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新扶正除疫颗粒抗柯萨奇病毒B3作用评价
目的 评价新扶正除疫颗粒抗柯萨奇病毒B3(CVB3)感染的效果.方法 将60只小鼠随机分为空白对照组、病毒模型组(A组)、新扶正除疫颗粒低、中、高剂量组(B、C、D组)、阳性药物对照组(E组).给除空白对照组以外的每只小鼠腹腔注射50μL柯萨奇病毒液(10×TCID50).每天观察小鼠的发病体征及死亡情况,计算生存率,检测病毒滴度,观察心肺组织病理变化.结果 给药第3天时D组死亡率仅10％,第7天时仅为20％,显著低于A组、B组和C组,与E组基本相同.检测不同组心、肺中病毒滴度,发现D组显著低于A组、B组和C组(P<0.01).在比较小鼠脏器组织病理观察方面,D组与E组对肺组织的影响结果相似,病理变化轻微,炎症反应明显弱于A组.结论 新扶正除疫颗粒能降低柯萨奇病毒B3感染小鼠的死亡率和病毒滴度,对心肺组织有保护作用.
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大黄茶抗柯萨奇病毒B3(CVB3)的实验研究
目的:观察大黄茶抗CVB3的作用.方法:通过活细胞计数评价了大黄茶对Hep-2细胞的细胞毒作用;通过观察病毒感染后的细胞病变效应计算病毒抑制率,并且用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测药物作用后细胞冻融液中的病毒核酸(CVB3-RNA),评价了大黄茶在细胞培养中的抗CVB3作用.结果大黄茶对Hep-2细胞的半数细胞毒性浓度在0.4mg/ml以上,对CVB3的半数抑制浓度在90μg/ml以内.结论:大黄茶安全性较高并能有效的抑制柯萨奇病毒B3在Hep-2细胞中的增殖.
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钙在CVB3诱导大鼠心肌细胞凋亡中的作用
目的探讨细胞内游离钙[Ca2+] i在柯萨奇病毒B3(CVB3)诱导培养心肌细胞凋亡中的作用.方法 DNA裂点检测法(3′-末端标记)及透射电镜检测细胞凋亡.Fluo3-AM负载心肌细胞,共聚焦显微镜观察[Ca2+] i荧光强度变化.结果感染24 h心肌细胞内CVB3滴度达峰值.感染10 h未见凋亡的心肌细胞,17、24和36 h凋亡细胞分别为5%、60%和90%,感染17 h心肌[Ca2+] i浓度达峰值.电镜结果提示CVB3感染组存在典型的凋亡心肌细胞.结论 CVB3可诱导培养心肌细胞的凋亡过程.细胞内Ca2+参与凋亡细胞的信息传导过程,并在凋亡早期发挥重要作用.
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柯萨奇病毒B3的多克隆抗体制备
目的 制备柯萨奇病毒B3( coxsackievirus B3,CVB3)的多克隆抗体.方法 针对CVB3基因的VP1区设计特异性引物,RT-PCR扩增VP1基因并将其克隆到pGEX-6p-1中,经IPTG诱导表达后,以GST-VP1融合蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体.采用ELISA、Western blot以及间接免疫荧光检测多克隆抗体的效价和特异性.结果 ELISA检测血清的效价不低于1∶64000,Western blot 和间接免疫荧光显示该抗体具有良好的特异性.结论 成功制备了效价较高的CVB3多克隆抗体,可应用于CVB3蛋白的检测.
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柯萨奇病毒心肌病动物模型研究
目的 研究反复增量柯萨奇病毒B3m(CVB3m)感染对小鼠心肌的影响,建立病毒性心肌病动物模型.方法 80只3~4周龄雄性Balb/c小鼠,随机分为心肌病组、单次感染组和正常对照组,于首次感染病毒后第120 d处死小鼠,应用阻抗微分法测定心输出量,病理及组织化学技术分析心肌病理损伤和胶原系统改变,计算胶原容积分数.结果 心肌病组小鼠死亡率增高,心脏重量增加,心功能下降,心肌胶原容积分数高于单次感染组和对照组(P＜0.05),病理学特征为基质胶原明显增生重建.结论 反复增量病毒感染产生了明显的心室重构,符合心肌病特点,可做为病毒性心肌病动物模型进一步研究.
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柯萨奇病毒B3蛋白酶2A干扰核因子κB p65的二聚体形成和核转移
为探讨柯萨奇病毒B3(CVB3)蛋白酶2A是否通过干扰核因子κB(NF-κB)的核定位而影响细胞因子表达,构建CVB3蛋白酶2A的表达载体pcDNA3.1-2A.将此表达载体与核转录因子NF-κB基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-NF-κB promotor-Luc共转染细胞,经肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激,检测荧光素酶表达;通过免疫荧光和蛋白免疫印迹检测CVB3蛋白酶2A对NF-κB核定位和二聚体形成的影响.结果显示,CVB3蛋白酶2A可减少NF-κB二聚体形成,并干扰其核转移.本研究证实,CVB3蛋白酶2A可通过干扰NF-κB二聚体形成和核转移而影响细胞因子分泌.
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毛壳素显著抑制柯萨奇病毒 B3的体外复制
柯萨奇病毒B3（CVB3）是一种常见的人类病原体，与多种疾病有关。本研究旨在探讨球毛壳菌代谢产物毛壳素对CVB3在体外培养细胞系中复制的影响。结果显示，毛壳素显著抑制CVB3在体外培养细胞系中的复制。250 nmol/L毛壳素可使 CVB3感染的 HeLa细胞相对存活率从未加毛壳素时的（21．9±1．8）％提高至（70．1±4．3）％。同时，毛壳素处理的HeLa细胞中病毒产量仅为对照组的（5．3±0．8）％，而病毒RNA水平也仅为对照组的（13．0±8．3）％。毛壳素也可使CVB3感染的Vero细胞相对存活率从（64．6±1．7）％提高至（87．2±4．8）％。毛壳素的这种抑制作用可被抗氧化剂 N-乙酰半胱氨酸部分抑制。研究毛壳素抑制病毒复制的具体作用机制将有助于新型抗病毒药物的研制。
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CVB3诱导的病毒性心肌炎小鼠模型中CD4+ T细胞亚群格局及其作用
本研究主要关注BALB/c小鼠感染柯萨奇病毒B3型(CVB3)后CD4+ T细胞亚群格局的变化及其对病毒性心肌炎发病的贡献度.CVB3腹腔感染小鼠后第7d,通过小鼠体重下降率、心肌损伤血清学指标肌酸激酶(CK)活性以及心肌组织病理学改变等多项指标证实小鼠心肌炎模型的成功建立.经Real-time PCR检测感染第7d脾脏CD4+ T细胞亚群主要细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17A、IL-17F及转录因子Foxp3表达情况;以流式细胞术检测了CD4+ T细胞各亚群比例,并通过多元线性回归分析法评估了各T细胞亚群对病毒性心肌炎发病的影响.结果显示,与对照组相比,CVB3感染小鼠脾脏IL-17A、IL-17F、IFN-γ表达均显著上升(分别约为12、8.5、5倍),而IL-4和Foxp3表达无明显变化.CVB3感染小鼠脾脏中CD4-IL-17-Th17细胞的上调幅度为明显,约2.75倍,其次为IFN-γ+ Th1细胞,上调约2.27倍,而Th2和Treg细胞无明显变化.进一步统计学分析显示,Th17对病毒性心肌炎发病的贡献度高(1.808),Th1次之,贡献度为1.581,而Th2和Treg对病毒性心肌炎发病无显著影响,提示CD4+ T细胞亚群格局变化与病毒性心肌炎发病密切相关,其中以Th17对心肌炎发病的贡献度尤为显著.
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急性病毒感染对小鼠心肌糖蛋白130的基因及蛋白表达的影响
目的:探讨糖蛋白130(glycoprotein 130)在病毒性心肌炎中的作用.方法:建立病毒性心肌炎小鼠模型,观察其心肌病理和血清IL-6水平;用RT-PCR方法观察小鼠心肌gp130 mRNA的表达;Western blot方法观察gp130蛋白的表达.结果:病毒组与正常对照组相比,病毒组小鼠心肌病变检出率和血清IL-6水平显著高于对照组(P<0.001);心肌gp130 mRNA表达亦见明显增高(P<0.01),其蛋白表达未见明显改变(P>0.05).结论:急性病毒感染促使小鼠心肌gp130基因表达,机制有待进一研究.
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槐果碱体外抗柯萨奇病毒B3m的作用
目的 以HeLa细胞为模型,观察从苦参中提取的槐果碱在体外抗柯萨奇病毒B3m(CVB3m)的作用.方法 ①用微量细胞培养法观察槐果碱对HeLa细胞的毒性.②用细胞病变效应(CPE)抑制法观察槐果碱体外抗CVB3m作用.③用MTT法和结晶紫染色法观察槐果碱对CVB3m感染的HeLa细胞的保护作用:在96孔板上种植HeLa细胞并予CVB3m吸附1 h,加入不同浓度的槐果碱,并设立病毒、细胞、槐果碱对照,培养15 h后以MTT法和结晶紫染色法测定比较各组细胞能量代谢率和细胞存活数.结果 ①槐果碱稀释到＜391 μg/mL,对HeLa细胞无毒性;≥783 μg/mL引起HeLa细胞CPE.②槐果碱6.25 ～ 50 μg/mL有直接抗病毒作用,减轻CPE;＞100 μg/mL反而会加重、加快CPE.③槐果碱1.56 ～ 25 μg/mL对感染CVB3m的HeLa细胞有保护作用,用MTT法和结晶紫染色法测得细胞能量合成代谢、细胞存活数较病毒对照组增加(P＜0.05);槐果碱在50、100 μg/mL时反而加重病毒对细胞的抑制,使细胞存活数、细胞代谢率较病毒对照组下降(P＜0.05).结论 一定浓度的槐果碱在体外有抗CVB3m作用,对感染CVB3m的HeLa细胞有保护作用.
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肿瘤坏死因子-α在病毒性心肌损伤过程中的研究
目的 对照病毒性心肌细胞损伤的组织学改变,研究肿瘤坏死因子-a(TNF-α)的动态变化及意义.方法 于Balb/c小鼠腹腔接种1×108TCID50柯萨奇病毒B3(CVB3)液,诱发心肌损伤的发生.在CVB3感染后观察21d,分别在第3、6、9、12、15、18、21 d,留取外周血检测TNF-α,留取心肌组织进行病理组织学观察.结果 对照组心肌细胞无改变,实验组小鼠心肌细胞出现肿胀,横纹不清,胞质染色嗜酸性增强,胞核出现核固缩及核碎裂,变性、坏死崩解,胞核和细胞轮廓消失,周围出现炎性细胞浸润(主要是单核细胞和淋巴细胞),间质内可见较多的胶原纤维,可见钙化灶;血浆TNF-α水平经病毒接种即上升,在第6d达峰值,与炎症反应密切相关.结论 柯萨奇病毒B3可引起心肌细胞损伤,损伤的高峰期在两周左右,TNF-α参与了心肌损伤的过程.
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病毒性心肌炎差异表达蛋白MYL4的筛选鉴定及表达研究
目的:调查心肌肌球蛋白轻链4(myosin light polypeptide 4,MYL4)在病毒性心肌炎损伤中的作用.方法:随机将Balb/c小鼠分为实验组(n=30)和对照组(n=10),实验组用于建立柯萨奇病毒B3病毒性心肌炎小鼠模型,分别在病毒感染后第3、7、14天留取心脏及血清标本.利用差异蛋白质组学的方法鉴定了部分的病毒性心肌炎差异表达蛋白,并对其中一个分子MYL4在病毒性心肌炎发病中的作用进行研究.结果:质谱鉴定6个差异表达分子分别为:MYL4、热休克蛋白B1、异柠檬酸脱氢酶a亚单位、电压依赖的阴离子通道蛋白、蛋白酶体a亚单位1型和巨噬细胞封端蛋白.Western blot及ELISA验证发现MYL4在病毒性心肌炎小鼠心脏组织及血清中表达明显升高(P＜0.01),且ELISA结果显示MYL4的表达与疾病严重程度呈正相关(r=0.97,P＜0.00).结论:MYL4在病毒性心肌炎组织及血清中表达升高,参与了病毒性心肌炎的发生发展.
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小鼠病毒性心肌损伤过程中炎症介质表达异常及其组织学改变的研究
目的:研究小鼠柯萨奇病毒B3感染过程中炎症介质动态表达与心肌组织损伤间的关系.方法:于Balb/c小鼠腹腔接种1×108 TCID50柯萨奇病毒B3(CVB3)液,诱发心肌损伤的发生,在CVB3感染后观察21天,分别在第3、6、9、12、15、18和21天,采集外周血作肿瘤坏死因子(TNF-α)和一氧化氮合酶(NOS)分析,并留取心肌组织进行病理组织学观察.结果:对照组心肌无改变,实验组小鼠心肌细胞出现肿胀,横纹不清,胞质染色嗜酸性增强,胞核出现核固缩及核碎裂、变性、坏死崩解,胞核和细胞轮廓消失,周围出现炎性细胞浸润(主要是单核细胞和淋巴细胞),间质内可见较多的胶原纤维,可见钙化灶;超微结构的电镜观察,可见线粒体肿胀、嵴断裂、严重空泡样变及细胞核异形变、染色质浓缩边聚.在病毒感染过程中,NOS和TNF-α异常升高并呈动态的双峰型改变,第2峰与心肌的损伤密切相关.结论:柯萨奇病毒B3感染引起心肌细胞损伤,可能与炎症介质、细胞因子的参与有关.
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黄芪总皂甙对病毒性心肌炎小鼠慢性期SERCA活性的影响
目的探讨黄芪提取物-黄芪总皂甙对柯萨奇病毒B3(CVB3)感染的病毒性心肌炎(VMC)小鼠慢性期心肌肌浆网钙泵(SERCA)活性变化的影响.方法将BALB/C小鼠分为正常组(31只)、模型组(36只)及黄芪组(26只),模型组及黄芪组每只小鼠以2×104TCID50CVB3(TCID50为10-5.83)腹腔注射感染.黄芪组每鼠每天腹腔注射0.15ml黄芪总皂甙注射液,正常及模型组予同体积的生理盐水.3个月后,观察各组小鼠死亡率及心肌病理改变,检测血清心肌肌钙蛋白I(cTnI)含量及心肌组织中SERCA活性.结果 (1)和正常组、黄芪组相比,模型组小鼠死亡率显著增高(P＜0.05～0.001).(2)感染3个月后模型组、黄芪组心肌肌钙蛋白I(cTnI)及心肌病理改变与正常组无显著性差异(P＞0.05).(3)模型组心肌SERCA活性显著低于正常组及黄芪组(P＜0.01).结论黄芪总皂甙可以降低VMC小鼠的死亡率,对慢性期病毒感染所致心肌组织SERCA功能下调有逆转作用.
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大蒜多糖体外抗柯萨奇病毒B3作用
目的研究大蒜多糖体外抗柯萨奇病毒B3 (Coxsackievirus group B type 3, CVB3)作用.方法观察大蒜多糖A,B,C的细胞毒性、对CVB3直接灭活作用、抗CVB3吸附作用及对CVB3生物合成抑制作用.结果大蒜多糖A,B,C对Hep-2细胞的半数中毒浓度(TC50)分别为1000,800,4000μg/mL;均无直接灭活CVB3及抗CVB3吸附作用;除A 外,B和C均可剂量依赖性抑制CVB3生物合成..结论大蒜多糖B和C在体外通过抑制CVB3生物合成而发挥抗CVB3的作用.
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阿昔洛韦抗柯萨奇病毒B3作用的初步观察
目的观察阿昔洛韦抗柯萨奇病毒B3(CVB3)的作用.方法通过活细胞计数评价阿昔洛韦对Hep-2细胞的细胞毒作用;通过观察病毒感染后的细胞病变效应计算病毒抑制率,评价阿昔洛韦在Hep-2细胞培养中的抗CVB3作用.结果阿昔洛韦对Hep-2细胞的半数细胞毒性浓度(TC50)在0.2mg/mL以上;CVB3的半数抑制浓度TC50为25μg/mL,治疗指数为8.4.结论阿昔洛韦安全性较高并能有效地抑制柯萨奇病毒B3在Hep-2细胞中的增殖.
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蟾毒内酯抗柯萨奇病毒、腺病毒和流感病毒作用的研究
蟾酥是我国传统的名贵药材,它的主要有效成分是蟾毒内酯,其药理作用很强[1],抗病毒作用至今未见报道.本文对蟾毒内酯抗呼吸道病毒的作用进行了试验研究,结果如下.
关键词： 蟾毒内酯 柯萨奇病毒B3 腺病毒7型(Ad7) 流感病毒(FM1) -
柯萨奇病毒B3的VP1DNA疫苗与蛋白或重组腺病毒疫苗不同组合免疫方式的免疫效果观察
目的 观察柯萨奇病毒B3 (Coxsackievirus B3,CVB3)衣壳蛋白VP1 DNA疫苗初免后VP1蛋白或重组腺病毒rAd/VP1加强的prime- boost策略的免疫效果.方法 用CVB3 VP1的真核表达质粒pcDNA3/VP1初次免疫小鼠后,分别用VP1蛋白或重组腺病毒rAd/VPI加强免疫2次.检测免疫小鼠血清特异性IgG抗体、中和抗体滴度以及脾脏细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocytes,CTLs)杀伤活性；致死量CVB3攻击后,检测小鼠血中病毒滴度并观察动物的存活情况.结果 pcDNA3/VP1 +VP1蛋白组小鼠血清IgG抗体、中和抗体滴度以及动物生存率明显高于pcDNA3/VP1+rAd/VP1组和pcDNA3/VP1质粒组(P＜0.05)；pcDNA3/VP1+rAd/VP1组和pcDNA3/VP1+VP1蛋白组小鼠脾脏CTLs杀伤活性明显高于pcDNA3/VP1质粒组(P＜0.05).结论 质粒pcDNA3/VP1初次免疫后,VP1蛋白或重组腺病毒rAd/VP1加强的prime- boost策略有较好的免疫效果,两者比较pcDNA3/VP1 +VP1蛋白prime-boost免疫策略的效果更为明显.
关键词： 柯萨奇病毒B3 prime-boost DNA 蛋白 重组腺病毒 -
芪芍五味子复方制剂抗CVB3病毒抑制心肌细胞凋亡机制的研究
目的 研究中药芪芍五味子复方制剂抗柯萨奇B3病毒(CVB3)效果及抑制病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡的机制.方法 采用细胞培养法观察细胞病变效应(CPE)与广谱抗病毒药物病毒唑对照,进行复方制剂体外抗病毒实验;BALB/c小鼠接种CVB3建立病毒性心肌炎动物模型,随机分为正常对照组、病毒对照组、复方制剂治疗组和维生素C与病毒唑联用组,观察各组心肌病理变化,Real-time定量PCR检测小鼠心肌CVB3RNA水平,流式细胞仪检测心肌细胞凋亡和坏死率.结果 复方制剂体外大无毒浓度为19.53g/L,预防给药、同时给药和治疗给药3种方式细胞培养所需有效药物浓度均低于病毒唑;与同期病毒对照组小鼠比较,复方制剂治疗组小鼠心肌炎症性病理变化明显减轻,CVB3RNA拷贝数降低(P<0.05),心肌细胞凋亡和坏死率显著降低(P<0.05).结论 芪芍五味子复方制剂可有效抗病毒,抑制病毒诱导心肌细胞凋亡,对CVB3感染小鼠心肌有良好的保护作用.
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柯萨奇病毒B3的TaqMan实时荧光定量RT - PCR检测方法的建立
目的:建立一种检测柯萨奇病毒B3( Coxsackievirus B3)的实时荧光定量RT - PCR方法,为临床CVB3的快速、准确检测提供一种新的方法.方法:针对CVB3基因的VP4区和管家基因β- actin的核苷酸序列分别设计了特异性的引物和TaqMan荧光探针,以重组质粒pMD18 -T - CVB3为标准品,进行实时荧光定量RT - PCR检测,并构建CVB3的荧光定量RT-PCR标准曲线.结果:建立的方法在1.0×101 ～ 1.0×108 copies/μl模板范围内具有良好的线性关系(r2＞0.999),扩增效率高于98.0％,至少可检测10 copies/μl的阳性标准品.用CVB3感染HeLa细胞来模拟实际样品,灵敏度可达到1.0×101 copies.结论:建立的荧光定量RT- PCR具有较高的敏感性、特异性和重复性,可作为CVB3的快速诊断方法,为CVB3感染的临床治疗提供快速可靠的诊断依据.
