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Hedgehog信号通路在肝癌中的研究进展
(Hedgehog)信号通路首先发现于果蝇遗传学研究,它控制着细胞生长、增殖和分化,在果蝇幼虫和哺乳动物胚胎的发育、成人机体内环境的维持中起重要作用,并与肿瘤等很多人类疾病的发生有关[1-2].在脊椎动物中,Hh信号通路主要由Hh配体、Patched (Ptc)受体、smoothened (Smo)跨膜蛋白、核转录因子Gli (gliomaassociated oncogene homoglog)构成[3].Hh配体有三种:SonicHedgehog (Shh)、Indian Hedgehog (Ihh)、DesertHedgehog (Dhh).Hh蛋白是Hh基因编码的一种高度保守的分泌型糖蛋白,其浓度大小与Smo及Cos2/Fu的磷酸化水平有关,控制Hh信号通路的活化程度[4,5].
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Hedgehog信号传导通路在乳腺癌中表达增强
目的 研究乳腺癌细胞中,Hedgehog信号传导通路是否表现为持续的激活状态.方法 用免疫组化方法 在64例乳癌标本中检测决定Hedgehog信号传导通路的组成部分,包括Shh,patched1和Gli1,SMO的表达.结果 在64例肿瘤样本中,强阳性表达Shh,Ptch1和Gli1,Smo的分别为64(100%),61(95.3%),62(96.9%)和61(95.3%),相反,各自对应相邻的正常乳腺上皮在可探测到的水平上不表达或低表达的这些蛋白,乳腺癌中的Hh通路的激活状态是普遍的,与病人的淋巴结转移无关,与癌肿的大小也无关.但与乳腺癌的特殊的病理类型可能有关.所有的64例肿瘤标本与周围正常组织相比都表现为Gli1强阳性染色,核染色Gli1阳性/所有的肿瘤细胞的百分比从2%～95%不等,中位数为40.87%.Gli1的核染色与雌激素受体阳性相关(P<0.05),与孕激素受体阳性无关.结论 Hedgehog(Hh)信号传导通路可以作为潜在的乳腺癌治疗的新靶点.
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食管鳞状细胞癌成纤维细胞 hedgehog 通路对 SHH 蛋白的应答
目的：探讨食管鳞状细胞癌成纤维细胞 hedgehog 通路是否应答 SHH 蛋白。方法分离、原代培养食管鳞状细胞癌成纤维细胞，用 Western blot 方法检测培养的细胞是否为成纤维细胞，SHH 蛋白与细胞孵育后提取细胞总RNA，荧光定量 PCR 方法检测细胞中 hedgehog 通路是否应答。结果 Western blot 结果显示培养细胞表达间质细胞标记 Vimentin 和 Fibronectin，不表达上皮细胞标记 E - cadherin。三株细胞中有两株应答 SHH 蛋白，一株不应答。结论食管鳞状细胞癌中，成纤维细胞对 SHH 配体是否应答存在着不同的情况，因此，检测间质中 Hh 通路的活性可为临床上选择对 Hh 抑制剂应答的肿瘤提供重要的生物标记。
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人胰腺癌 Hedgehog 信号通路中膜蛋白受体 PTCH 的纯化
目的 构建人胰腺癌PTCH基因表达载体并诱导融合蛋白表达.方法 从人胰腺癌细胞株SW1990抽提总RNA,经RT-PCR扩增出PTCH基因,经纯化、回收目的 基因PTCH,将其插入表达载体pET22b,转化E. Coli BL21-CodonPlus(TM)-RP,构建重组质粒pET22b/PTCH,IPTG诱导表达融合蛋白,免疫印迹进行鉴定,Ni-螯合亲和层析纯化融合蛋白.结果 从人胰腺癌细胞株SW1990克隆出长为789 bp PTCH目的 片段,成功构建重组质粒pET22b/PTCH,并诱导表达目的 蛋白;经Ni-螯合亲和层析得到纯化的融合蛋白.结论 成功构建了重组质粒pET22b/PTCH,并获得纯化的融合蛋白,为进一步研究Hedgehog信号通路在胰腺癌中的发病机制提供了有效工具.
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三羟异黄酮抑制胰腺癌细胞Notch-1和Hedgehog信号通路活性
目的 探讨三羟异黄酮对胰腺癌BxPC3细胞Notch-1和Hedgehog信号通路分子SHH和HHIP表达以及对细胞周期和增殖的影响.方法 体外培养胰腺癌BxPC3细胞,三羟异黄酮作用BxPC3细胞后,提取总RNA和蛋白质.RT-PCR方法检测Notch-1 mNRA、SHH mRNA和HHIP mRNA表达,Western blotting方法检测Notch-1和SHH蛋白的表达.MTT方法检测BxPC3细胞的增值,流式细胞术和PI单染法分析细胞的周期.结果 20μg/ml的三羟异黄酮处理BxPC3 48 h后,细胞增殖抑制率为(67.17±2.32)%.Notch-1 mRNA表达从2.454±0.068下调到1.304±0.169;SHH mRNA表达从0.959±0.023下调到0.472±0.077;而HHIP mRNA表达从0.625±0.158增加到1.761±0.121.Notch-1蛋白表达从1.361±0.109下调到0.760±0.114;SHH蛋白表达从0.265±0.018下调到0.129±O.013.(52.77±9.47)%的细胞被阻滞在G2/M期.结论 三羟异黄酮能同时抑制Notch-1的表达和阻断Hedgehog信号通路,并抑制胰腺癌细胞的增殖.
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Notch信号通路与胰腺癌相关性研究进展
胰腺癌(pancreatic cancer,PC)是一种恶性程度极高的消化道肿瘤.在美国,2010年新诊断胰腺癌患者43 140例,死亡36 800例[1].胰腺癌明确诊断时多属晚期,手术切除率低,并且对化疗药物不敏感,5年总生存率＜5％,40年来总生存率无明显变化[2].一项对24例胰腺导管腺癌(PDAC)组织的全基因组分析结果显示,12条细胞信号通路与胰腺癌的发生密切相关,包括Wnt/Notch、Hedgehog、TGF-β及K-ras等信号通路[3].本文就Notch信号通路与胰腺癌的相关性研究做一综述.
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中医不同治法对绝经后骨质疏松症大鼠骨组织Hedgehog信号通路mRNA和蛋白表达的影响
目的 观察去卵巢骨质疏松症大鼠模型骨组织Hedgehog信号通路中SHH、GLI1 mRNA和蛋白活性变化,探究中药防治骨质疏松症病机的分子生物学机制.方法 实验采用切除雌性SD大鼠双侧卵巢的方式建立骨质疏松症模型,运用补肾填精中药复方、活血化瘀中药复方、补肾活血中药复方对模型大鼠进行干预12周,用骨疏康作为阳性药物对照组,以及正常组和模型组.ELISA法检测各组骨组织SHH、GLI1蛋白含量;RT-PCR检测各组SHH、GLI1 mRNA相对表达量.结果 骨组织SHH、GLI1蛋白与正常组相比模型组含量明显减少(P＜0.01),与模型组相比较,各用药组均明显增加(P＜0.01).结论 骨质疏松症的发生机制与Hedgehog信号传导通路SHH、GLI1 mRNA和蛋白活性下降有关;补肾填精中药复方、活血化瘀中药复方、补肾活血中药复方通过激活Hedgehog信号传导通路中的SHH、GLI1,以促进骨形成,抑制骨吸收,起到防止骨质疏松症的作用.
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Sonic hedgehog和β-连环蛋白在胰腺癌组织中的表达及其相关性研究
目的 研究胚胎发育信号通路Sonic hedgehog(SHH)和WNT/β-catenin在胰腺癌组织中的表达及其临床意义.方法 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹法检测胰腺癌组织及癌旁组织中SHH和β-catenin的mRNA和蛋白表达情况.结果 SHH mRNA和蛋白在胰腺癌组织中的阳性率分别为81.6%和79.6%,与癌旁组织相比,差异有统计学意义(P＜0.05).β-catenin蛋白在胰腺癌组织中的阳性率为71.4%,与癌旁组织相比,差异有统计学意义(P＜0.05).而β-catenin mRNA在胰腺癌组织和癌旁组织中的表达水平均较低,差异无统计学意义(P＞0.05).SHH和β-catenin蛋白表达与年龄、肿瘤大小、组织学类型和肿瘤部位等病理因素均无关(P＞0.05),而在不同淋巴结转移状况和TNM分期的病例组中,二者表达差异有统计学意义(P＜0.05).配对资料的Spearman相关分析显示,SHH表达与β-catenin表达呈正相关关系(r=0.352,P＜0.05).结论 SHH和WNT/β-catenin信号通路在胰腺癌组织中呈活化状态,二者之间的交叉对话对胰腺癌的发生发展可能起重要作用.
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Hedgehog信号蛋白在胰腺癌中的表达及临床意义
目的 研究Hedgehog相关信号蛋白Ihh、Ptc和Smo在胰腺癌中的表达情况及其临床意义.方法 采用免疫组织化学方法 检测54例原发性胰腺癌及5例正常胰腺石蜡标本中Hedgehog信号蛋白(Ihh、Ptc、Smo)的表达情况,并统计分析其阳性率与临床病理特征的相关性;采用Westernblot比较21例新鲜胰腺癌及癌旁胰腺组织标本Hedgehog信号蛋白表达量的差异.结果 54例胰腺癌标本中,Ihh、Ptc及Smo阳性率分别为70.4%、64.8%和88.9%,5例正常胰腺组织中均无阳性表达;Ptc阳性率与肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移情况及肿瘤TNM分期显著相关,Smo表达率则与肿瘤分化程度显著相关(P<0.05);21例新鲜胰腺癌标本中Ihh、Ptc、Smo平均表达量均显著高于癌旁胰腺组织(P<0.05).结论 胰腺癌组织中Hedgehog信号蛋白表达量显著增加;Hedgehog信号蛋白与胰腺癌临床病理特征相关.
关键词： 胰腺肿瘤 Hedgehog 免疫组化 Western blot -
柠檬酸镧对肝癌SMCC-7721细胞增殖凋亡的影响及其机制
目的 探讨柠檬酸镧对肝癌细胞增殖、凋亡的影响及其可能的机制.方法 分别使用不同浓度的环巴胺-KAAD以及柠檬酸镧处理人肝癌细胞株SMMC-7721.采用MTT法检测细胞增殖,采用Annexin V/PI流式细胞术检测细胞凋亡率.采用蛋白印迹(Western blot)检测CyclinD1、p21、Caspase-3、bcl-2、Gli1、Shh表达.采用实时定量(q-PCR)检测Gli1、Shh的表达.结果 对照组、0.1 mmol/L柠檬酸镧组、15 μmol/L环巴胺-KAAD组处理SMMC-7721细胞48 h,Caspase-3蛋白相对表达量分别为(0.36±0.05)、(0.67 ±0.10)、(0.89±0.11);bcl-2蛋白相对表达量分别为(0.61±0.10)、(0.48±0.05)、(0.24±0.08);CyclinD1蛋白分别为(1.41±0.21)、(0.71±0.08)、(0.53±0.11);p21蛋白分别为(0.49±0.08)、(0.97±0.09)、(1.55±0.13);Gli1、Shh的mRNA和蛋白表达均有不同程度的下降.Annexin V-FITC双染流式细胞术显示柠檬酸镧组和环巴胺-KAAD组增加SMMC-7721细胞凋亡率.结论 柠檬酸镧能抑制SMMC-7721细胞增殖、促进其凋亡.其机制可能和柠檬酸镧抑制Hh信号通路相关.
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Hedgehog信号通路对胰腺癌细胞增殖的影响
目的 研究特异性阻断hedgehog信号通路对人胰腺癌Mia PaCa-2细胞增殖的影响.方法 用Western blot方法检测7种胰腺癌细胞系中hedgehog信号蛋白表达情况,筛选出hedgehog通路活化明显的Mia PaCa-2细胞系进行研究;应用特异性hedgehog通路阻断剂KAAD-cyclopamine阻断Mia PaCa-2细胞的hedgehog信号通路,Western blot方法检测Gli1蛋白表达变化;MTT法检测阻断hedgehog信号通路对胰腺癌细胞增殖的影响;RT-PCR方法检测胰岛素样生长因子2(IGF2)mRNA表达的变化.结果 KAAD-cyclopamine处理后hedgehog信号通路中关键效应蛋白Gli1表达水平明显下调(P=0.032);KAAD-cyclopamine明显抑制胰腺癌Mia PaCa-2细胞增殖,其作用呈剂量及时间依赖性;阻断hedgehog信号通路后,胰腺癌细胞中胰岛素样生长因子2(IGF2)mRNA表达水平下调(P=0.037).结论 Hedghog信号通路异常活化参与促进胰腺癌细胞增殖;特异性阻断hedgehog信号通路后胰腺癌细胞增殖明显受抑制,其部分机制可能通过下调IGF2表达水平实现.
关键词： 胰腺肿瘤 信号传导 Hedgehog 胰岛素样生长因子2型 -
Hedgehog信号传导通路相关基因在肝癌组织中的表达研究
目的 研究Hedgehog信号传导通路相关基因在肝癌组织中的表达,及其抑制剂对肿瘤细胞生长的影响.方法 免疫组化法检测14例肝癌组织切片、4个肝癌细胞系和正常肝细胞中Hedgehog信号传导通路成员Ihh、Ptch、Smo、Gli的蛋白表达;Western blot检测9例新鲜肝癌组织标本、6例正常肝组织标本和肝癌细胞系中Ihh、Ptch、Smo、Gh的蛋白表达;RT-PCR检测3肝癌组织标本和肝癌细胞系中Ihh、Ptch、Smo、Gli、Hip mRNA表达.结果 14例肝癌组织中免疫组化染色阳性的Gli 6例(42.9%),Ptch 10例(71.4%),Ihh 10例(71.4%),Smo 12例(85.7%).Western blot和RT-PCR检测显示,肿瘤组织中Gli基因的mRNA和蛋白表达均高于正常肝脏细胞,Hip基因的mRNA表达低于正常肝细胞.肝癌细胞系HepG2,Bel-7402和QGY-7701免疫细胞化学染色Pteh和Gli同时为阳性,证明为Hedgehog通路活化的细胞系.在环耙明(KAAD-cyclopamine)作用后,3个细胞系Ptch及Gli基因的mRNA表达下调(Ptch基因tHepG2=3.78,tBel-7402=9.03,tQGY-7701=5.63,Gli基因tHepG2=9.61,tBel-7402=4.15,tQGY-7701=20.30,均P＜0.05);QGY-7701组Hip基因RNA表达上调(t=4.70,P＜0.05).环耙明抑制肝癌细胞系QGY-7701的作用明显.结论 原发性肝癌组织中Hedgehog信号传导通路有多种基因表达,环耙明有抑制肝癌细胞生长的作用.
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Hedgehog 信号通路转录因子Gli2在肝癌组织中的表达及意义
目的 探讨Hedgehog(Hh)信号通路下游转录因子胶质瘤相关癌基因同源蛋白2(Gli2)在肝细胞癌组织中的表达及临床意义.方法 采用Real time RT-PCR 法及Western blot 检测20 对肝癌及癌旁组织Gli2 基因mRNA 及蛋白的表达;采用免疫组织化学法检测52 对肝癌及癌旁组织Gli2 蛋白的表达情况.结果 Gli2 mRNA 及蛋白在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织.52 例肝癌组织中Gli2 阳性表达38 例(73.1%),相应的癌旁组织Gli2 阳性表达8 例(15.4%),差异有显著性(P ＜ 0.01);且Gli2 蛋白表达与肝癌分化程度、有无血管侵犯及淋巴结转移有相关性(P ＜ 0.05).结论 Gli2 的异常表达与肝癌的发生发展及浸润转移密切相关,Gli2 可能成为肝癌的重要生物学标志和生物治疗靶点.
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靶向Hedgehog信号通路的抗肿瘤新药研究进展
Hedgehog信号通路在哺乳动物的胚胎发育过程中发挥关键作用,但在成年组织中处于抑制状态.异常激活的Hedgehog信号通路与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关,近年来Hedgehog信号通路成为治疗肿瘤的热门靶标.目前已有两种Hedgehog抑制剂(维莫德吉和索尼吉步)上市用于治疗肿瘤,但上市的药物很快出现严重的毒副作用和耐药问题.研究者研发出taladegib、NVP-LEQ506和MRT-92等新型Smo抑制剂以克服维莫德吉的耐药问题,并针对Smo上游Shh配体和下游蛋白Gli蛋白设计相应抑制剂以解决毒副作用问题.同时,目前上市的Hedgehog抑制剂仅用于治疗基底细胞癌,而对其他肿瘤的治疗也在进一步的研究中.现就靶向Hedgehog信号通路的抗肿瘤新药的研发及其治疗不同肿瘤的研究进展进行综述.
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曲古霉素A联合环巴胺对胰腺癌PANC-1细胞凋亡的影响
目的 本实验旨在研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A (TSA)联合Hedgehog(Hh)信号通路阻断剂环巴胺(CYA)干预对胰腺癌PANC-1细胞凋亡的影响并初步探讨其可能机制.方法 采用CCK8方法检测曲古霉素A、环巴胺作用24 h对PANC-1细胞50％抑制浓度(IC50).用Hochest 33258荧光染色观察曲古霉素A、环巴胺单独及联合处理PANC-1细胞24 h后凋亡;荧光定量聚合酶链式反应(Q-PCR)检测Hedgehog信号通路关键分子及凋亡相关基因mRNA表达的变化;蛋白免疫印迹法检测凋亡相关蛋白(Bcl-2、活化胱天蛋白酶-3,活化胱天蛋白酶-8,活化胱天蛋白酶-9)及Hedgehog通路关键分子蛋白(Gli1、Smo、Ptc-1)表达的改变;细胞免疫荧光标记法检测Gli1蛋白表达的变化.结果 Hochest 33258染色显示,曲古霉素A及环巴胺均可诱导胰腺癌PANC-1细胞凋亡,24 h IC50分别为(0.51 ±0.07) μmol·L-1和(33.6±2.3)μmol·L-1,两者联合指数为0.835,具有低度协同作用.曲古霉素A及环巴胺干预后Bcl-2 mRNA表达下降,Bax mRNA表达上调,尤以联合组明显.曲古霉素A0.5μmol · L-干预可抑制Gli1 mRNA的表达,联合环巴胺20 μmol·L-后对Hedgehog通路的抑制效应进一步增强,降低Gli1、Smo mRNA表达量,上调Gli3 mRNA的表达.Western印迹结果显示,曲古霉素A0.5μmol· L-1、环巴胺20μmol·L-单独及联合处理PANC-1后,凋亡相关蛋白胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9活化程度进一步上升,凋亡抑制因子Bcl-2的表达明显下降,Hedgehog信号关键分子蛋白Gli1、Smo、Ptc-1表达均明显下降,以联合组为明显.细胞免疫荧光结果也显示Gli1表达明显下降.结论 曲古霉素A、环巴胺可协同抑制Hh通路,诱导胰腺癌PANC-1细胞的凋亡.
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Hedgehog通路与乳腺癌
在哺乳动物中，Hedgehog( Hh)信号通路在器官发育、维持成熟组织的内环境稳定、慢性炎症中的组织修复和癌症发生等多种进程中发挥着重要作用。近年来，发现胰腺癌、胃癌、前列腺癌、小细胞肺癌、髓母细胞瘤、皮肤基底细胞癌、乳腺癌等肿瘤的发生与Hh信号通路的激活关系密切。在此就Hh信号通路的构成、作用特点以及与乳腺癌发生、发展的关系进行综述。
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靶向抑制EGFR联合阻断Hedgehog信号通路对胰腺癌细胞增殖的影响及机制
目的 观察靶向抑制表皮生长因子受体(EGFR)联合阻断Hedgehog信号通路对胰腺癌细胞增殖及凋亡的协同作用,探讨二者间的协同作用机制.方法 设计并合成针对人EGFR基因特异性siRNA,构建慢病毒pFU-GW-RNAi载体,感染人胰腺癌Panc-1细胞,获得稳定转染细胞株.Real time PCR检测Shh和Gli1的表达情况；克隆形成实验和MTT法检测细胞增殖情况；流式细胞技术检测细胞凋亡情况；Western印迹方法检测ERK和AKT磷酸化水平变化；裸鼠移植瘤模型检测移植瘤生长抑制情况.结果 慢病毒介导的RNAi显著抑制Panc-1细胞EGFR的表达；靶向抑制EGFR后Panc-1细胞对环巴明的敏感性显著增加,细胞增殖能力下降,其半数抑制剂量(IC50)从(2.978±0.336) μmol/L下降到(1.698士0.057)μmol/L,P＜0.05;联合处理组细胞早期凋亡比率高达38.75％,显著高于单独抑制EGFR组(17.65％)及对照组(3.02％),P＜0.05；裸鼠移植瘤实验结果显示联合处理组移植瘤体积(394.8±87.5)mm3显著低于抑制EGFR组(594.7士86.1)mm3和单独应用环巴明处理组(771.3±82.9) mm3；克隆形成实验结果显示联合处理可以进一步抑制细胞增殖；抑制EGFR后胰腺癌细胞ERK和AKT磷酸化水平较对照组显著降低,联合应用环巴明处理后二者磷酸化水平均进一步下降.结论 靶向抑制EGFR联合环巴明处理后胰腺癌细胞体内外增殖能力均进一步被抑制,细胞凋亡率进一步增加；其协同机制可能部分与调控ERK和AKT磷酸化水平相关.
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抑制胃癌Hedgehog通路对转化生长因子β诱导的上皮间质化的影响
目的 探讨Hedgehog通路对胃癌转移方面的作用,特别是探讨其在胃癌上皮间质化(EMT)中起的作用.方法 利用药物处理(环靶明)或小干扰RNA敲除基因的手段,抑制胃癌的Hedgehog通路,并通过显微镜下观察、Western印迹、Transwell侵袭及迁移实验,分别探讨与EMT相关的细胞形态、蛋白质水平及侵袭迁移等功能性改变.结果 抑制Hedgehog通路后胃癌细胞的侵袭及迁移能力明显下降.胃癌细胞在转化生长因子(TGF)-β诱导下,细胞呈现梭形的外观、上皮化蛋白(E-钙黏蛋白)水平下调,间质化波形蛋白(Vimentim)水平上调,侵袭及转移能力分别提高3倍及4倍.TGF-β诱导后可上调Hedgehog通路的Sonic Hedgehog(SHH)及锌指转录因子(Gli)l蛋白的表达水平,提示可激活Hedgehog通路.在TGF-β的持续刺激下,抑制Hedgehog通路可逆转EMT,细胞恢复上皮化外观,E-钙黏蛋白表达上调,Vimentim表达下调,侵袭及迁移能力下调3倍及2倍.结论 胃癌Hedgehog通路被抑制后,可逆转TGF-β引起的胃癌EMT化,提示Hedgehog通路在胃癌的转移方面发挥重要的作用.
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Hedgehog信号通路调控胰腺癌细胞上皮间质转化的作用机制
目的 观察特异性阻断hedgehog(Hh)信号通路对胰腺癌Panc-1细胞上皮间质转化(EMT)过程的影响,探讨其分子机制.方法 设计并合成针对Smoothened (SMO)基因特异性的RNA干扰靶点,运用慢病毒介导的RNA干扰技术沉默SMO基因表达以阻断人胰腺癌Panc-1细胞Hh信号通路.应用Matrigel/Transwell法检测阻断Hh信号通路后胰腺癌细胞侵袭能力的变化,应用实时PCR及Western印迹方法检测阻断Hh通路后Panc-1细胞EMT标志物E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、Vimentin、Fibronectin等的表达变化；并检测EMT调控因子Snail、Slug等的表达变化.结果 稳定干扰SMO基因表达阻断Hh信号通路后,人胰腺癌Panc-1细胞侵袭能力明显降低,p=0.020;上皮表型标志物E-cadherin表达明显上调,而间质表型Vimentin、Fibronectin、N-cadherin等的表达水平显著下调,P值分别为0.020、0.001、0.031和0.022;与对照组相比,SMO干扰组细胞中转录因子Snail、Slug的表达水平均显著下调,P值分别为0.018和0.016.结论 应用慢病毒介导的RNA干扰技术特异性沉默SMO基因阻断人胰腺癌细胞中Hh通路活性,可显著抑制Panc-1细胞EMT过程,其机制与下调转录因子Snail及Slug表达有关.
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Runx2介导Hedgehog促进成骨细胞晚期分化的实验研究
目的 探讨Runt-related transcription factor2 (Runx2)在Hedgehog促进成骨细胞晚期分化过程中的重要介导作用.方法 培养MC3T3-E1细胞,以Sonic Hedgehog(Shh)处理细胞.将细胞分为4组:对照组；Shh组；Runx2 siRNA组；Runx2siRNA+ Shh组.应用siRNA技术沉默细胞内Runx2基因,real-time PCR法和Western blot方法检测细胞内Runx2和碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC)、骨涎蛋白(Bsp)、Col 1a1、Osx成骨因子mRNA和其蛋白的表达水平,ALP染色方法检测细胞内ALP的蛋白表达强度.结果 Real-time PCR法和Western blot方法检测结果表明,Shh明显提高MC3T3-E1细胞ALP、OC、Bsp、Col 1a1、Osx成骨因子mRNA、蛋白的表达.ALP染色表明,Shh组ALP的染色强度高于对照组.沉默Runx2基因后,real-time PCR法和Western blot方法检测结果,与对照组比,Runx2 siRNA组、Runx2 siRNA+ Shh组MC3T3-E1细胞内ALP、OC、Bsp、Col 1a1、Osx成骨因子mRNA、蛋白的表达明显降低；ALP染色表明,ALP染色强度明显下降;表明Shh失去其促进成骨细胞分化的作用.结论 Runx2介导Hedgehog促进成骨细胞的晚期分化,Hedgehog可通过上调Runx2的表达,提高其功能,促进成骨细胞的晚期成熟分化.
