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三氧化二砷对恶性黑素瘤A375细胞NF-κB、C-IAP2及caspase-3表达的影响
目的:探讨三氧化二砷(arsenic trioxide,As2O3)在诱导人黑素瘤A375细胞凋亡中,对核因子-κB (NF-κB)、细胞凋亡抑制蛋白2(C-IAP2)以及半胱氨酸-天冬氨酸特异性蛋白酶-3(caspase-3)表达的影响.方法:Western blot法检测A375细胞中NF-κB p65核蛋白的表达和caspase-3蛋白的活化,半定量RT-PCR法检测C-IAP2 mRNA的表达.结果:2.5、5.0、10.0 μmol/L As2O3作用于A375细胞24 h,NF-κB p65核蛋白表达比值分别为(39.60±7.76)%、(10.17±0.90)%和(4.43±0.91)%;caspase-3蛋白比值分别为(10.03±2.06)%、(23.43±3.28)%和(35.70±4.61)%;C-IAP2 mRNA表达的比值为(66.78±15.46)%、(30.16±5.52)%和(6.46±4.54)%,上述各指标与相应对照组比较及组内两两比较差异均有统计学意义(P<0.05~P<0.01),随着As2O3作用浓度的增加,caspase-3激活型蛋白增多,NF-κB p65核蛋白和C-IAP2 mRNA表达下降.结论:As2O3能抑制NF-κB、C-IAP2基因的表达,活化caspase-3蛋白表达.推测NF-κB-C-IAP2-caspase-3通路可能是As2O3诱导A375细胞凋亡的途径之一.
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芦笋提取液抑制恶性黑色素瘤A375细胞增殖的研究
目的:探讨芦笋提取液对人恶性黑色素瘤A375细胞增殖的抑制作用以及对其凋亡的诱导作用.方法:用四甲基噻唑氮蓝比色法测定A375细胞活力;流式细胞术(FCM)检测A375细胞的凋亡诱导及杀伤作用(P＜0.01).结果:芦笋提取液与人恶性黑色素瘤细胞株A375细胞生长抑制率之间有明显的浓度依赖关系,浓度分别为200 mg/ml、400 mg/ml、600 mg/ml和800 mg/ml时,A375细胞的凋亡率及坏死率分别为2.39%、8.85%、8.71%、5.16%和1.65%、1.51%、22.10%、82.80%.结论:芦笋提取液能显著抑制恶性黑色素瘤A375细胞的增殖,且诱导A375细胞总的凋亡率和坏死率与其浓度之间存在着依赖关系.
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转染c-kit基因对A375细胞增殖和凋亡的影响
目的:明确转染c-kit基因对A375细胞增殖、凋亡的影响.方法:体外培养人恶性黑素瘤A375细胞,分为A组(实验组)、B组(转染空病毒载体的阴性对照组)、C组(空白对照组).转染后采用RT-PCR检测c-kit mRNA表达情况,在倒置相差显微镜观察A375细胞分化及形态,MTT比色分析法检测对A375细胞增殖抑制的影响,流式细胞分析术,Anexin-v-PI双染色检测细胞早期凋亡的变化.结果:转染后A组细胞出现不同程度的皱缩、破裂,漂浮细胞增多.RT-PCR半定量分析结果显示,A组扩增出c-kit cDNA 230 bp大小片段,而B、C组则没有扩增出相应大小的片段.转染后A组OD值低于B、C组(P<0.05),A组早期凋亡率高于B、C组有显著性差异(P<0.05).结论:转染c-kit后A375细胞增殖被抑制,早期凋亡增加.
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乙酰肝素酶反义寡核苷酸对A375细胞增殖及乙酰肝素酶蛋白表达的影响
目的:观察乙酰肝素酶反义寡核苷酸(ASODN)对人恶性黑素瘤A375细胞增殖及乙酰肝素酶蛋白表达的影响.方法:以空白组和无关序列(N-ODN)组为对照,设计、合成4条ASODN链(ASODN-t1,t2,t3和t4,脂质体包埋后分别以10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L N-ODN和ASODN转染A375细胞,台盼蓝排斥试验检测细胞增殖情况,免疫组织化学法检测乙酰肝素酶蛋白表达的变化.结果:转染72 h后,各ASODN组A375细胞计数较对照组、N-ODN组均减少(P均=0.000);每条链的10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L 3个浓度组相比,差异均有统计学意义(P均=0.000);30 μmol/L ASODN-t2组与其他各组相比,差异均有统计学意义(P均＜0.05).转染48 h后,30 μmol/L ASODN-t2组乙酰肝素酶蛋白的表达较对照组、N-ODN组下调(P均=0.000).结论:乙酰肝素酶ASODN可抑制A375细胞增殖,下调乙酰肝素酶蛋白的表达.
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蛇床子素对人黑色素瘤A375细胞增殖和凋亡的影响
目的:探讨蛇床子素对人黑色素瘤A375细胞增殖和凋亡的影响.方法:人黑色素瘤细胞株A375细胞体外培养,将对数生长期的A375细胞以不同浓度的蛇床子素处理,MTT法检测A375细胞增殖;流式细胞术检测A375细胞凋亡;RT-PCR法检测A375细胞Bcl-2 mRNA和Bax mRNA表达水平;Western blotting检测A375细胞IκB-α、p-NF-κB、NF-κB、Bcl-2和Bax蛋白表达.结果:蛇床子素可降低A375细胞增殖率以及Bcl-2 mRNA、p-NF-κB和Bcl-2蛋白表达水平,呈浓度依赖性;同时增加A375细胞凋亡率以及Bax mRNA、IκB-α、Bax蛋白表达水平,呈浓度依赖性,但对NF-κB表达无明显影响.结论:蛇床子素能诱导A375细胞增殖抑制和凋亡,呈浓度依赖性,其机制可能与抑制NF-κB信号通路激活有关.
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三叶青脂溶性提取物对A375细胞增殖及黑色素合成的影响
目的 探讨三叶青三氯甲烷提取物对人恶性黑色素瘤A375细胞增殖、酪氨酸酶活性及黑色素合成的影响.方法 采用MTT比色法,测定不同浓度三叶青三氯甲烷提取物对A375细胞体外抑制作用；比色法测定酪氨酸酶活性和黑色素含量；采用光学显微镜法观察其对细胞形态的影响.结果 三叶青三氯甲烷提取物在6 - 500 μg/ml浓度范围内对A375细胞增殖有显著的抑制作用(P＜0.01),且呈时间-剂量依赖性；浓度小于50μg/ml时,对酪氨酸酶活性和黑色素合成抑制有增加趋势；在100～500μg/ml时,对A375肿瘤细胞有较强的抑制作用；光学显微镜下可见典型凋亡细胞形态学改变.结论 三叶青三氯甲烷提取物对A375细胞增殖、酪氨酸酶活性及黑色素合成具有抑制作用.
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UVB诱导A375细胞自噬与凋亡调控机制探讨
目的 探究中波紫外线(UVB)对人表皮黑色素瘤细胞株A375细胞自噬与凋亡的诱导效应.方法 ①取对数生长期A375细胞,分别予剂量为10.0、15.0 mJ/cm2的UVB照射,于照射后3、6、9、12 h收集细胞,用单丹磺酰戊二胺染色法观察细胞自噬,用吖啶橙/溴乙锭染色法观察细胞凋亡.②予相应剂量的UVB照射10.0、15.0 mJ/cm2组A375细胞,于照射后18、24、36、48 h收集细胞,以CCK-8法检测细胞存活率.③予剂量为10.0、15.0 mJ/cm2的UVB照射A375细胞,于照射后3、6、9、12 h收集细胞;予剂量为2.5、5.0、7.5、10.0、15.0 mJ/cm2的UVB照射A375细胞,于照射后9 h收集细胞;用免疫印迹法检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、Bcl-2相互作用蛋白(Beclin-1)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅱ的表达.上述3个实验均另设不予UVB照射(予假照射)的对照组.结果 ①剂量为10.0、15.0 mJ/cm2的UVB照射诱导的A375细胞自噬和细胞凋亡均表现为随着照射后时间的延长而增强,但在15.0 mJ/cm2 UVB照射后12 h,细胞自噬已观察到降低.②10.0、15.0 mJ/cm2组细胞活力均随照射后时间的推移而增加(P<0.05);在照射后18～48 h,10.0和15.0 mJ/cm2组细胞活力均低于对照组(P<0.05);在照射后24～48 h,15.0 mJ/cm2组细胞活力均低于10.0 mJ/cm2组(P<0.05).③10.0 mJ/cm2组细胞Beclin-1和LC3Ⅱ蛋白相对表达水平在照射后0～12 h内均随照射时间的增加而增加(P<0.05),而15.0 mJ/cm2组细胞仅在照射后0～9 h内观察到上述改变,在12 h时间点上述2个自噬相关蛋白明显下降(P<0.05);10.0和15.0 mJ/cm2组细胞Bcl-2蛋白相对表达水平在照射后3～12 h内均随照射时间的增加而下降(P<0.05),Bax蛋白相对表达水平均在照射后0～12 h内随照射时间的增加而增加(P<0.05).0.0～10.0 mJ/cm2组细胞Beclin-1和LC3Ⅱ蛋白相对表达水平,0.0～15.0 mJ/cm2组细胞Bax蛋白相对表达水平,均随照射剂量的增加而增加(P<0.05);5.0～15.0 mJ/cm2组Bcl-2蛋白相对表达水平随照射剂量的增加而下降(P<0.05).结论 剂量为10.0和15.0 mJ/cm2 UVB照射均可诱导A375细胞发生自噬和凋亡;10.0 mJ/cm2 UVB照射诱导的细胞自噬可部分抵抗UVB对凋亡的诱导而使细胞活力增强,15.0 mJ/cm2 UVB诱导的自噬不足以发挥上述作用,且以诱导凋亡为主导效应.
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miR-214对人黑素瘤细胞A375增殖和侵袭及JNK1蛋白表达的影响
目的 研究miR-214对人皮肤黑素瘤细胞系A375的增殖、侵袭及c-Jnk氨基末端激酶1(JNK1)表达的影响,探讨miR-214影响黑色素细胞增殖、侵袭的机制.方法 将miR-214 mimics或inhibitor应用阳离子脂质体LipofectamineTM2000转染A375细胞,MTT和克隆形成实验分别检测转染后细胞增殖、侵袭能力的变化,Western blot方法检测JNK1蛋白表达.结果 转染miR-214 mimics后,A375细胞增殖、侵袭能力明显降低,JNK1蛋白表达显著降低,(P＜0.01);转染miR-214 inhibitor后,A375细胞增殖、侵袭能力明显升高,JNK1蛋白表达显著升高,(P＜0.01).结论 miR-214可能通过调控JNK1的表达抑制人黑素瘤细胞A375的增殖与侵袭能力.
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复方苦参注射液对黑色素瘤 A375细胞的凋亡作用研究
目的：探讨复方苦参注射液对黑色素瘤A375细胞的凋亡作用，为黑色素瘤治疗提供实验依据。方法：采用MTT法检测复方苦参注射液对黑色素瘤 A375细胞增殖的影响，用流式细胞仪检测细胞周期及凋亡，评估致凋亡效果。结果：复方苦参注射液浓度在0.1430 g/mL时对细胞的增殖抑制率呈作用时间的依赖性，药效在加药后72 h时强。在加药24 h时，A375细胞的凋亡率即高于阴性对照组（t＝249.03，P＜0.05）。结论：复方苦参注射液对黑色素瘤细胞有明显的致凋亡作用。
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凋亡素对黑色素瘤A375细胞的凋亡作用研究
目的:探讨凋亡素对黑色素瘤A375细胞的凋亡作用,为黑色素瘤治疗提供实验依据.方法:通过腺病毒载体介导将凋亡素基因导入黑色素瘤A375细胞中,细胞水平上观察凋亡形态,流式细胞仪检测细胞凋亡率,评估治疗凋亡效果.结果:凋亡素介导实验组A375细胞的凋亡率要高于对照组.结论:凋亡素基因导入黑色素瘤细胞后,具有致凋亡作用.
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三叶青提取物对A375细胞增殖、酪氨酸酶活性及黑色素合成的影响
目的 探讨三叶青乙醇提取物对人恶性黑色素瘤A375细胞增殖、酪氨酸酶活性及黑色素合成的影响.方法 采用MTT比色法,测定不同浓度三叶青乙醇提取物对A375细胞体外抑制作用；比色法测定酪氨酸酶活性和黑色素含量.结果 在质量浓度为1～625μg/ml范围内,随着三叶青乙醇提取物浓度增大可抑制A375细胞的增殖(P＜0 01)；三叶青乙醇提取物浓度在1～5 μg/ml时,对酪氨酸酶活性和黑色素合成抑制有增加趋势；而在25 ～625 μg/ml时,对A375细胞有一定毒性.结论 三叶青乙醇提取物在一定浓度范围内(1～ 625 μg/ml)能抑制A375细胞的增殖,且呈剂量依赖关系.
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藤茶蛇葡萄素对人卵巢癌细胞和人恶性黑色素瘤细胞增殖的抑制作用
目的:探讨藤茶蛇葡萄素(APS)的体外抗肿瘤作用.方法:采用MTT法观察APS对人卵巢癌细胞SK-OV-3和人恶性黑色素瘤A375细胞抑制作用.结果:APS能明显抑制体外培养的SK-OV-3、A375细胞的生长.MTT结果显示,APS对SK-OV-细胞的IC50为24.24 μg/ml;对A375细胞的IC50为18.29μg/ml.结论:APS对体外SK-OV-3、A375细胞的生长均有明显的抑制作用.
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全反式维甲酸对恶性黑素瘤A375细胞增殖及Fas蛋白表达的影响
目的 观察全反式维甲酸(ATRA)对体外培养恶性黑素瘤A375细胞增殖的抑制作用并探讨其作用机制.方法 设置溶剂对照及ATRA不同浓度组,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测ATRA不同浓度、作用不同时间各组细胞存活和生长情况,分析量效、时效关系;Western blot检测10 μmol/L ATRA作用不同时间Fas蛋白的表达.结果 ATRA在0.01～0.1 μmol/L浓度对A375细胞增殖抑制作用不明显;在1～100 μmol/L浓度有抑制作用;药物作用72 h时各浓度组的细胞抑制率均达到高峰,以100 μmol/L浓度组抑制率高;10 μmol/L ATRA可上调A375细胞Fas蛋白的表达.结论 ATRA对A375细胞增殖的抑制作用呈时间和剂量依赖关系.ATRA可能通过Fas信号转导途径诱导A375细胞凋亡.
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毛蕊异黄酮对人黑色素瘤细胞A375增殖、迁移及侵袭的影响
目的:研究毛蕊异黄酮对人黑色素瘤细胞A375增殖、迁移及侵袭的影响.方法:以人黑色素瘤细胞A375为研究对象,MTT法检测不同浓度的毛蕊异黄酮对A375细胞活性的影响,划痕实验检测A375细胞的迁移,Transwell小室检测A375细胞的侵袭作用;qPCR检测A375细胞中基质金属蛋白酶2(MMP-2)及基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达水平.结果:毛蕊异黄酮在6.25 ～ 100 μmol/L浓度内不能抑制A375细胞的增殖,划痕实验及Transwell检测结果显示毛蕊异黄酮可显著抑制A375细胞的迁移及侵袭(P＜0.01),qPCR结果显示毛蕊异黄酮能抑制A375细胞MMP-2及MMP-9的表达.结论:毛蕊异黄酮在小于100 μmol/L浓度时抑制A375细胞的迁移及侵袭,其机制可能与抑制MMP-2及MMP-9表达有关.
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实时定量PCR测定人皮肤黑色素瘤细胞G6PD的表达
目的 建立一种灵敏特异、重复性和稳定性好的检测G6PD表达的方法,以探究G6PD与肿瘤的相关性及其机理.方法 用Real-time PCR技术测定了野生型、siRNA干扰型和无关序列对照型人皮肤黑色素瘤A375细胞的G6PD基因表达.绘制出β-actin和G6PD的标准曲线,标定了方法的稳定性和重复性,并以内参照β-actin较对G6PD的量.结果 β-actin和G6PD标准曲线的回归系数分别为1.086和0.940;稳定性及重复性验证的Ctβ-actin值变异系数分别为2.46%和1.47%,而CtG6PD值变异系数分别为1.76%和1.87%.以野生型A375细胞作对照,无关序列不干扰A375细胞内源性G6PD基因表达(P＞0.05),针对G6PD基因表达的siRNA的干扰效率为49%(P＜0.01).结论 实时荧光定量PCR在检测细胞G6PD基因表达时具有高灵敏度、高重复性和高稳定性的特点,可进一步用于G6PD与肿瘤的相关性研究.
关键词： A375细胞 G6PD Real-time PCR 基因表达 -
中药单体对黑色素瘤细胞增殖的抑制作用及对酪氨酸酶活性的影响
目的:研究五种中药单体对人恶性黑色素瘤细胞A375体外增殖的影响和对细胞内酪氨酸酶活性的作用.方法:将具有美白功效的五种中药单体(熊果苷、丹参素、芦荟大黄素、姜黄素和丹参酮ⅡA)分别与A375细胞作用.MTT比色法观察这五种中药单体对A375细胞体外增殖的影响;多巴速率氧化法研究这些中药单体对A375细胞内酪氨酸酶活性的作用.结果:五种中药单体对A375细胞增殖均有抑制作用,且呈浓度依赖性(P<0.05).熊果苷、丹参素、芦荟大黄素、姜黄素均可抑制A375细胞内酪氨酸酶的活性;且作用48 h后,高浓度的熊果苷和丹参素仍可显著抑制酪氨酸酶活性(P<0.05),而芦荟大黄素及姜黄素虽对酪氨酸酶活性仍有抑制作用,但无统计学差异.丹参酮ⅡA在不同浓度下均未检测到对酪氨酸酶活性的抑制作用.结论:五种中药单体对A375细胞增殖均有抑制作用,且呈浓度依赖性;一定浓度的熊果苷和丹参素对A375细胞增殖抑制的同时亦可显著抑制细胞内酪氨酸酶活性;而芦荟大黄素、姜黄素、丹参酮ⅡA对细胞内酪氨酸酶活性均未见明显抑制作用.我们推测对酪氨酸酶活性的抑制作用可能是具有美白功效的中药单体熊果苷和丹参素抑制A375细胞增殖的作用机理之一,而芦荟大黄素、姜黄素及丹参酮ⅡA可能是通过其他机制来抑制细胞增殖.
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雷公藤内酯醇抑制A375细胞增殖和迁移及CCR7表达的体外实验
目的 观察雷公藤内酯醇在体外抑制人黑素瘤细胞A375增殖和迁移的能力及对细胞表面趋化因子受体CCR7表达的影响情况,初步分析其作用机制.方法 用CCK-8比色试剂盒检测雷公藤内酯醇对A375细胞增殖的作用,Transwell微孔隔离小室迁移实验检测雷公藤内酯醇对A375细胞体外迁移能力的影响,Western blot法检测雷公藤内酯醇对A375细胞CCR7蛋白表达的影响.结果 雷公藤内酯醇以剂量依赖方式抑制A375细胞的增殖,24h的IC50值为0.20μg/mL;雷公藤内酯醇能显著地抑制A375细胞的体外迁移能力(P＜0.01),侵袭抑制率约为82.84％；经不同浓度雷公藤内酯醇(0μg/mL,0.2μg/mL和0.4μg/mL)处理后,A375细胞中CCR7蛋白表达呈明显下降趋势(P＜0.05).结论 雷公藤内酯醇具有抗A375细胞增殖和体外迁移能力的作用,其机制可能与下调其表面趋化因子受体CCR7的表达相关,并且该作用呈一定的浓度依赖性.
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驱虫斑鸠菊提取物抑制恶性黑色素瘤A375细胞增殖的研究
目的 探讨驱虫斑鸠菊提取物对人恶性黑色素瘤A375细胞的增殖以及对其酪氨酸酶活性和黑色素含量的影响.方法 四甲基噻唑氮蓝比色法测定对A375细胞抑制作用;显微法观察细胞形态;比色法测定酪氨酸酶活性和黑色素含量.结果 在一定质量浓度范围(1～40 mg·L-1)内随着驱虫斑鸠菊提取物质量浓度增加可抑制黑色素瘤细胞的增殖;驱虫斑鸠菊提取物质量浓度小于10 mg·L-1,对酪氨酸酶活性和黑色素合成抑制有增加的趋势;大于20 mg·L-1时,显示一定的细胞毒性作用.结论 驱虫斑鸠菊提取物能显著抑制恶性黑色素瘤A375细胞的增殖,在一定质量浓度范围内(1～40 mg·L-1)有浓度依赖关系(P＜0.05).
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维A酸对人类恶性黑色素瘤A375细胞增殖的影响
目的:研究维A酸(RA)抑制人类恶性黑色素瘤A375细胞增殖的作用. 方法:用RA(at-RA, 13-cis-RA和9-cis-RA)、MA(RXR激动剂)及TTNPB(RAR激动剂)处理培养的人类恶性黑色素瘤A375细胞. 用MTT法研究这些试剂对细胞增殖的影响,用流式细胞仪研究这些试剂对细胞周期的影响. 结果:RA和TTNPB均可抑制A375细胞的增殖,而MA无此作用. 在作用24 h时的不同浓度(10-5, 10-6和10-7 mol/L)以及作用48和72 h的10-5 mol/L浓度时,TTNPB的抑制增殖作用均强于其它试剂处理组(P<0.05). 细胞周期分析结果显示RA和TTNPB均可诱导A375细胞G0/G1期阻滞,而MA无此作用. 在作用24和48 h时的10-5 mol/L浓度时,TTNPB的诱导G0/G1期阻滞作用均强于其它试剂处理组(P<0.05). 结论:RA可抑制人类恶性黑色素瘤A375细胞的增殖,并诱导G0/G1期阻滞. RA的这些作用与RXR的激活无关,而可能与RAR的激活有关.
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新型纳米金荧光双标survivin反义寡核苷酸探针的合成及其对人恶性黑素瘤A375细胞的影响
目的 利用纳米金独特的生物和光学特性,合成一种新型纳米金荧光双标survivin反义寡核苷酸探针,观察其对人恶性黑素瘤A375细胞的影响.方法 用柠檬酸钠还原法制备纳米金,将巯基修饰后的survivin反义寡核苷酸结合在纳米金表面,合成纳米金survivin反义寡核苷酸探针；再结合互补的带荧光标记的报告序列,制成纳米金荧光双标survivin反义寡核苷酸探针；将制备的探针转染人恶性黑素瘤A375细胞,荧光显微镜观察细胞内荧光图像,MTT法及流式细胞仪检测A375细胞的增殖及凋亡情况.结果 制备的纳米金荧光双标survivin反义寡核苷酸探针转染A375细胞后,可观察到清晰的细胞内荧光图像,可以抑制A375细胞的增殖,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),诱导细胞凋亡增多.结论 寡核苷酸功能化的纳米金颗粒可有效转染进人恶性黑素瘤A375细胞,通过反义封闭作用诱导人恶性黑素瘤A375细胞凋亡增多.
