试剂盒的研制及亚单位疫苗的研发奠定了基础.
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细菌中LuxS/AI-2密度感应系统分子机制研究进展
近年来的研究证明,细菌之间存在信息交流,许多细菌都能合成并释放一种称为自诱导物质(autoinducer,AI)的信号分子.胞外的AI浓度能随细菌密度的增加而增加.当达到临界浓度时,AI能结合并激活细胞内受体,启动菌体中相关基因的表达,从而调控细菌的生理行为,产生毒力因子等,使细胞的活动具有组织性,成为类似于多细胞生物的群体性活动.由于这一现象是细菌密度依赖的方式,因此称为密度感应(quorum sensing,QS).
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黄连提取物及小檗碱对铜绿假单胞菌密度感应系统的影响
目的：观察黄连提取物和小檗碱对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa ，PA）生物学特性的影响，探讨其可能机制。方法铜绿假单胞菌与不同浓度（25.00、12.50、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39 m g／m L ）的黄连提取物共同培养，刚果红降解试验检测弹性蛋白酶表达活性；氯仿盐酸法测定绿脓菌素分泌量；结晶紫染色法观察生物被膜起始量；苔黑酚法Ⅲ测定鼠李糖脂含量；实时荧光定量法检测密度感应基因lasR、rhlR和弹性蛋白酶lasB的表达。结果随着实验浓度的增加，氯仿和乙酸乙酯提取物、小檗碱均能够不同程度抑制细菌增殖、毒力因子产生、生物被膜形成，以及鼠李糖脂分泌。各组lasR和rhlR基因转录随实验浓度增加而逐渐增强，lasB基因转录随之显著降低。结论在面对生存压力条件下，铜绿假单胞菌可能通过增强密度感应系统基因lasR和rhlR的表达，降低毒力因子表达等生物学功能以增加群体存活率。
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氨溴索对铜绿假单胞菌生物膜密度感应系统信号分子及相关基因的影响
目的 探讨氨溴索对铜绿假单胞菌生物膜(biofilm,BF)密度感应(quorum-sensing,QS)系统信号分子酰化高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserinelactone,AHL)以及AHL合成酶编码基因表达的影响.方法 通过平板培养法培养铜绿假单胞菌建立成熟的体外BF模型,用扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)鉴定生物膜的形成情况.不同浓度氨溴索干预后,应用实时荧光定量PCR(real-time PCR)和AHL感应菌株根癌土壤杆菌(WCF47)分别检测其对铜绿假单胞菌AHL合成酶编码基因rhlI和lasI mRNA及AHL表达的影响.结果 通过实时荧光定量PER检测,结果显示氨溴索3.75 mg/ml作用组基因lasI和rhlI与对照组相比表达量均显著减少(P<0.05).氨溴索1.875 mg/ml干预后,有同样趋势,但效应不如高浓度明显(P<0.05).氨溴索3.75 mg/ml作用后AHL的表达量较对照组明显减少(P<0.05),氨溴索1.875 mg/ml作用后亦有减少(P<0.05).结论 氨溴索可以通过下调信号分子AHL合成酶编码基因以及AHL的表达来抑制BF.
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铜绿假单胞菌密度感应系统的研究进展
铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa,PA),属于非发酵菌类假单胞菌属.它广泛分布于自然界并在人体皮肤上定植,是引起肺囊性纤维化(cystic fibrosis,CF)和弥漫性泛支气管炎(diffuse panbroncbiolitis,DPB)的重要的病原菌,也是近年来医院内感染的重要条件致病菌和耐药菌之一.其中密度感应(quorum sensing,QS)系统作为细菌细胞间的特殊交流方式,在基因水平上调控着PA生物被膜、Ⅲ型分泌系统、致病毒力因子等的分化,是重要的致病因素和耐药性原因之一.现将PA的QS系统的研究进展作一综述.
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黄柏对铜绿假单胞菌毒力因子的影响及机制研究
目的:观察黄柏对铜绿假单胞菌生物学特性的影响.方法:刚果红降解试验检测弹性蛋白酶活性,氯仿盐酸法测定绿脓菌素分泌量,结晶紫染色法观察生物被膜起始量,平碟法检测菌体集群运动与泳动.结果:在3.12mg/ml、6.25mg/ml和12.5mg/ml时,细菌悬液A600值分别维持在1.752、1.749和1.781,均与对照组A600值1.760无显著差异.此时弹性蛋白酶生成量A495值从0.829降至0.466,均显著低于对照组A495值0.892.绿脓菌素A540值受黄柏水提液干扰,但维持在0.328至0.429,显著低于对照组A495值0.505,且随实验浓度增加而与相应浓度的黄柏水提液对照差值逐渐缩小.生物被膜起始量A560值在3.12 mg/ml时为与对照组无显著差异,分别为0.507和0.505,高于此浓度时,起始量显著降低.选择12.5 mg/ml开展菌体运动实验,24h泳动直径为28.4mm,显著低于对照55.1mm;实验组和对照组24h和48 h集群运动分别为18.0mm和18.1mm,22.4mm和24.4mm,均未受到显著抑制.结论:黄柏可能含有对密度感应系统产生抑制作用的活性成分,在不影响细菌增殖的条件下便可抑制多种细菌生物学特性,有助于降低细菌耐药性.
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铜绿假单胞菌密度感应系统对气道黏液高分泌的影响
目的 探讨铜绿假单胞菌(PA)的密度感应系统(QS)在气道黏液高分泌中的作用.方法 60只大鼠随机分为3组(野生型菌株PA01组、QS基因突变型菌株PA01-JP2组和对照组),分别将包被不同亚型PA的硅胶管置人大鼠一侧主支气管,建立慢性肺部感染模型,对照组则用生理盐水浸泡硅胶管.28 d后处死大鼠,取肺组织和支气管肺泡灌洗液(BALF)采用AB-PAS染色、ELISA和RT-PCR等方法检测气道内黏蛋白MUC5AC蛋白及mRNA的表达水平,比较野生型菌株PA01和QS突变型菌株PA01-JP2对大鼠气道黏液分泌的影响.结果 PA01组较PA01-JP2组气道黏膜上皮的杯状细胞数目显著增多(P＜0.05),对照组的杯状细胞数目极少.PA01组MUC5ACmRNA表达量较PAO1-JP2组显著增多(P＜0.05),对照组MUC5AC mRNA仅有少量表达.PA01组BALF中MUC5AC蛋白分泌量明显高于PA01-JP2组(P＜0.05).结论 PA的QS重要基因缺损导致气道黏液分泌的能力显著下降.
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细菌天然密度感应系统抑制剂的研究进展
细菌密度感应系统(QSS)与细菌的生物膜形成和毒力等生物学特性息息相关.细菌相互间通过QSS交换信号分子实现其信息交流,而阻断细菌间的信号传导,可达到抑制或减少细菌感染的目的.近年来人们发现了多种天然抑制剂,可干扰QSS的传导回路.本文就细菌QSS及其天然抑制剂等研究进展作一综述.
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变异链球菌自诱导物2信号分子的体外合成与活性检测
目的：利用分子生物学的相关技术体外合成具有良好生物学活性的自诱导物2（AI-2）信号分子，为进一步研究S-核糖高半胱氨酸裂解酶（LuxS）/AI-2信号系统对于变异链球菌和口腔生物膜的致病性、耐药性的调节机制奠定基础。方法???构建稳定高效的LuxS和S-腺苷高半胱氨酸核苷酶（Pfs）原核表达载体，异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达目的蛋白，并进行镍柱层析分离纯化与鉴定。利用纯化表达的LuxS蛋白和Pfs蛋白体外合成AI-2信号分子，以哈维氏弧菌菌株BB170作为报告菌株，通过生物发光效应检测体外合成的变异链球菌AI-2信号分子的生物活性，并以此间接检测LuxS蛋白和Pfs蛋白的生物学活性。结果???体外合成的AI-2可诱导哈维氏弧菌菌株BB170强烈发光。以变异链球菌UA159标准株菌液中自然生成的AI-2为对照，体外合成AI-2诱导发光效果强于菌液。结论??体外合成的AI-2具有良好的生物学活性，获得了高效表达、可溶性的LuxS和Pfs重组蛋白。
关键词： 变异链球菌 密度感应系统 自诱导物2 S-核糖高半胱氨酸裂解酶蛋白 -
密度感应系统——细菌信号分子研究进展
细菌利用散在的细胞间信号分子产物介导细胞间通讯的这个整个过程被叫做密度感应系统.这些信号分子在细菌基础水平时产生,生长过程积累.当细菌密度达到阈值时信号分子则激活或抑制相关系列基因表达,从而影响毒力因子、生物膜等的产生.在抗生素耐药及多重耐药不断增加的背景下,研究者们希望明确此系统作用机制,了解可否寻找抑制它的物质并将其应用于临床协同抗生素治疗.但密度感应系统远比预想的复杂,不同细菌甚至是同种细菌不同分型可能有差异,同一细菌也可能有不同密度感应系统.故本文综述了目前研究较多的多种细菌的密度感应系统及其信号分子作用机制.
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口腔微生态中变异链球菌密度感应系统信号传导的研究进展
口腔微生态环境是由许多微生物组成,这些细菌长期在口腔内定居、生长繁殖、不断地进行竞争和拮抗,其间竞争主要是靠密度感应系统.细菌在微生态环境中达到一定浓度后,就产生调控性胞外化学信号,当这些信号分子的浓度达到一定数量值时,菌内的靶基因或者相关基因就被激活,或被抑制.通过这些信号可以调控细菌的一些功能基因,例如形成生物膜、产生细菌素、孢子、产酸、毒力反应等,从而增强细菌的生存力.龋病主要的致龋菌是变异链球菌,变异链球菌可以通过密度感应系统根据周围环境的变化来进行自身调节,以便更好的生存.现将变异链球菌密度感应信号传导的研究进展作一综述.
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氨溴索对铜绿假单胞菌生物被膜密度感应系统毒力因子及相关基因的影响
目的:探讨氨溴索对铜绿假单胞菌生物被膜(BF)密度感应(QS)系统所调控的毒力因子编码基因以及各自对应毒力因子表达的影响.方法:通过平板培养法培养铜绿假单胞菌建立成熟的BF体外模型.采用不同浓度氨溴索干预后,应用实时荧光定量PCR(rRT-PCR)检测其对QS系统各毒力因子编码基因表达的影响;采用ELISA法检测外毒素A和弹性蛋白酶水平;采用地衣酚一硫酸法检测鼠李糖脂水平;采用Folin-酚比色法检测碱性蛋白酶活性.结果:经氨溴索3.750 g/L作用后基因toxA,rhlA,lasB,aprA mRNA相对于培养基对照组的表达量均显著减少,由1.000分别变化为(3.03±0.08),(2.70±0.09),(2.10±0.10),(2.20 ±0.10)(P<0.05).同时毒力因子外毒素A、弹性蛋白酶、鼠李糖脂、碱性蛋白酶的表达量也较培养基对照组明显减少,分别由(15220.16 ±988.89),(81.38±5.44),(289.73 ±6.72),(5011 ±108.78)减少至(3481.59±599.64),(29.76±3.84),(101.74 ±3.32),(1757±57.21)(P<0.05).经氨溴索1.875 g/L干预后具有同样趋势,但效应不如高浓度明显(P<0.05).结论:氨溴索可以降低BF QS系统调控的毒力因子编码基因以及各自对应的毒力因子的表达.
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HtrA基因缺陷对肺炎链球菌毒力影响的研究
目的:HtrA基因可编码肺炎链球菌的一种重要蛋白酶,本文目的是探索HtrA基因缺陷对细菌毒力的影响. 方法:用插入复制失活的方式使HtrA基因缺失,通过RT-PCR分析毒力因子表达,并通过动物试验观察HtrA基因缺陷株毒力改变情况. 结果:RT-PCR显示HtrA缺陷株毒力因子表达低于野毒株,两组比较P＜0.05;转化试验发现缺陷菌株转化力下降;小鼠毒力试验表明野毒株半数致死时间22 h,而缺陷株半数致死时间8 d,P＜0.01,有显著性差异;缺陷菌在小鼠体内被清除速度也显著快于野毒株. 结论:HtrA基因缺陷使肺炎链球菌多种毒力因子表达减弱,自然转化能力下降,毒力降低.
