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麦冬皂苷D对氧糖剥夺/复氧后新生鼠大脑皮层离体星形胶质细胞HIF-1α-VEGF通路的作用
目的:探讨麦冬皂苷D对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)后星形胶质细胞HIF-1 α-VEGF通路的作用.方法:分离培养和鉴定新生大鼠星形胶质细胞,建立星形胶质细胞OGD/R模型;设正常组、模型组、麦冬皂苷D给药组;在OGD4h/R2h、4h、6h后用ELISA检测星形胶质细胞细胞培养液中VEGF蛋白表达量,Western Blot检测星形胶质细胞胞核内HIF-1 α蛋白的含量,免疫荧光检测星形胶质细胞及其在OGD/R后细胞的光密度、面密度和阳性细胞数量.结果:模型组VEGF、HIF-1α蛋白含量高于正常组(P＜0.05,P＜0.01),麦冬皂苷D给药组高于模型组(P＜0.05,P＜0.01),且随再灌注时间延长,VEGF、HIF-1 α蛋白含量呈增加趋势.模型组星形胶质细胞的面密度、光密度、阳性细胞个数较正常组均明显降低(P＜0.01),麦冬皂苷D给药组星形胶质细胞的面密度、光密度、阳性细胞个数较模型组均显著升高(P＜0.05,P＜0.01).结论:麦冬皂苷D能够促进OGD/R后新生鼠离体星形胶质细胞的增殖;麦冬皂苷D能够明显上调OGD/R后新生鼠离体星形胶质细胞VEGF、HIF-1α的蛋白含量;麦冬皂苷对OGD/R后神经损伤的保护及修复作用可能是通过星形胶质细胞HIF-1 α-VEGF通路实现的.
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三七皂苷R1通过雌激素受体调节ATF6/Akt信号通路减轻OGD/R所导致的神经元损伤
三七皂苷R1(notoginsenoside R1,NGR1)是传统中药三七的重要活性成分,也是雌激素受体激动剂.因其蕴含抗炎、抗氧化、抗凋亡等多种 功能,故在疾病治疗中被普遍运用.为阐明NGR1在缺血缺氧性脑病(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)中的潜在神经保护作用机制,该研究采用原代皮层神经元建立氧糖剥夺再灌 注(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)损伤模型,并且给予NGR1及雌激 素受体阻断剂ICI-182780处理,然后分别采用MTT,LDH和Hochest 33342染色检测神经元存活率、细胞膜完整性和凋亡,Western blot检测抗凋亡通路ATF6α,p-Akt,Akt蛋白及凋亡相关蛋 白Bax,Cleaved Caspase-3的表达.结果显示:神经元在OGD/R损伤后,其细胞存活率明显下降(P<0.05)、细胞膜相对完整性显著降低(P<0.05)、细胞凋亡加重(P<0.05),ATF6α,p-Akt表达下调且促凋亡蛋白Bax,Cleaved Caspase-3表达增加(P<0.05).NGR1处理后能够减轻OGD/R造成的神经元细胞损伤,上调ATF6α表达、促进Akt磷酸化并 且减少Bax,Cleaved Caspase-3蛋白的表达(P<0.05),但是,NGR1的这些神经保护 性作用能够被雌激素受体阻断剂ICI-182780阻断.研究结果证实:NGR1在缺血缺氧情况下 对神经元具有保护性作用,该保护作用可能是NGR1通过雌激素受体调控ATF6/Akt信号通路实 现的.
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大蒜素对氧糖剥夺再灌注致PC12细胞损伤的保护作用及抗氧化应激机制
目的 探讨大蒜素(AL)保护氧糖剥夺再灌注(OGD/RP)致PC12细胞损伤的抗氧化应激机制.方法 采用无糖的Earle's平衡盐溶液加缺氧法复制氧糖剥夺再灌注致PC12细胞损伤模型,同时给予不同浓度的大蒜素进行干预.采用MTT法检测细胞存活率;化学比色法测定细胞乳酸脱氢酶(LDH)漏出率;Hoechst 33342染色法检测大蒜素对细胞凋亡的影响,并计算凋亡率;生化法检测细胞超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性或含量;RT-PCR和Western blotting分子生物学方法检测氧化应激相关因子SOD、肿瘤坏死因子(TNF-α)、过氧化氢酶(CAT)mRNA和蛋白的表达.结果 与正常对照组比较,OGD/RP模型组PC12细胞存活率下降,LDH漏出率、细胞凋亡率明显升高;细胞SOD、GSH-Px活性明显降低,MDA含量明显升高;细胞SOD、CAT mRNA及蛋白表达明显下降,TNF-αmRNA及蛋白表达明显增加.与模型组比较,大蒜素(60、30mg/L)可显著升高OGD/RP PC12细胞的存活率,降低凋亡率和LDH漏出率;大蒜素(60、30mg/L)可显著升高OGD/RPPC12细胞SOD、GSH-Px活性,减少MDA含量;大蒜素(60mg/L)可明显升高OGD/RP PC12细胞SOD、CAT mRNA及蛋白表达,降低TNF-αmRNA及蛋白表达.结论 大蒜素对OGD/RP致PC12细胞损伤具有保护作用,其机制与抗氧化应激有关.
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氧糖剥夺再灌注引起的SH-SY5Y细胞凋亡与NF-κBp65和COX-2蛋白表达的关系
目的 探讨氧糖剥夺再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)后SH-SY5Y细胞凋亡情况及NF-κB信号通路NF-κBp65、COX-2蛋白的表达.方法 将SH-SY5Y细胞分为正常对照组、氧糖剥夺4 h/再灌注24 h组(OGD/R)组.利用流式细胞术分别检测各组细胞凋亡率,蛋白印记法(Western blot)检测p65和COX-2的蛋白表达情况.结果 与正常对照组比较,OGD/R组细胞凋亡率明显增高(P<0.05),p65和COX-2的蛋白表达也明显增高(P<0.05).结论 氧糖剥夺4 h/再灌注24 h能够促进细胞凋亡,其机制可能是通过NF-κBp65对COX-2调控的信号通路来实现.
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AMPK对氧糖剥夺再灌注后小胶质细胞介导炎性反应的影响
目的：探讨氧糖剥夺再灌注（OGD／R）损伤后腺苷酸活化蛋白激酶（AM PK ）对小胶质细胞介导的炎性介质释放及信号传导的影响。方法培养BV2细胞株，应用OGD 6 h再灌注24 h建立缺血再灌注损伤离体模型，AICAR（5μmol／L、50μmol／L、100μmol／L）或 Compound C（0．1μmol／L、1μmol／L、10μmol／L）不同程度激活或抑制AMPK磷酸化，MTT法检测细胞活性，免疫印迹及ELISA方法，检测OGD／R后BV2细胞AMPK活性变化，以及对NF－κB信号通路中IκB磷酸化、TNF－α释放的影响。结果各浓度AICAR均能够促进OGD／R后BV2细胞存活（P ＜0．05），抑制IκB磷酸化水平（P ＜0．05），AICAR（100μmol／L）能够增加AMPK磷酸化水平（P ＜0．05），抑制TNF －α的释放（P＜0．01）。而Compound C（10μmol／L）促进BV2细胞死亡（P＜0．01），降低OGD／R后AMPK及IκB磷酸化水平（P ＜0．05），促进 TNF －α释放（P ＜0．05）。结论 AMPK 磷酸化激活能够减轻OGD／R后BV2细胞介导的炎性损伤作用，而抑制AM PK磷酸化能够加重神经炎性反应。
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枸杞多糖对氧糖剥夺再灌注损伤后海马神经元凋亡与自噬性死亡的作用
目的 探究枸杞多糖(LBP)对原代海马神经元氧糖剥夺再灌注(OGD/R)损伤的保护作用及对细胞凋亡与自噬性细胞死亡的调节作用. 方法 将原代培养的小鼠海马神经元分为5组,对照组(不做OGD/R处理)、OGD/R组和OGD/R+LBP 15 μg/mL组、OGD/R+LBP 30 μg/mL组、OGD/R+LBP 60 μg/mL组.采用MTT法检测细胞存活率,LDH释放率测定细胞损伤程度,TUNEL染色法检测凋亡率,免疫荧光染色法观察活化型Caspase-3定位,Western blotting法测定蛋白表达量. 结果 OGD/R损伤后,细胞存活率显著降低,而不同浓度LBP(15、30、60 μg/mL)处理可明显减轻细胞损伤并降低LDH漏出率.TUNEL染色法检测显示OGD/R+LBP 60 μg/mL组细胞阳性凋亡数明显降低.免疫荧光染色法和Western blotting结果显示,与OGD/R组相比,OGD/R+LBP 60μg/mL组活化型Caspase-3/Caspase-3比值、LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ比值、Beclin 1蛋白表达明显减低,Bcl-2/Bax比值、p62蛋白表达明显增加,差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 LBP通过抑制细胞凋亡与自噬性细胞死亡对OGD/R诱导的海马神经元损伤起保护作用.
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右美托咪定预处理减轻氧糖剥夺再灌注条件下HUVECs的损伤
目的 探讨右美托咪定预处理对氧糖剥夺再灌注条件下人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVECs) 的保护作用.方法 体外培养HUVECs,分为4组: 对照组(NC组),ogd /r组(加入等体积的PBS),Dex + ogd /r组(加入50 μmol /L的右美托咪定预处理2 h),Dex + YOH + ogd /r组(加入50 μmol /L的右美托咪定和100 μmol /L育亨宾预处理2 h) .对照组置于正常条件下培养,其他3组细胞置于Hank's液中于缺氧恒温细胞培养箱内培养12 h,之后换正常培养基置于常氧恒温培养箱内培养4 h.采用CCK-8试剂盒检测细胞活力,取细胞培养基上清液检测LDH活力.用流式细胞仪检测细胞内活性氧水平和钙离子水平,用Rhodamine-123检测细胞线粒体膜电位的高低.结果 与NC组相比,ogd /r组细胞活力明显下降(P＜0. 05),LDH释放水平升高(P＜0. 05),胞内活性氧和钙离子水平升高(P＜0. 05),线粒体膜电位降低(P＜0. 05);与ogd /r组相比,Dex + ogd /r组细胞活力升高(P＜0. 05),LDH释放水平降低(P＜0. 05),胞内活性氧和钙离子水平降低(P＜0. 05),线粒体膜电位升高(P＜0. 05);与Dex + ogd /r组相比,Dex + YOH + ogd /r组细胞活力下降(P＜0. 05),LDH释放水平升高(P＜0. 05),胞内活性氧和钙离子水平升高(P＜0. 05),线粒体膜电位降低(P＜0. 05) .结论 右美托咪定预处理可以减轻氧糖剥夺再灌注造成的HUVECs损伤,可能与激活α 受体有关.
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补阳还五汤通过上调SIRT1抑制脑微血管内皮细胞氧糖剥夺再灌注诱导氧化应激损伤
目的:通过建立氧糖剥夺再灌注模型,观察补阳还五汤对氧糖剥夺再灌注诱导脑微血管内皮细胞(rBMECs)氧化应激损伤的作用,并进一步探讨沉默调节蛋白1(Sirtuin type 1,SIRT1)是否是其发挥作用的靶点.方法:分离培养原代大鼠脑微血管内皮细胞,建立体外氧糖剥夺再灌注损伤模型,SD大鼠按15g/kg的剂量每日灌胃给药补阳还五汤1次,连续灌胃1周后分离得到血清,将细胞分为尼莫地平组、对照组、模型组、补阳还五汤含药血清低剂量组(10％),补阳还五汤含药血清高剂量组(20％),应用CCK-8法检测细胞存活率,测定补阳还五汤含药血清对rBMECs活力的影响,检测细胞中乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)及活性氧簇(ROS)含量,并采用Westem blot、实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测SIRT1表达水平.结果:与对照组相比,氧糖剥夺再灌注处理组的细胞存活率明显降低,LDH活性及ROS、MDA的含量升高,SIRT1蛋白、mRNA表达明显下降;与损伤组相比,10％、20％的补阳还五汤含药血清能明显提高氧糖剥夺再灌注损伤后细胞的存活率,降低LDH、ROS、MDA的含量,提高SIRT1蛋白、mR-NA的表达;尼莫地平组与补阳还五汤高低剂量组差异无显著.结论:补阳还五汤对脑微血管内皮细胞氧糖剥夺再灌注诱导的氧化应激损伤具有明显的保护作用,其作用机制可能是通过上调SIRT1表达水平实现的.
关键词： 补阳还五汤 大鼠脑微血管内皮细胞 氧糖剥夺再灌注 SIRT1 氧化应激
