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HPLC法测定蟾酥中4种蟾毒内酯
目的 建立同时测定蟾酥药材中蟾蜍他灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的方法.方法 10批蟾酥药材采用Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱；乙腈-0.04％三氟乙酸为流动相梯度洗脱；体积流量为1.0 mL/min;柱温为35℃；检测波长为296 nm.结果 蟾蜍他灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基分别在0.05～2.61 μg (R2 =1),0.10 ～ 4.96 μg(R2=1),0.10 ～ 5.03 μg(R2=1),0.10 ～ 5.18 μg(R2=1)范围内线性关系良好；平均加样回收率分别为97.62％,97.34％,97.23％,97.34％,RSD值均＜2.0％.结论 此方法简便、准确.10批不同来源的蟾酥样品测定结果表明,药材中蟾蜍他灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基含有量相对稳定,脂蟾毒配基含有量则波动较大.
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蟾毒灵白蛋白纳米粒与蟾毒灵在大鼠体内的药代动力学比较研究
目的:建立高效液相-串联质谱法测定大鼠血浆中蟾毒灵的浓度,评价和比较蟾毒灵白蛋白纳米粒和蟾毒灵在大鼠体内的药代动力学特征.方法:30只大鼠随机分为6组,每组5只,尾静脉单次分别注射蟾毒灵纳米粒和蟾毒灵,均设高、中、低剂量组.分别于给药后1、5、8、10、15、20、30、45、60、120、180、300和480 min从大鼠眼眶静脉丛取血,高效液相-串联质谱法测定不同时间点血浆中药物浓度,并测定药代动力学参数.结果:本实验所建立的高效液相-串联质谱法具有良好的线性、精密度和准确度.蟾毒灵纳米粒组的血浆药时曲线下面积和平均滞留时间、半衰期分别是蟾毒灵组的1.19～1.81倍、2.12～3.61倍和2.17～2.94倍.结论:蟾毒灵白蛋白纳米粒可延长蟾毒灵在血中的存留时间,具有缓释作用.
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蟾毒灵对裸鼠人肝癌移植瘤的抑制作用及对Bcl-2和Bax蛋白表达的影响
目的:探讨蟾毒灵对裸鼠人肝癌原位移植模型的抗肿瘤作用及对Bcl-2和Bax蛋白表达的影响.方法:建立裸鼠人肝癌原位移植模型,随机分为蟾毒灵高(1.5 mg/kg)、中(1 mg/kg)、低(0.5 mg/kg)剂量治疗组,阿霉素8 mg/kg治疗组和模型组.裸鼠人肝癌原位移植模型第25天测量肿瘤体积,取瘤组织做HE染色观察肿瘤坏死程度并行电镜观察,DNA原位末端标记法检测凋亡标记指数,免疫组化法检测肝癌组织中Bcl-2和Bax蛋白的表达.结果:蟾毒灵各剂量组肿瘤体积均较模型组明显缩小(P＜0.01),生存期较阿霉素治疗组及模型组延长(P＜0.05).电镜观察到蟾毒灵各组肿瘤出现明显的细胞凋亡征象,低、中、高剂量治疗组的凋亡指数分别为5.87±2.13、8.86±2.96和10.60±3.42,明显高于阿霉素治疗组的3.28±0.98(P＜0.05或P＜0.01);蟾毒灵各组瘤组织的Bax表达明显增强,而Bcl-2表达无明显改变.结论:蟾毒灵对裸鼠人肝癌原位移植模型有明显的抗肿瘤作用,其作用机制可能与上调Bax表达、诱导细胞凋亡有关.
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蟾毒灵诱导伯基特淋巴瘤细胞凋亡及初步机制研究
目的:探讨蟾毒灵(bufalin)对伯基特(Burkitt)淋巴瘤细胞的影响.方法:体外培养人伯基特淋巴瘤细胞株Daudi,以0、5、10、20、40、80 nmol/L浓度蟾毒灵处理细胞,细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测细胞抑制率,膜联蛋白(annexin) V/碘化丙啶(PI)双染后,流式细胞仪检测细胞凋亡,蛋白质印迹(Western blotting)检测凋亡相关蛋白胱天蛋白酶及B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、c-Myc的变化,实时定量(real-time) PCR检测c-Myc RNA水平的变化.结果:CCK-8检测结果显示,蟾毒灵对Daudi细胞增殖有明显的抑制作用,呈药物浓度依赖性,且经48 h处理后的抑制率明显高于24 h,半数抑制浓度(IC50)为(20.03±2.56) nmol/L;流式细胞检测结果表明,蟾毒灵可诱导Daudi细胞发生凋亡;蛋白质印迹检测结果显示,不同浓度蟾毒灵处理Daudi细胞48 h后,胱天蛋白酶3、9及多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1(PARPl)均出现明显剪切,并伴有Bcl-2及c-Myc癌基因的下调;实时定量PCR检测显示,c-Myc癌基因在mRNA水平也出现明显下调.结论:蟾毒灵能够诱导Burkitt淋巴瘤Daudi细胞株发生凋亡,下调的c-Myc及Bcl-2癌基因可能参与了这一过程.
关键词： Burkitt淋巴瘤 蟾毒灵 细胞凋亡 c-myc癌基因 -
蟾毒灵对裸鼠结肠癌原位移植瘤凋亡基因Caspase-3表达的影响
目的:探讨蟾毒灵治疗裸鼠结肠癌原位移植瘤的作用及机制.方法:应用不同剂量蟾毒灵(0.5、1.0、1.5 mg/kg)处理人结肠癌细胞株HCT-116建立的裸鼠原位移植瘤模型,分别用生理盐水(NS) (0.2 mL/只)、5-FU(25 mg/kg)做阴性(NS组)和阳性对照(5-FU组),测量移植瘤的体积,观察蟾毒灵对移植瘤的肿瘤抑制率、裸鼠生存期的影响:HE染色观察移植瘤的坏死程度；TUNEL标记法检测肿瘤细胞的凋亡指数；荧光定量PCR方法检测基因Caspase-3 mRNA的表达,免疫组化法和Western印迹法检测Caspase-3蛋白的表达.结果:蟾毒灵各剂量组和5-FU组裸鼠原位移植瘤体积明显小于NS组(P＜0.05)；NS组,5-FU组和蟾毒灵0.5、1.0、1.5 mg/kg剂量组的裸鼠中位生存期分别为40、37和47、46、45 d,生存分析显示蟾毒灵各剂量组裸鼠的生存时间与NS组相比明显延长；1.0和1.5 mg/kg剂量组和5-FU组移植瘤的坏死程度增加(P＜0.05)；蟾毒灵各组移植瘤的凋亡指数与NS组相比明显增加(P＜0.05),凋亡相关基因Caspase-3 mRNA和蛋白表达明显升高(P＜0.05).结论:蟾毒灵能够抑制裸鼠人结肠癌原位移植瘤的生长,促进肿瘤细胞凋亡,其机制可能与上调基因Caspase-3表达有关.
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中药蟾酥的研究进展
蟾酥是我国重要的传统药材,临床应用广泛且疗效显著,尤其在麻醉止痛、强心、抗肿瘤方面疗效极佳.近年来,随着我国对中西医结合临床和基础研究的重视和加强,应用现代先进科学技术对蟾酥及其活性成分、制剂类型、药理作用、临床应用和不良反应等进行了广泛研究,取得了较大进展,本文对此作一概述.
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三种蟾毒单体对SMMC-7721和BEL-7402人肝癌细胞生长的抑制作用
目的:探讨蟾蜍中主要蟾毒内酯类成分蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基的抗肝癌作用及机制.方法:以SMMC-7721、BEL-7402人肝癌细胞为靶细胞,以丝裂霉素为阳性对照药物,应用四甲基偶氮唑盐比色法、锥虫蓝染色和DNA染色分析法观察这3种蟾毒单体对肝癌细胞的生长抑制和诱导凋亡作用.结果:蟾毒灵和华蟾酥毒基对上述肝癌细胞具有明显生长抑制作用,华蟾酥毒基较蟾毒灵作用略弱,但两者达到相同生长抑制效果所需浓度均低于丝裂霉素,酯蟾毒配基只有在较高浓度下才显示对肝癌细胞的生长抑制作用;不同浓度蟾毒灵、华蟾酥毒基对人肝癌细胞细胞膜具有破坏作用;可使人肝癌细胞阻止于G2/M期,使处于S期的细胞比例降低,并有明显诱导肝癌细胞凋亡作用.结论:蟾毒灵、华蟾酥毒基对上述人肝癌细胞具有明显生长抑制作用,具有对肝癌细胞膜的直接破坏作用和诱导凋亡作用;酯蟾毒配基抗肿瘤作用较弱.
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蟾毒灵对裸鼠人结肠癌血管新生相关VEGFA蛋白表达的影响
目的:通过实验研究观察蟾毒灵对人结肠癌血管新生的作用.方法:CCK-8法检测不同浓度蟾毒灵对人脐静脉内皮细胞增殖的影响;构建裸鼠人结肠癌移植瘤模型,随机分为对照组(0.9％生理盐水)、蟾毒灵组(1.5mg·kg-1 ·d-1),药物干预4周后,观察各组裸鼠移植瘤瘤体生长情况,Western blot检测瘤体组织中血管内皮生长因子A(VEGFA)的表达.结果:蟾毒灵在2.5～ 320.0 ng/ml的浓度区间内,其对人脐静脉内皮细胞的生长抑制率为1.67％～95.40％,IC50为20.86 ng/ml,呈剂量依赖性.蟾毒灵组裸鼠移植瘤瘤体明显小于对照组(P＜0.01),蟾毒灵组瘤体中VEGFA蛋白的表达明显低于对照组(P＜0.05).结论:蟾毒灵可抑制血管内皮细胞增殖,抑制裸鼠人结肠癌移植瘤瘤体的生长,其机制可能与下调VEGFA蛋白的表达有关.
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蟾毒灵诱导人胰腺癌细胞凋亡及其对Survivin基因表达的影响
目的:探讨蟾毒灵诱导人胰腺癌细胞凋亡及其对Survivin基因表达的影响.方法:建立裸鼠人胰腺癌模型,随机分为4组:对照组(NS)、5-氟尿嘧啶组(5-Fu)、蟾毒灵组(Bu)、蟾毒灵加5-氟尿嘧啶组(Bu/5-Fu).分别腹腔注射生理盐水(NS)20 ml/kg、5-Fu 24 mg/kg、Bu 1 mg/kg、Bu 1 mg/kg+5-Fu 24 mg/kg.用药后第7天处死,计算肿瘤生长抑制率,TUNEL法检测瘤体凋亡指数,免疫组化S-P法检测survivin蛋白的表达,RT-PCR法检测Survivin mRNA的表达.结果:与NS组相比,各药物干预组瘤体体积均显著缩小(P＜0.05),凋亡指数明显增高(P＜0.01),Survivin蛋白的表达显著降低(P＜0.01).其中Bu/5-Fu组瘤体体积明显小于Bu组、5-Fu组(P＜0.05);Bu/5-Fu组凋亡指数明显高于Bu组、5-Fu组(P＜0.01);Bu/5-Fu组Sur-vivin蛋白的表达明显低于Bu组、5-Fu组(P＜0.01).结论:蟾毒灵能够抑制胰腺癌细胞增殖,诱导细胞凋亡,联合5-Fu可起到增效的作用.其作用机制可能与抑制Sunrivin基因表达有关.
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分子对接虚拟筛选蟾毒灵结合蛋白
目的 预测抗肿瘤活性成分蟾毒灵的结合蛋白.方法 采用分子对接方法 搜索结合蛋白,部分高分值靶标进行单独分子对接确证,并与已报道药理活性进行比较.结果 计算机搜索13个蛋白与蟾毒灵发生分子对接,验证分析显示二氢叶酸还原酶、PARP具有较高可信度.结论 二氢叶酸还原酶、PARP可能是蟾毒灵发挥抗肿瘤、抗炎活性的2个结合蛋白.
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蟾毒灵对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的作用
目的 探讨蟾毒灵在体外对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的作用及初步机制.方法 以不同浓度的蟾毒灵处理MDA-MB-231细胞,M T T 法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡水平,2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐法测定活性氧(ROS)水平,RT-PCR检测细胞凋亡相关基因Bax和Bcl-2 mRNA表达水平.结果 蟾毒灵可剂量依赖性地降低MDA-MB-231细胞的存活率,诱导细胞凋亡(P<0.01).蟾毒灵处理细胞后,细胞内ROS水平增加(P<0.01),Bax mRNA表达增加,而Bcl-2 mRNA 表达减少(P<0.05或P<0.01).结论 蟾毒灵在体外能抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖,诱导细胞凋亡,该作用可能与其升高细胞内ROS水平、上调Bax/Bcl-2的比例有关.
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蟾毒灵抑制胆总管癌细胞QBC-939增殖和诱导凋亡的实验研究
目的 观察蟾毒灵对人胆管癌细胞QBC-939增殖和凋亡的影响,以及凋亡相关蛋白表达量的变化.方法 体外培养人胆管癌QBC-939细胞,运用MTT检测蟾毒灵对胆管癌细胞增殖的影响,采用流式细胞仪检测蟾毒灵对胆管癌细胞凋亡率和线粒体膜电位的影响;并采用Western blotting检测凋亡相关蛋白Caspase3、激活型的Caspase3(Cleaved-Caspase3)和Cleaved-PARP的表达量变化.结果 蟾毒灵对人胆管癌细胞QBC-939增殖具有明显抑制作用,在一定浓度下表现出时间、剂量依赖性.流式细胞仪检测显示:细胞的凋亡率明显增加;线粒体膜电位随蟾毒灵浓度增加,膜电位发生下调.Western blotting结果显示:蟾毒灵处理QBC-939细胞48h后,Caspase3蛋白被剪接活化,激活型的Caspase3(Cleaved-Caspase3)表达量升高;同时,Caspase3的作用底物多聚聚合酶PARP的降解产物(Cleaved-PARP)表达明显升高,且呈浓度依赖性.结论 蟾毒灵能够明显抑制人胆管癌QBC-939细胞的增殖,并呈时间和浓度依赖性;线粒体凋亡途径在蟾毒灵的抗癌过程中发挥了作用.
关键词： 蟾毒灵 人胆管癌细胞QBC-939 凋亡 增殖 -
蟾毒灵联合组蛋白脱乙酰酶抑制剂SAHA抗多发性骨髓瘤细胞的效应
目的:探讨蟾毒灵联合组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂SAHA抗多发性骨髓瘤(MM)细胞的效应.方法:采用CCK-8试剂盒和RH-123、PI染色流式检测仪检测蟾毒灵对MM细胞株的生长抑制效应.同时用CCK-8试剂盒检测SAHA单药、联合蟾毒灵对MM细胞株的生长抑制效应.结果:蟾毒灵以较低的药物浓度即可较强抑制H929、U266、CZ-1细胞株的生长,48 h的IC50浓度在10～20 nmol/L;并且蟾毒灵主要引起H929、U266、RPMI8226细胞株MM细胞发生S期及G2-M期的细胞周期阻滞,可通过引起细胞内线粒体的损伤而导致后续的细胞凋亡的发生.SAHA也可使H929及CZ-1细胞发生明显的生长抑制.两药共同作用于H929细胞48 h,较单药有显著的联合作用,10 nmol/L的蟾毒灵可以使SAHA相应浓度作用下的细胞生长活性下降30％左右(P<0.01).结论:蟾毒灵、SAHA均有诱导MM细胞生长抑制,甚至凋亡的作用,但两药联合可以以更低的药物浓度发挥强有效的抗MM细胞作用.
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蟾毒灵诱导肝癌细胞凋亡机制的研究及意义
肝癌90％为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC),为常见恶性肿瘤之一,每年全世界大约增加750,000名新的肝癌患者,有600,000患者死于肝癌,死亡率位居恶性肿瘤第二位,严重威胁人类的健康.每年新发肝癌病例中55％发生于中国,我国肝癌死亡率位居各种癌症死亡率的第2位,仅次于肺癌[1-2].肝癌的治疗主要包括外科手术、消融、放射和药物治疗等,但肝癌患者能够手术切除不足30％,且对放射治疗敏感性差,常规化疗药物(如阿霉素、5-Fu、顺铂等)治疗不仅毒副作用大,而且不能明显缓解疾病进展或延长患者生命,因此研发新型有效的抗肝癌药物是目前提高肝癌治疗疗效,延缓肿瘤复发与转移,提高患者生存期的重要途径.
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蟾毒灵对人膀胱癌T24细胞增殖和凋亡的影响
目的:研究蟾毒灵对人膀胱癌T24细胞增殖和凋亡的影响,初步探讨其在膀胱癌中的抗肿瘤机制.方法:采用MTT法测定蟾毒灵对人膀胱癌T24细胞增殖的影响;流式细胞术(FCM)检测蟾毒灵对癌细胞凋亡和细胞周期的影响;RT-PCR法检测癌细胞周期蛋白D1 (CyclinD1)基因表达情况.结果:蟾毒灵可抑制人膀胱癌T24细胞的增殖,并呈现出时间和浓度依赖性;蟾毒灵能诱导T24细胞凋亡;20 nmol/L浓度的蟾毒灵预处理膀胱癌T24细胞后,与对照组(36.42％)进行比较,可分别在12 h(69.76％)和24 h(88.14％)显著诱导细胞G0/G1期阻滞(P＜0.05),且可降低膀胱癌T24细胞的CyclinD1mRNA表达水平.结论:蟾毒灵能显著抑制人膀胱癌T24细胞增殖,诱导T24细胞G0/G1周期阻滞,下调人膀胱癌T24细胞CyclinD1基因表达.
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蟾毒灵血浆蛋白结合率的研究
目的:建立测定蟾毒灵血浆蛋白结合率的方法.方法:采用平衡透析法,测定不同浓度蟾毒灵与血浆的蛋白结合率.结果:蟾毒灵在透析外液中的线性范围为0.4～ 23.6 μg/mL,透析内液中为0.3～11.8 μg/mL.三种不同浓度的蟾毒灵在透析外液和透析内液中回收率分别为90.2％、94.1％、93.1％和89.4％、86.1％、85.7％.蟾毒灵的平均血浆蛋白结合率为96.82％.结论:蟾毒灵的血浆蛋白结合率跟药物浓度不呈依赖性.
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产地对蟾酥鲜浆成分组成影响的研究
目的：研究不同产地蟾酥鲜浆中成分组成的差异，探讨蟾酥药材质量差异较大的原因。方法：采用高效液相色谱法测定不同产地的蟾酥鲜浆中脂蟾毒配基、华蟾酥毒基、蟾毒灵3种蟾毒配基类成分的含量，比较不同产地蟾酥鲜浆液相色谱图谱的相似性。结果：不同产地蟾酥鲜浆中脂蟾毒配基、华蟾酥毒基、蟾毒灵含量及三者之间的组成比例和液相色谱图谱有较大的差异。在不考虑加工过程对成分影响的前提下，只有山东、辽宁、安徽产的蟾酥符合《中国药典》的规定，且液相色谱图谱相似度较大。结论：不同产地的蟾酥鲜浆成分组成存在明显的差异，应完善蟾酥的质量控制体系，保证其用药的安全性和有效性。
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蟾毒灵纳米混悬液对HepG2细胞增殖及细胞摄取研究
目的:制备蟾毒灵纳米混悬液(BU-NS)并研究其制剂学特点,以及该制剂对人肝癌HepG2细胞增殖及细胞摄取的影响.方法:采用反溶剂沉淀法制备BU-NS.用粒度仪测定其粒径,用透射电镜(TEM)进行形态学考察.采用MTT法检测蟾毒灵原药(BU)和BU-NS对HepG2细胞的增殖抑制作用,运用高效液相色谱法(HPLC)对药物细胞摄取进行定量研究.结果:BU-NS的平均粒径为(390.0±8.1)nm,多分散系数为0.22 ± 0.04,Zeta电位为(-9.05 ± 1.21 )mV.TEM观察发现BU-NS呈不规则球形,粒径与粒度仪所测结果基本一致.短期物理稳定性研究表明,BU-NS在4 ℃:下避光保存15 d后基本保持稳定.细胞增殖抑制作用实验表明,4h内BU-NS对HepG2细胞增殖的抑制作用明显强于BU原药.细胞摄取研究发现BU-NS可增加HepG2细胞对BU的摄取.结论:BU-NS具有增强抑制HepG2细胞增殖与细胞摄取的作用,纳米混悬技术可为蟾毒灵的进一步开发提供新的思路.
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蟾毒灵抗肿瘤作用分子机制
蟾酥在中医药抗肿瘤治疗方面已有悠久的历史,其单体蟾毒灵被认为是具有抗肿瘤活性的有效成分之一.从诱导肿瘤细胞凋亡、分化,抑制细胞增殖及血管生成,增强放化疗药物的敏感性等方面阐述蟾毒灵抗肿瘤作用的分子机制,可以为深入研究蟾毒灵及其发展和临床用药提供依据.
关键词： 抗肿瘤药 药理作用分子作用机制 蟾毒灵 -
脂蟾毒配基、华蟾酥毒基、蟾毒灵配伍对BEL-7402人肝癌细胞的抑制作用
目的：研究蟾酥中脂蟾毒配基、华蟾酥毒基和蟾毒灵三种成分单体及配伍对BEL-7402人肝癌细胞的抑制作用。方法：采用MTT法测定蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基单体不同浓度和时间点，三种成分两两配伍以及三种成分配伍对BEL-7402人肝癌细胞增殖的抑制作用。结果：蟾毒灵对BEL-7402人肝癌细胞增殖的抑制作用强，其次是华蟾酥毒基，脂蟾毒配基的作用弱；脂蟾毒配基不能增强华蟾酥毒基、蟾毒灵的作用，且有抑制作用的趋势；华蟾酥毒基与蟾毒灵混合使用与单独使用的抑制作用无明显区别。结论：欲发挥三种成分的抗肿瘤作用，应该单独使用，或者华蟾酥毒基与蟾毒灵混合使用。
