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VEGF在运动诱导大鼠海马神经发生中可能的信号转导通路
目的 分析血管内皮生长因子(VEGF)在运动诱导的神经发生中可能的信号转导途径.方法 通过预先埋管方式,向动物侧脑室内分别注射Flk-1、ERK和PI3-K的对应抑制剂SU5416、PD98059和Wortmannin,采用免疫组织荧光染色技术检测海马齿状回内新生细胞数量.结果 Wortmannin和SU5416的使用可导致大鼠海马齿状回内新生细胞和新生神经元数量明显减少(P<0.05),PD98059的使用则没有导致大鼠海马齿状回内新生细胞和新生神经元数量明显减少(P>0.05).结论 VEGF可能通过受体Flk-1主要激活PI3-K所在的信号通路诱导海马的神经发生.
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PARP抑制剂3-AB对脂多糖诱导的帕金森病大鼠保护作用及可能机制
目的 研究PARP抑制剂3-氨基苯甲酰(3-aminobenzamide,3-AB)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的帕金森病(Parkinson's disease,PD)大鼠的作用及机制.方法 大鼠随机分三组:对照组,LPS组和LPS+3-AB组.免疫组化法检测黑质内酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的表达;ELISA法检测IL-6和IL-10的蛋白含量;Western blot法检测ERK1/2,p-ERK1/2,p38MAPK,p-p38MAPK蛋白表达水平的变化.结果 LPS显著降低大鼠黑质内TH阳性细胞数,升高IL-6的表达水平,降低IL-10的表达水平,增加p-p38MAPK/p38MAPK和p-ERK1/2/ERK1/2的表达.PARP抑制剂3-AB显著增加TH阳性细胞数,降低IL-6的水平,增加IL-10的水平,降低p-ERK1/2/ERK1/2的表达,而使p-p38MAPK/p38MAPK的表达增加.结论 3-AB的脑保护作用可能与ERK1/2通路有关.
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人脐静脉内皮细胞单层通透性改变的效应因子
背景:外源性刺激引起血管屏障功能损伤的分子机制是血管病理生理学尚未阐明的热点问题之一.目的:探讨炎症递质脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞单层通透性改变的效应分子,寻找有效治疗靶点.方法:应用脂多糖刺激并观察人脐静脉内皮细胞骨架蛋白F-actin 和细胞单层通透性的改变.应用荧光免疫组化和Western blot 方法检测脂多糖刺激前后细胞中RhoA 和SRF 等信号分子的改变.并通过阻断实验证实RhoA-SRF 信号通路的作用.结果与结论:100 μg/L 脂多糖刺激6 h 可引起人脐静脉内皮细胞中F-actin 快速重构并形成大量应力纤维,细胞单层通透性明显增强.细胞中活化RhoA 的表达明显增加,SRF 发生明显的入核转位现象.应用特异性分子抑制剂Y27632 抑制RhoA 的活化后,细胞中F-actin 重构现象消失,细胞单层通透性增加也受到明显抑制,SRF 蛋白发生明显的出现转位.而应用Latrunculin B 抑制脂多糖刺激的人脐静脉内皮细胞中F-actin 应力纤维形成,对抗通透性增加,但RhoA 活化未受到干扰,SRF 入核现象则受到抑制.提示RhoA-SRF 通路的活化介导了脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞中F-actin 重构和内皮单层通透性增加,特异性抑制F-actin 也可以阻断脂多糖引起的血管内皮单层通透性增加,同时反馈抑制SRF 的入核活化现象.
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庆大霉素损伤后豚鼠前庭上皮自发修复的分子机制研究
目的观察庆大霉素损伤后豚鼠前庭上皮自发修复期细胞增殖和胞外信号调控蛋白激酶1/2(extracellular signal regulated kinase1/2,ERK1/2)的表达和分布特点,探讨其生物学特性和意义.方法采用免疫组织细胞化学方法,以ERK1/2抗体为标记物,检测庆大霉素损伤后豚鼠前庭上皮修复期ERK1/2的表达变化和分布特点;采用Brdu体内标记和抗Brdu抗体免疫组化染色,检测庆大霉素损伤后豚鼠前庭上皮修复期细胞增殖情况.结果ERK1/2在正常对照组前庭上皮细胞中有低水平表达.庆大霉素损伤后,其表达渐增.在损伤后1d时ERK1/2表达明显增多,7d时表达强,其后逐渐减少.在正常对照组前庭上皮中无Brdu阳性细胞.各实验组均观察到Brdu阳性细胞,7d时多.结论庆大霉素损伤后,豚鼠前庭上皮ERK1/2表达增强,其时程变化与细胞增殖活动一致.ERK1/2在豚鼠前庭上皮损伤后的自发修复中可能起重要信号转导作用.
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Ca2+参与骨髓间充质干细胞存活增殖及向肝细胞的诱导分化
背景：骨髓间充质干细胞增殖和分化中的具体机制仍不清楚，Ca2+信号、骨髓间充质干细胞增殖与分化信号如何协调和交叉成复杂信号网络等问题仍有待研究阐明。
目的：探讨细胞内Ca2+在骨髓间充质干细胞向肝细胞定向诱导分化过程中的作用。
方法：用全骨髓贴壁法从大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞后进行纯化和扩增，并加入肝细胞生长因子诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化，应用流式细胞技术分别检测肝细胞生长因子诱导分化骨髓间充质干细胞和对照骨髓间充质干细胞内游离[Ca2+]i。将不同浓度的尼莫地平加入肝细胞生长因子诱导的骨髓间充质干细胞(肝细胞生长因子组)培养液中进行干预后分为3组：肝细胞生长因子+尼莫地平10 mg/L组、肝细胞生长因子+尼莫地平50 mg/L组、肝细胞生长因子+尼莫地平100 mg/L组，在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况并用免疫细胞化学法检测AAT的表达；并用RT-PCR检测对照组和尼莫地平干预组钙调蛋白mRNA的表达，免疫印迹法检测上述各组磷酸化ERK的表达。
结果与结论：①加入肝细胞生长因子诱导分化的骨髓间充质干细胞内[Ca2+]i显著高于对照组(P<0.05)。②加入较大剂量的尼莫地平干预后，未见分化细胞且骨髓间充质干细胞的生长状态差；肝细胞生长因子+尼莫地平各组表达AAT的阳性细胞很少。③与对照组比较，肝细胞生长因子组和肝细胞生长因子+尼莫地平10 mg/L组钙调蛋白mRNA表达显著增加了(P<0.05)，肝细胞生长因子+尼莫地平50 mg/L组、肝细胞生长因子+尼莫地平100 mg/L组与对照组比较组间差异无显著性意义(P>0.05)。说明Ca2+不仅参与细胞因子诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞的定向分化，而且也参与维持骨髓间充质干细胞的存活和增殖。 -
ERK信号通路对人表皮干细胞增殖分化的影响
背景：表皮干细胞体外培养时易于分化和衰老，增殖能力有限，制约了其在皮肤组织工程的应用和发展，了解表皮干细胞增殖分化的调控机制可以为表皮干细胞的临床应用奠定理论基础。
目的：探索ERK信号通路在人表皮干细胞增殖分化中的作用。
方法：分离培养表皮干细胞，使用ERK通路抑制剂PD98059抑制表皮干细胞ERK通路的活性，转染MEK1重组质粒过表达MEK1或者使用PMA激活ERK通路。通过MTT法检测表皮干细胞的增殖率，克隆形成实验检测表皮干细胞的克隆形成能力，Western blot检测表皮干细胞标志蛋白K19和β1-整合素及分化细胞标志蛋白K10的表达。
结果与结论：①使用PD98059抑制ERK通路后，表皮干细胞增殖率下降，克隆形成减少，细胞分化加强；②过表达MEK1或者使用PMA激活ERK通路后，表皮干细胞增殖率上升，克隆形成能力增强，细胞分化受到抑制；③这些结果表明ERK通路在表皮干细胞的增殖分化中有重要的作用。 -
榄香烯抑制Raf/MEK/ERK信号通路诱导人源胶质瘤U87细胞凋亡
目的 探讨莪术提取物榄香烯体外诱导胶质瘤细胞凋亡的机制.方法 采用流式细胞术、Western印迹等方法,分别检测不同浓度榄香烯对人源U87胶质瘤细胞的凋亡诱导及其对U87细胞Raf-1、ERK、癌基因Bcl-2蛋白质表达的影响.结果 榄香烯对人源U87胶质瘤细胞具有明显的凋亡诱导作用,该增殖抑制效应呈时间依赖性.榄香烯可明显下调U87细胞的磷酸化Raf-1、ERK、Bcl-2表达.结论 体外榄香烯对胶质瘤细胞具有明显的凋亡诱导作用(呈时间依赖性),抑制Raf/MEK/ERK信号通路,从而下调其下游信号癌基因Bcl-2的表达,终启动凋亡程序可能是榄香烯诱导U87细胞凋亡的机制.
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榄香烯阻碍大鼠胶质瘤C6细胞ERK信号通路中Hsp90/Raf-1分子复合体的形成
目的 探讨莪术提取物榄香烯抑制胶质瘤细胞体外增殖的机制.方法 采用细胞计数、免疫共沉淀、Western印迹等方法,分别检测不同浓度、不同作用时间榄香烯对C6胶质瘤细胞的增殖影响、对C6细胞中与Raf-1结合形成分子复合体的Hsp90水平的影响、对C6细胞Hsp90、Raf-1、ERK蛋白质表达的影响.结果 榄香烯对大鼠C6胶质瘤细胞具有明显的抑制增殖作用,该增殖抑制效应呈剂量、时间依赖性.榄香烯可明显下调C6细胞中与Raf-1结合的Hsp90水平及C6细胞的磷酸化Raf-1、ERK表达,但不影响总Hsp90的表达水平.结论 榄香烯能有效抑制胶质瘤细胞的体外增殖,破坏Hsp90的分子伴侣功能,阻碍Hsp90/Raf-1复合体的形成,使Raf-1不能被活化,终下调胶质瘤细胞赖以生存的Raf/MEK/ERK通路,这可能是榄香烯抑制C6细胞增殖的机制.
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14-3-3／Raf-1复合体介导的榄香烯抗胶质瘤作用
目的：探讨莪术提取物榄香烯在体外抗胶质瘤作用及相关机制。方法采用细胞计数、免疫共沉淀、Western印迹等方法分别检测经不同浓度、不同作用时间榄香烯对U87胶质瘤细胞的增殖影响、对U87细胞中与Raf-1结合形成分子复合体的14-3-3表达水平的影响、对U87细胞14-3-3、Raf-1、ERK蛋白质表达的影响。结果榄香烯在体外具有浓度、时间依赖的抗胶质瘤效应，其IC50约为（83．2±4．3）μg/mL。分子机制研究表明：榄香烯对总14-3-3蛋白表达无明显影响（ P＞0．05），能明显抑制14-3-3/Raf-1复合体的形成；榄香烯明显下调ERK-1/2信号通路中关键蛋白P-Raf -1、P-ERK-1/2的表达（P＜0．05），对非磷酸化的ERK-1/2和Raf-1无明显影响（P＞0．05）。结论榄香烯在体外通过破坏14-3-3的分子伴侣功能，阻碍14-3-3/Raf-1复合体的形成，使Raf-1不能被活化，进一步抑制Raf/MEK/ERK通路，达到抗胶质瘤细胞作用。
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ERK与bFGF蛋白在乳腺癌中表达及意义
目的 探讨细胞外信号调节蛋白激酶ERK在乳腺癌组织中的表达、临床意义及其与bFGF蛋白的关系.方法 应用免疫组织化学SP法检测90例乳腺癌,10例乳腺癌旁组织和15例乳腺良性病变中ERK和bFGF蛋白的表达情况.结果 ERK1/2和bFGF蛋白在浸润性乳腺癌组阳性表达率分别为81.1%和62.2%,与癌旁组织和乳腺良性病变比较,差异有显著性(P<0.05).ERK蛋白阳性表达与乳腺癌的临床分期有关,有腋窝淋巴结转移者的阳性表达高于无转移者,经统计学处理,差异有显著性(P<0.05).bFGF,ERK蛋白阳性表达与乳腺癌的肿瘤直径、组织学类型状态、组织学分级无关(P>0.05).结论 ERK蛋白在乳腺癌组织中表达上调,且与病理分期有关,提示其可能在乳腺癌发生、发展中起重要作用,ERK可能成为乳腺癌治疗中的一个靶基因,ERK与bFGF蛋白可能在乳腺癌的演进中起着协同作用.
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染料木黄酮通过抑制EGFR/ERK通路抗肝癌SMMC7721细胞增殖
目的 探讨染料木黄酮对肝癌细胞SMMC7721增殖的抑制作用及其作用机制.方法 以染料木黄酮干预肝癌细胞SMMC7721.MTT法及集落形成实验检测细胞增殖;蛋白质免疫印迹检测染料木黄酮对ERK及EGFR活化的影响;免疫共沉淀法检测染料木黄酮对SMMC7721细胞ERK及EGFR间相互作用的影响.结果 染料木黄酮能显著抑制肝癌细胞增殖,其抗增殖活性具有浓度依赖性;染料木黄酮还可抑制ERK与EGFR的活化,并抑制ERK及EGFR间的相互作用.结论 染料木黄酮可抑制肝癌细胞增殖,其机制可能与其抑制EGFR/ERK通路活化有关.
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NF-κB基因沉默对入胃癌SGC7901细胞增殖影响及机制探讨
目的:研究NF-κB基因沉默对人胃癌细胞SGC7901增殖及TFF3、ERK表达的影响.方法:应用脂质体法将靶向NF-κB的干扰RNA(siRNA)转染入胃癌细胞株SGC7901中.采用MTT法和流式细胞术法检测NF-κB基因沉默对SGC7901细胞的增殖抑制率和细胞凋亡情况,运用Real time PCR和Western blot免疫蛋白印迹法检测SGC7901细胞内TFF3、ERK的表达.结果:MTT法显示NF-κB基因沉默组癌细胞抑制率大于空白载体组和对照组(P＜0.01);流式细胞术法表明NF-κB基因沉默组细胞凋亡比例达12.60％,明显高于空白载体组和对照组(P＜0.01):RT-PCR和Western Blot检测示,经NF-κB基因沉默后,细胞内NF-κB、TFF3、ERK mRNA及蛋白表达量下降明显.结论:NF-κB基因沉默可抑制胃癌细胞的增殖并促进其凋亡.NF-κB基因作为胃癌治疗的分子靶点可能具有重要意义.
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中药复方益肾蠲湿合剂抑制肾小球系膜细胞增殖及机理的研究
目的:观察自拟中药复方"益肾蠲湿合剂"对肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)增殖的影响.并进一步探讨其作用机理.方法:将1 ×10-3、1 ×10-2和1×10-1mg/mL的"益肾蠲湿合剂"提取液作用于体积分数10%血清的DMEM培养的GMC,分别用MTT和Western Blot方法检测细胞的增殖和磷酸化ERK1/2的表达.结果:1 × 10-2和1×10-4mg/mL"益肾蠲湿合荆"可显著抑制GMC的增殖,抑制率在12、24和36 h分别为13.4%、21.9%、26.1%,和20.7%、35.8%、42.1%.1×10-3mg/mL"益肾蠲湿合剂"在作用36 h也可抑制GMC的增殖,抑制率为9.6%.细胞总ERK的表达在各组间无明显差别.但不同浓度的"益肾蠲湿合剂"能显著地抑制血清所诱导的ERK1/2的磷酸化,高抑制率迭68%.结论:"益肾蠲湿合剂"可通过抑制ERK1/2的磷酸化来抑制GMC的增殖.
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碱性成纤维细胞因子在血管性痴呆大鼠中的研究进展
脑血管病以其高发病率和高致残率成为严重威胁人类健康的重要疾病,血管性痴呆(vascular dementia,VD)防治的研究在被人们重视的同时也取得了一定成果.碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是一种重要的神经营养因子,广泛分布于成熟和未成熟中枢神经系统内,通过与其相应受体结合发挥多种生理作用.在脑缺血时bFGF的保护机制很复杂,促进细胞增生分化和血管生成,阻止细胞凋亡,修复损伤组织.本文对VD大鼠的研究及bFGF对其的影响做一综述.
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bFGF对PTSD样大鼠海马组织ERK表达的影响
近年来,我国遭遇的灾难给人们带来巨大财产损失的同时,也带来严重的后遗症——创伤后应激障碍(post trauma stress disorder,PTSD).国内外学者研究发现,PTSD患者有海马萎缩、海马功能活动下降以及N-乙酰天冬氨酸的减少.且中枢神经系统存在内源性神经干细胞(neural stem cell,NSCs),尤其是室管膜下区和海马齿状回终生都存在不断增殖分裂的NSCs.通过对内源性NSCs增殖与分化的精细调控,使减少神经元凋亡,促进NSCs的增殖、分化来修复脑神经组织成为可能.NSCs增殖分化受多种基因调控,其中碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)上调诱导胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信号通路,促进NSCs增殖、分化成为当前研究热点之一.本文针对bFGF诱导ERK在PTSD样大鼠海马组织内源性NSCs增殖分化影响做一综述.
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N-Ras和pERK1/2在急性髓系白血病中的表达及临床意义
目的:研究N-Ras,pERK1/2在急性髓系白血病(AML)中的表达,探讨Ras/MAPK信号通路在AML中的临床意义.方法:选择AML46例,应用免疫组织化学染色法检测骨髓单个核细胞N-Ras,pERK1/2蛋白表达水平.结果:初诊组N-Ras和pERK1/2的表达水平(59.8%,41.9%)显著高于对照组(P＜0.05),完全缓解组N-Ras和pERK1/2的表达(28.2%,15.1%)与对照组比较差异不显著(P＞0.05),初诊组N-Ras和pERK1/2的表达较完全缓解组明显增高(P＜0.05).相关性分析结果表明N-Ras与pERK1/2的表达具有密切相关性(P＜0.01).结论:N-Ras,pERK1/2的表达密切相关,N-Ras/ERK信号传导通路参与了AML的发展过程.
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MACC1基因表达下调对卵巢上皮性癌细胞SKOV3顺铂敏感性的影响
目的:探讨通过RNA干扰技术沉默MACC1基因的表达对卵巢上皮性癌细胞SKOV3顺铂敏感性的影响及其可能机制.方法:前期构建的针对MACC1 mRNA的小发卡状RNA重组表达载体转染卵巢癌SKOV3细胞,获得MACC1基因表达下调的shRNA-MACC1-SKOV3细胞.RT-PCR及Westem blot检测MACC1 mRNA和蛋白表达,并检测ERK1/2和p-ERK1/2蛋白含量的变化以及ERK1/2通路抑制剂PD98059对上述蛋白水平的影响.四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测shRNA-MACC1-SK-OV3细胞顺铂敏感性变化.同时设置空白组(SKOV3细胞)和转染空质粒组(SKOV3/DDP-EGFP细胞)为对照组.结果:(1) shRNA-MACC1-SKOV3细胞的MACC1 mRNA和蛋白明显降低.(2) shRNA-MACC1-SKOV3细胞p-ERK1/2表达明显降低,在此基础上加入PD98059后p-ERK1/2表达改变更为明显. (3)shRNA-MACC1-SKOV3细胞的顺铂半数抑制浓度(IC50)为(20.420±1.437)μmol/L,明显低于空白组和转染空质粒组[分别为(28.168±0.899)和(27.071±1.229)μmol/L.结论:SKOV3细胞中MACC1基因表达下调导致细胞对顺铂的敏感性增加,可能与下游的ERK1/2通路受到抑制有关.
关键词： 结肠癌转移相关基因1(MACC1) 卵巢癌 ERK 顺铂 -
p21蛋白激活激酶4在三阴乳腺癌增殖中的作用及机制研究
目的:探讨p21蛋白激活激酶4(PAK4)在三阴乳腺癌细胞增殖存活中的作用机制.方法:在三阴乳腺癌BT549和MDA-MB-231细胞中转染PAK4干扰载体,荧光定量法和免疫印迹分析检测PAK4 mRNA和蛋白质表达量变化;MTT法检测转染PAK4干扰载体对三阴乳腺癌细胞存活率的影响;细胞周期分析检测,转染PAK4干扰载体对三阴乳腺癌细胞细胞周期的影响;免疫印迹分析,转染PAK4干扰载体对三阴乳腺癌细胞对细胞信号通路的影响.结果:干扰内源PAK4表达后,三阴乳腺癌BT549和MDA-MB-231细胞的增殖率分别下降(36.514.24)％和(38.54±5.43)％,G0/G1期细胞所占比例显著增加到(66.40±2.82)％和(72.01±3.13)％,ERK1/2磷酸化显著降低;ERK通路抑制剂PD98059处理后,三阴乳腺癌BT549细胞的增殖率显著下降(46.41±7.16)％.结论:PAK4在三阴乳腺癌增殖中发挥关键作用,其促增殖作用是通过ERK通路实现的.
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脐带来源间充质干细胞对人B细胞系细胞的调控
目的:探讨脐带来源的MSC对B细胞生长、活化、功能、信号通路的影响,为阐明MSC对B细胞的调控以及作用机制提供理论基础.方法:以人非Hodgkin淋巴瘤B细胞系Daudi、Namalwa和Raji为研究模型,在CpG刺激和不刺激下,与脐带MSC分别共培养3天后,收集悬浮的B细胞,进行细胞计数,PI染色检测细胞周期,Annexin V染色检测凋亡;流式细胞仪检测表面免疫球蛋白、MHC分子和共刺激分子的表达,Transwell实验证明细胞接触的依赖性.实时定量PCR检测与MSC共培养6、12、24、48 h后细胞因子的mRNA水平.Western blot检测MAPK、JAK-STAT、PI3K信号通路蛋白的激活情况,抑制剂证明信号通路对细胞功能的影响.结果:MSC可阻滞Namalwa和Raji于G0/G1期,对3种B细胞系增殖和凋亡没有显著影响;显著抑制Daudi、Namalwa表面IgM的表达和3种B细胞表面CD86的表达,且抑制效应不依赖细胞接触和COX2的作用;显著上调Daudi内CCL2、COX2、IL-8的mRNA水平.但不影响TNF-α;显著激活3种细胞株上的ERK信号,ERK抑制剂可减弱MSC对Daudi表面分子和CCL2的调控.结论:MSC可阻滞B细胞系周期,通过分泌可溶性因子抑制B细胞系表面分子的活化、促进细胞因子的产生,ERK信号通路参与了MSC对B细胞系上述功能的调控,提示MSC抑制B细胞的免疫效应从而在治疗免疫疾病上发挥重要作用.
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长链非编码PCA3靶向miR-194影响前列腺癌细胞增殖和凋亡行为
目的:探讨长链非编码PCA3靶向miR-194的表达通过ERK信号通路对前列腺癌细胞增殖和凋亡的作用及机制.方法:qPCR检测PCA3和miR-194在不同前列腺癌细胞中的表达情况;双荧光素酶报告基因检测PCA3与miR-194的相互作用;克隆形成实验和凋亡实验检测抑制PCA3后前列腺细胞增殖能力和凋亡行为的变化,及过表达miR-194后前列腺细胞增殖能力和凋亡行为的变化;Western blot检测抑制PCA3后ERK信号通路蛋白的表达水平及过表达miR-194后ERK信号通路蛋白的表达水平变化.裸鼠体内成瘤试验检测PCA3对前列腺癌细胞成瘤能力的影响.结果:与其他前列腺癌细胞相比,LNCaP细胞中PCA3的表达水平高,miR-194的表达水平较低;双荧光素酶试验证实PCA3可以调控miR-194的表达及活性,抑制PCA3的表达可以减弱前列腺癌细胞的增殖能力,加强其凋亡行为;过表达miR-194后前列腺癌细胞的增殖能力和凋亡行为得到一定的恢复;抑制PCA3的表达可以下调ERK信号通路的蛋白表达,抑制ERK信号通路的激活;同时过表达miR-194后可以逆转PCA3对ERK信号通路的抑制作用.抑制PCA3的表达后可以有效减弱前列腺癌细胞的体内成瘤能力.结论:PCA3可以靶向调节miR-194通过ERK信号通路调控前列腺癌细胞的增殖和凋亡行为.
