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正畸牙移动过程中Cbfa1/Osf2在牙周组织中的表达
目的:了解Cbfa1/ Osf2在牙周组织中的表达及变化,探讨其在牙周组织改建中的作用,为进一步深入研究正畸牙移动的机制奠定基础.方法:建立大鼠正畸牙移动的动物模型,并采用免疫组织化学的方法检测Cbfa1/Osf2在此过程中的表达.结果:Cbfa1/ Osf2在加力组牙周组织中的表达明显强于对照组,且张力侧表达强于压力侧;其中成骨细胞、成纤维细胞及破骨细胞均为强表达.结论:Cbfa1/Osf2参与了牙移动过程中牙周组织的改建,可能在牙周膜细胞向成骨细胞转化及新骨形成中起到了重要的作用.
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MDPC-23细胞内核心结合因子A1增强Smad3调控牙本质涎磷蛋白基因的表达
目的:研究转录因子核心结合因子A1(CBFA1)在Smad分子调控牙本质涎磷蛋白(DSPP)基因表达中的作用.方法:细胞培养,基因转染和报告基因检测.结果:转化生长因子β1(TGF-β1)抑制DSPP基因启动子活性的表达.Smad3过表达显著增强了TGF-β1对DSPP基因表达的转录抑制.单独过表达CBFA1对DSPP基因启动子活性无明显影响.但是,CBFA1与Smad3共转染显著增强Smad3对DSPP基因启动子的抑制作用,在TGF-β1存在时,其作用进一步增强.结论:在成牙本质细胞系MDPC-23内,CBFA1可能作为一种转录因子协同调控Smad3对DSPP基因转录的调控.
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cbfa1对人牙乳头细胞增殖和矿化能力的影响
目的:观察核心结合因子(cbfa1)对人牙乳头细胞增殖和矿化能力的影响.方法:建立稳定表达cbfa1的人牙乳头细胞模型,分别采用MTT、FCM、cAMP检测以及ALP和骨钙素放射免疫等方法检测转染前后相关指数的变化.结果:稳定转染cbfa1后,牙乳头细胞的MTT值、PrI指数明显降低,而cAMP含量、ALP活性和OC含量明显增高.结论:稳定转染cbfa1后牙乳头细胞的增殖能力明显降低,矿化指标明显增高.
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珍珠层水溶性基质对兔骨髓基质干细胞BMP-2和Cbfα1基因表达的影响
目的 从珍珠层水溶性基质(WSM)对兔骨髓基质干细胞分泌的骨形成蛋白-2和核心结合因子基因表达的影响入手,研究WSM产生成骨作用的机制和途径.方法 培养新西兰大白兔的骨髓基质干细胞(BMSCs),并用低温下提取的珍珠层水溶性基质作用后,检测不同浓度WSM作用下碱性磷酸酶的活性,制定剂量-效应曲线,确定量效关系;采用一步RT-PCR方法检测不同浓度WSM诱导兔BMSCs后骨形成蛋白-2和核心结合因子的基因表达量并进行统计学分析.结果 WSM可以增加兔BMSCs中碱性磷酸酶的活性,在150～200 μg/ml浓度之间作用明显,碱性磷酸酶活性增加显著;WSM诱导兔BMSCs后骨形成蛋白的表达量明显增加,核心结合因子的表达量无明显变化.结论 WSM通过增加骨形成蛋白-2的基因表达量诱导兔BMSCs向成骨细胞分化,与核心结合因子的作用关系不明显.
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间期荧光原位杂交检测核心结合因子相关急性白血病的初步研究
目的应用间期荧光原位杂交技术(I-FISH)检测初诊急性白血病患者中核心结合因子(CBF)受累的染色体异常情况并对治疗后患者的微小残留病(MRD)进行监测,同时对I-FISH与常规染色体G显带的灵敏度进行比较.方法在骨髓形态学初筛的基础上,应用常规染色体G显带技术对15例急性髓系白血病(AML)进行核型分析,应用I-FISH对患者可能受累的CBF相关靶基因进行检测,其中7例患者治疗后进行了MRD监测.结果(1)正常对照组中,CYTOCELL公司提供的3种探针(AML1/ETO易位探针、MYH11基因断裂点双色探针和ETV6/AML1易位探针)的正常分界值分别为4.13%、1.95%和2.12%.(2)常规染色体G显带分析,15例患者中有6例伴有潜在累及CBF基因的染色体异常,其中8例AML-M2中5例伴t(8;21),2例AML-M4EO中1例伴inv(16),5例儿童B系急性淋巴细胞白血病(B-ALL)未检出相应的异常.I-FISH检测15例患者发现有12例累及CBF基因,其中8例AML-M2患者均为AML1/ETO融合基因(+),2例AML-M4EO病人CBFβ/MYH11融合基因均为(+),5例儿童B-ALL中2例ETV6/AML融合基因(+).(3)3例AML-M2患者中2例MRD阳性;2例M4E0患者治疗后MRD监测结果均阴性;2例B-ALL患者1例阴性,1例阳性.结论I-FISH较常规染色体G显带技术能够更灵敏地检测出累及CBF的急性白血病,在初诊时联合应用这两种方法能使结果更趋全面和准确.
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pIRES2-EGFP/Cbfal真核双表达载体的构建及鉴定
目的:构建成骨细胞特异性转录因子Cbfal双表达载体,以期用于成骨的体内、外研究.方法:以含有全长cDNA的pCMV/Cbfal为模板,PCR扩增Cbfal,T-A克隆,酶切亚克隆到pIRES2-EGFP载体上,酶切、PCR及测序鉴定正确后命名为pIRES2-EGFP,脂质体转染NIH3T3细胞,G418筛选稳定表达后,提取细胞的总蛋白,Western blot检测Cbfal蛋白的表达,以未转染组为对照.结果:酶切、PCR及测序证实pIRES2-EGFP/Cbhl载体序列正确,脂质体法转染NIH3T3细胞后可见绿色荧光蛋白的表达,Western blot检测到Cbfal在蛋白水平的表达.结论:pIRES2-EGFP/Cbfal栽体构建成功,可为后续研究奠定基础.
关键词： 成骨细胞 核心结合因子 pIRES2-EGFP 基因治疗 -
大剂量阿糖胞苷巩固治疗核心结合因子相关急性髓系白血病的疗效及安全性分析
目的 探讨大剂量阿糖胞苷巩固治疗核心结合因子相关急性髓系白血病的疗效、安全性.方法 对76例经过诱导治疗的急性髓系白血病患者进行阿糖胞苷巩固治疗,治疗结束后进行为期6～60个月的随访,观察患者的生命状态及病情、不良反应.结果 76例患者共存活52例,死亡24例;其中,6例在骨髓抑制期出现颅内出血死亡,18例出现AML复发死亡.进行阿糖胞苷巩固治疗期间或者随访期39例患者出现复发,M4Eo型6例,M2b型33例;21例在巩固治疗2个疗程结束后复发,18例在3个疗程结束后复发.Kaplan生存法分析后发现5年总生存时间(0S)为(68.2±12.7)％,预期5年无病生存时间(DFS)为(41.8±12.3)％,预期5年复发率为(55.9±14.8)％.M4Eo型和M2b型AML复发率间的差异有统计学意义(P＜0.05).患者均表现为不同程度的骨髓抑制现象,以Ⅳ度为多见,特别是白细胞、血小板的减少为明显.白细胞计数范围为(0.04 ～0.68)×109/L、中位值为0.4×109/L,血小板计数范围为(2～ 16)×109/L、中位值为6×109/L,血红蛋白低值(68.2±6.8)g/L.治疗过程中,76例患者的白细胞、血小板及中性粒细胞计数的低值均达到Ⅳ度;血红蛋白低值Ⅱ度所占比例为9.9％、Ⅲ度所占比例为90.1％.所有患者在粒缺期间出现发热等感染迹象,肺部感染6例次,菌血症感染30例次,少数患者表现为不明原因的粒缺伴发热.经过及时的抗生素药物治疗,患者病情均缓解,未出现严重感染致死的病例.肝脏系统不良反应比较轻微,其他系统如皮肤、胃肠道等都出现不同程度的不良反应,但都在可接受的范围内,而且对应的治疗可明显缓解这些不适症状.结论 阿糖胞苷巩固治疗可促进CBF-AML的缓解,提高5年无病生存率;不良反应主要是骨髓抑制等,对症治疗可明显缓解,用药较为安全.
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成骨细胞特异性转录因子Cbfa1重组腺病毒的构建、纯化及表达
目的构建成骨细胞特异性转录因子Cbfa1重组腺病毒载体,以期用于骨缺损、脊柱融合的体内、外研究.方法以含有全长eDNA的pCMVβ/Cbfa1为模板,PCR扩增Cbfa1,T-A克隆,酶切亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,在BJ5183细菌内和pAdEasy-1同源重组,筛选阳性克隆,酶切、PCR及测序鉴定,线性化后脂质体法转染293T细胞进行包装、扩增,利用报告基因GFP对病毒滴度和感染效率进行监测,CsCl梯度离心纯化病毒.AdEasy1/Cbfa1感染NIH3T3细胞后Western-blotting检测Cbfa1蛋白的表达.结果测序、酶切及PCR证实Cbfal基因重组腺病毒载体构建成功.AdEasyl/Cbfal感染NIH3T3细胞后Western-blotting检测到Cbfa1蛋白的表达.结论成功构建了含有小鼠Cb白l基因的重组腺病毒载体,为下一步研究基因治疗骨缺损、脊柱融合奠定基础.
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核心结合因子a1与成骨细胞分化和骨改建
核心结合因子与骨发育过程中的各种细胞关系密切,是间充质细胞向成骨细胞分化过程中的特异性转录因子.通过调节生长因子和骨特异性细胞外基质蛋白的基因表达而参与成骨细胞的分化和骨发育过程.能诱导大多数与矿化相关的基因和蛋白的表达,在牙齿发育和矿化中扮演着关键角色.核心结合因子基因的突变可导致锁骨颅骨发育异常,同时也是正畸成骨的调控靶位之一.
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普伐他汀对激素性坏死股骨头内Cbfa1表达的影响
目的研究普伐他汀对激素性坏死股骨头内Cbfa1基因表达的影响.方法 54只新西兰白兔随机分为正常组(A组)、模型组(B组)和普伐他汀治疗组(C组),每组18只.B、C两组应用大肠杆菌内毒素及甲强龙造成股骨头坏死模型,C组于造模后4周开始用普伐他汀灌胃,A、B两组以等量蒸馏水灌胃.分别于喂药后第4、8、12周分批取兔股骨头行实时荧光定量PCR检测股骨头内Cbfa1 mRNA的表达.结果 B、C两组各时相点Cbfa1 mRNA的表达水平均低于A组,但C组喂药后第8、12周的表达量明显高于B组,差异有显著性(P﹤0.01).结论普伐他汀可促进激素性坏死股骨头内Cbfa1 mRNA的表达,有可能成为临床治疗激素性股骨头坏死的有效药物.
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Runx2在牙釉质形成中的作用研究
目的:研究小鼠成釉细胞中Runx2对釉成熟蛋白(Amelotin,AMTN)、成釉蛋白(Ameloblas-tin,AMBN)、牙成釉细胞相关蛋白(odontogenic ameloblast-asssociated protein,ODAM)基因表达的调控作用,为研究Runx 2在牙釉质形成中的作用奠定基础.方法:通过RT-PCR法从小鼠成釉细胞中克降得到Runx 2全长基因,测序正确后将其亚克隆至pcDNA3.1-hisA载体中;构建针对小鼠Runx 2的siRNA表达框架,将反应质粒pcdna-3.1-HisA-Runx 2及针对Runx 2的特异性小分子干扰RNA(siRNA)分别转染小鼠成釉细胞,用RT-PCR方法检测Runx 2,AMTN,AMBN以及ODAM的mRNA水平.结果:转染的小分子干扰RNA(siRNA)对Runx 2mRNA的表达有显著性抑制作用,Runx 2基因沉默可显著抑制AMTN和AMBN的mRNA表达水平;Runx 2基因过表达可显著上调AMTN和AMBN的mRNA表达水平.Runx 2基因的表达变化对ODAM的mRNA表达水平则无显著性调控作用.结论:Runx 2通过调控AMTN和AMBN的表达水平,在牙釉质形成过程中发挥作用.
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正畸牙移动过程中CBFa1/Osf2和BMPs在牙周组织中的表达
目的:通过比较CBFa1/Osf2和BMPs在牙周组织中的表达及变化,探讨在正畸骨改建过程中,这两个对骨形成起到重要作用的因子之间的相互关系,为进一步深入研究正畸牙移动的生物学机制奠定基础.方法:建立大鼠正畸牙移动的动物模型,并采用免疫组织化学的方法检测CBFa1/Osf2和BMPs在此过程中的表达.结果:正畸牙移动过程中CBFa1/Osf2和BMPs在牙周组织的分布及表达变化的时间上具有明显的一致性;均表现为实验组表达明显强于对照组,张力侧表达强于压力侧;其中成骨细胞、成纤维细胞及破骨细胞均为强表达.结论:CBFa1/Osf2和BMPs均参与了正畸的骨改建过程,且可能在正畸骨改建中起到重要作用.
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小鼠核心结合因子1成熟肽编码区的cDNA克隆和序列测定
目的:研究核心结合因子1(cbfa1)在小鼠牙胚组织中的表达,扩增cbfa1成熟肽编码区的特异性片段,构建重组质粒,为进一步的蛋白表达、抗体制备、基因转染等研究奠定基础.方法:提取新生小鼠的颅骨、牙胚、肝脏组织总RNA,反转录为cDNA后进行PCR反应,构建pGEM-cbfa1重组质粒并测序.结果:从小鼠颅骨和牙胚组织中均获得了约1 791bp的目的片段,牙胚来源的PCR产物的测序结果证实成功地克隆到了cbfa1成熟肽编码区,酶切结果显示重组质粒构建成功.结论:新生小鼠的牙胚组织中有cbfa1基因的表达.
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人牙周膜细胞在弹性牵张力作用下核心结合因子的表达
目的: 探讨人牙周膜细胞在张应力作用下的成骨特性和核心结合因子(core-binding factorα1 ,cbfa1)在正畸成骨中的作用机制. 方法: 人牙周膜细胞体外原代培养,弹性膜及体外培养细胞加载系统加载弹性牵张力,免疫组化方法检测cbfa1多克隆抗体在人牙周膜细胞的表达. 结果: 未加力的正常人牙周膜细胞cbfa1抗体检测为阴性,弹性牵张力作用下人牙周膜细胞有cbfa1阳性表达. 结论: 弹性牵张力可以诱导人牙周膜细胞向成骨样细胞分化;cbfa1可能是正畸成骨的调控途径之一.
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辛伐他汀对大鼠骨髓基质细胞成骨分化的影响
目的:研究辛伐他汀体内给药后对大鼠骨髓基质细胞在体外培养过程中成骨分化和增殖的影响,探讨其刺激成骨的作用机制. 方法:30只SD雌性大鼠,随机分为3组,每组10只. G1组(C)为对照组;G2组(SIM-10)给予辛伐他汀10 mg/(kg·d);G3组(SIM-20)给予辛伐他汀20 mg/(kg·d). 连续给药28 d后,取大鼠的骨髓细胞体外培养,诱导14 d后用RT-PCR和Western blot分别检测cbfa1 mRNA和蛋白表达的变化;收集上清液,检测细胞碱性磷酸酶;应用cell counting kit(CCK-8) 测定细胞增殖情况. 结果:辛伐他汀体内干扰28 d后,再经过骨髓细胞体外培养诱导14 d后,cbfa1因子的mRNA及蛋白表达水平均增高,呈剂量依赖关系. 上清液碱性磷酸酶表达增高,呈剂量依赖关系. 实验组与对照组比较,G2组(10 mg)组促进细胞增殖,而G3组(20 mg组)未见显著性差异. 结论: 辛伐他汀可促进骨髓基质细胞中cbfa1 mRNA和蛋白的表达,碱性磷酸酶活性增高,辛伐他汀刺激成骨的作用机制可能与此有关.
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Cbfa1定向调控骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的实验研究
目的研究核心结合因子(Cbfa1)调控骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为成骨细胞的分子机制.方法用Percoll密度梯度离心法分离获得人、大鼠和小鼠的MSCs,通过HE、细胞化学、免疫细胞化学、免疫荧光及透射电镜等方法进行鉴定.传代培养后的MSCs分别用重组真核表达载体pcDNA3.1(+)/Cbfal-Ⅱ通过脂质体系统转染,用Northern Blot检测三种成骨细胞特异性细胞外基质蛋白mRNA的表达情况.结果转染后人、大鼠和小鼠的MSCs都有骨钙素、骨桥接蛋白和Ⅰ型胶原的表达,三者间无明显差别.结论 Cbfa1在转录水平定向调控间充质干细胞分化为成骨细胞,可应用于骨科疾患的基因治疗.
