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宣肺通腑方对脂多糖致急性肺损伤大鼠肺组织髓样分化蛋白-2、核因子-κB表达的影响
目的：观察宣肺通腑方对脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤(ALI)大鼠肺组织髓样分化蛋白-2(MD-2)、核因子-κB(NF-κB)蛋白及其基因表达的影响,并探讨其作用机制。方法 Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、地塞米松组和宣肺通腑方大、中、小剂量组,每组8只。尾静脉注射LPS 6 mg/kg制备大鼠ALI模型。宣肺通腑方各组于造模前以15.12、7.56、3.78 g原药材/kg宣肺通腑方水煎液灌胃,1次/d,连续3 d；地塞米松组在造模前1 h按5 mg/kg腹腔注射地塞米松。造模后9 h麻醉取材,采用免疫组化ABC法和实时荧光定量聚合酶链反应检测MD-2、NF-κB蛋白及其基因表达,光镜下观察大鼠肺组织病理变化。结果与正常组比较,模型组MD-2、NF-κB蛋白及其基因表达均明显上调(P＜0.05,P＜0.01)；与模型组比较,地塞米松组和宣肺通腑方各组MD-2、NF-κB蛋白及其基因表达明显降低(P＜0.05,P＜0.01)；地塞米松组和宣肺通腑方各剂量组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。病理观察结果显示,与正常组比较,模型组大鼠肺组织出现大片出血及坏死,炎症细胞大量浸润；宣肺通腑方各剂量组和地塞米松组大鼠肺组织病理改变明显轻于模型组,肺细支气管偶见炎症改变,水肿较轻,炎性细胞渗出较少。结论宣肺通腑方能减轻ALI大鼠肺组织损伤,对肺损伤有保护作用,其机制可能与其降低ALI大鼠MD-2、NF-κB蛋白及其基因表达有关。
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髓样分化蛋白-2在天然免疫中的作用
Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)家族作为模式识别受体,在天然免疫中具有重要作用.髓样分化蛋白-2(myeloid differential protein-2,MD-2)可能含有两个相对独立的功能结构域,既能与Toll样受体家族中的TLR4、TLR2结合,也能与多种配体结合(包括lipopolysaccharide,LPS).这种特殊的结构可能与其三方面的主要功能有关:(1)MD-2与TLR4结合,赋予TLR4对各种配体(包括LPS)的反应性;(2)MD-2与TLR2结合,赋予TLR2对LPS的反应性,并增强TLR2对细菌及其胞壁成分的反应性;(3)MD-2能促进TLR4和TLR2的表达,并且与TLR4在细胞内的分布密切相关.这表明MD-2可以通过两种方式直接或间接调控TLRs的功能:与TLR2/TLR4结合,或调控TLR2/TLR4的表达与分布.因而MD-2不仅仅是TLR4的辅助分子,而且还是天然免疫中的调控分子,可能在感染、炎症、免疫等病理生理过程中具有更广泛的生物学功能.
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脂多糖对大鼠肺泡巨噬细胞Toll样受体4和髓样分化蛋白-2基因表达及炎性因子分泌的影响
目的 探讨脂多糖刺激大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383细胞Toll样受体4(TLR4)、髓样分化蛋白-2(MD-2)mRNA表达和炎性因子分泌的影响,以及MD-2小干扰RNA(MD-2 siRNA)对脂多糖刺激下NR8383细胞炎性因子分泌的作用.方法 体外培养NR8383细胞,以不同浓度脂多糖(0.01～10 mg/L)刺激2 h,以1 mg/L脂多糖刺激2～24 h.运用脂质体Lipofectamine 2000将MD-2siRNA转染至细胞.半定量RT-PCR方法检测细胞TLR4和MD-2 mRNA的表达,酶联免疫吸附法检测细胞培养上清中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6和IL-1β的含量.统计学处理采用单因素方差分析、独立样本t检验和Pearson相关分析.结果 对照组NR8383细胞TLR4和MD-2mRNA的相对表达量分别为0.52±0.05和0.44±0.09,0.01 mg/L浓度脂多糖刺激前后表达量无明显改变,0.1 mg/L浓度时表达增加,随脂多糖浓度的升高表达量进一步增加,10 mg/L刺激后相对表达量分别为0.72±0.06和0.65±0.10(F=17.26、6.04,P<0.01);TNF-αIL-6和IL-1β含量具有类似改变趋势,对照组分别为(25.8±3.4)ng/L、(62.4±4.7)ng/L和(31.6±1.7)ng/L;在10 mg/L脂多糖刺激下分别增加至(58.9±5.3)ng/L、(96.5±3.9)ng/L和(55.4±5.4)ng/L(F=29.55、54.47、31.45,P<0.01).在1 mr/L脂多糖刺激下,TLR4和MD-2 mRNA的表达量在2 h后明显增加,6 h达高峰,8 h开始回落,至24 h时仍高于基础值(F=5.28、4.11,P<0.01);TNF-α、IL-6和IL-1β含量具有类似变化(F=10.64、11.23、17.58,P<0.01),其中TNF-α和IL-1β含量在6 h达高峰,持续至8 h,IL-6含量在8 h达高峰,持续至12 h.TLR4和MD-2 mRNA表达呈正相关(r=0.513,P<0.01).MD-2 siRNA对NR8383细胞MD-2基因的干扰效率为67%,在脂多糖刺激下干扰组细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平未见明显升高.结论 高浓度脂多糖可较长时间上调大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383细胞TLR4和MD-2基因的表达,并促进TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌.MD-2 siRNA可抑制脂多糖刺激下NR8383细胞分泌TNF-α、IL-1 β和IL-6.
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大鼠自体原位肝移植后肺组织MD-2的表达及意义
目的 观察自体肝移植后肺组织病理变化及MD-2、TLR2/4基因和蛋白表达变化.方法 选取健康SPF级SD大鼠30只,随机分为假手术对照组(S组,n=6)和移植肝脏再灌注后4、8、16、24小时组(M4、M8、M16和M24组,每组n=6).观察肺组织病理损伤,Q-PCR法检测MD-2、TLR2/4基因表达,Western Blot法分析MD-2、TLR2/4蛋白表达,ELISA法检测肺组织TNF-α和IL-6浓度.结果 假手术组肺组织结构基本正常,移植组表现为肺间质明显出血、充血,中性粒细胞浸润显著增多,以肝脏再灌注后8小时为明显.与S组相比,M4、M8、M16组肺组织MD-2、TLR2和TLR4基因与蛋白表达显著上调(P＜0.05),在肝脏再灌注8小时时达到高峰.与S组比较,M8、M16和M24组肺组织匀浆的TNF-α和IL-6浓度显著升高,在肝脏再灌注8小时时达到高峰.结论 大鼠自体原位肝移植术后肺组织MD-2、TLR2和TLR4基因与蛋白表达显著上调,TNF-α和IL-6浓度升高,可能对肝移植急性肺损伤起重要作用.
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脓毒症大鼠肝脏组织Toll样受体4和髓样分化蛋白-2基因表达的变化规律
目的探讨脓毒症大鼠肝脏组织内毒素复合受体--Toll样受体4 (TLR4)/髓样分化蛋白-2(MD-2)mRNA的表达变化,研究其与肝脏组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA表达的关系.方法腹腔注射内毒素(LPS)5mg/kg制作大鼠脓毒症模型.动物分为正常对照组(20只)及内毒素注射后1h、2h、6h组(各20只),检测肝脏组织TLR4/MD-2以及TNF-α mRNA的表达.结果 LPS注射后1h,TLR4/MD-2及TNF-α mRNA表达开始升高并达高峰,伤后2～6h逐渐下降,各时间点的表达量均显著高于对照组(P<0.01),TLR4与MD-2 mRNA的表达呈明显正相关(P<0.05),且分别与TNF-α mRNA的表达呈显著正相关(P<0.05).结论 LPS可迅速上调肝脏组织TLR4/MD-2的基因表达并诱导早期炎症细胞因子TNF-α的基因表达.脓毒症时TLR4识别LPS是可能以TLR4/MD-2复合体的形式完成的,且在识别过程中MD-2是TLR4必需的作用分子.
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性别差异对脓毒症大鼠心肌Toll样受体4和髓样分化蛋白-2 基因表达的影响
目的:探讨性别差异对脓毒症大鼠心肌Toll样受体4(TLR4)和髓样分化蛋白-2(MD-2)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因表达的影响.方法:取40只清洁级Wistar大鼠,雌雄各半,分为正常雌雄性对照组(各10只),雌雄性脓毒症组(各10只).采用腹腔注射5mg/kg内毒素(LPS)制作脓毒症大鼠模型,无菌留取大鼠心肌组织标本,利用RT-PCR法检测心肌组织TLR4、MD-2以及TNF-α基因表达,利用放免法检测大鼠血浆雌二醇含量.结果:正常雌雄性大鼠心肌组织均可表达少量TLR4、MD-2及TNF-α基因,两组差异无统计学意义(P＞0.05),但是注射LPS后雌性大鼠心肌组织各项指标明显低于雄性大鼠(P＜0.01).相关分析表明,雌性及雄性脓毒症大鼠心肌组织TLR4及TNF-α基因表达与相应性别大鼠血浆中雌二醇含量呈显著负相关(P＜0.05).结论:LPS注射后大鼠心肌组织TLR4、MD-2及TNF-α基因表达存在性别差异,内源性雌激素的作用可能导致雌性脓毒症大鼠心肌组织对LPS的反应性弱于雄性.
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抗菌药物对酒精性肝病创伤弧菌脓毒症大鼠肝组织Toll样受体及髓样分化蛋白2表达的影响
目的 探讨酒精性肝病大鼠创伤弧菌(VV)脓毒症肝组织Toll样受体及髓样分化蛋白2的表达及其动态变化.方法 制作酒精性肝病大鼠VV脓毒症模型和酒精性肝病VV脓毒症抗菌药物治疗模型.大鼠随机分为正常对照组(N组)、酒精性肝病对照组(A组)、酒精性肝病抗菌药物对照组(AA组)、酒精性肝病VV脓毒症组(AV组)和酒精性肝病VV脓毒症抗菌药物治疗组(AVA组).采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测各组大鼠不同时间点肝组织TLR2、TLR4、MD-2mRNA表达及其动态变化.结果 AV组大鼠在染菌后2 h,TLR2、TLR4、MD-2 mRNA表达开始升高(0.56±0.08、0.70±0.08±0.59±0.05),12 h达峰(0.85±0.18、0.92±0.13、0.83 ±0.11),染菌后24 h下降.染菌后各时间点TIJR2、TLR4、MD-2 mRNA表达较N组及A组显著升高(P<0.05或P<0.01),AVA组TLR2、TLR4、MD-2 mRNA与各相同时间点AV组相比,表达量明显降低(6 h:0.48 ±0.10、0.60±0.06、0.56±0.07;12 h:0.45 ±0.13、0.59±0.11、0.57±0.12;24 h:0.45 ±0.13、0.51±0.12、0.45±0.14)(P<0.05或P<0.01).结论 酒精性肝病大鼠VV脓毒症肝组织TLR2、TLR4、MD-2 mRNA表达水平随脓毒症病情的进展而升高,其与脓毒症的发生、发展密切相关.应用足量头孢哌酮钠和乳酸左氧氟沙星能显著降低肝组织TLR2、TLR4、MD-2mRNA的表达,对酒精性肝病VV脓毒症大鼠有明显的治疗作用.动态监测TLR2、TLR4、MD-2mRNA改变对VV脓毒症发病及治疗过程具有一定的意义.
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性别差异对脓毒症大鼠肺组织Toll样受体4及髓样分化蛋白-2基因表达的影响
目的探讨性别差异对脓毒症大鼠肺组织Toll样受体4(TLR4)、髓样分化蛋白-2(MD-2)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因表达的影响.方法脂多糖(LPS)刺激前后留取雌性和雄性大鼠肺组织标本,提取总RNA,采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定TLR4、MD2和TNF-α的基因表达情况,采用放射免疫测定法检测大鼠血浆雌二醇(E2)含量.结果正常雌性和雄性大鼠肺组织均可表达少量TLR4、MD-2和TNF-α基因,性别间差异均无显著性(P均>0.05),但脓毒症雌性大鼠各项指标表达均明显弱于雄性(P均<0.01).相关分析表明,雌性和雄性脓毒症大鼠肺组织TLR4、TNF-α的mRNA表达与血浆E2含量均呈显著负相关(P均<0.05).结论 LPS诱导的肺组织TLR4信号转导通路活化存在性别差异,内源性雌激素作用可能导致雌性脓毒症大鼠对LPS的反应性弱于雄性.
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泄浊解毒方对溃疡性结肠炎大鼠血清TLR4、MD2、IL-13及NF-κB的影响
目的 观察泄浊解毒方对溃疡性结肠炎(UC)大鼠血清Toll样受体4(TLR4)、髓样分化蛋白-2(MD2)、白介素-13(IL-13)及结肠组织核因子kB(NF-κB)的影响.方法 采用三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇联合造模法诱导大鼠溃疡性结肠炎动物模型.雄性Wistar大鼠45只随机抽取8只为空白对照组,将造模成功的大鼠分为模型组、柳氮磺吡啶组、泄浊解毒方高剂量组、泄浊解毒方低剂量组,每组8只.空白对照组正常喂养,模型组予生理盐水灌胃,柳氮磺吡啶组予SASP按0槝.3 g/kg体质量灌胃,泄浊解毒方高剂量组、泄浊解毒方低剂量组分别予泄浊解毒方颗粒10.0 g/kg、5.0 g/kg灌胃.各灌胃组大鼠每日给药1次,连续14天.检测各组大鼠血清TLR4、MD2、IL-13及NF-κB含量.结果 泄浊解毒方高剂量组能明显降低TLR4、MD2、NF-κB含量,升高IL-13含量,组间比较差异有统计学意义(F=110.490、271.137、10.723、92.297,P<0.05).结论 泄浊解毒方对UC大鼠治疗效果显著,其作用机制可能与降低TLR4、MD2、NF-κB含量,升高IL-13含量有关.
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宣白承气汤对内毒素致急性肺损伤大鼠肺组织MD-2mRNA、MyD88蛋白及其mRNA表达的影响
目的:探讨宣白承气汤对脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤(ALI)大鼠肺组织髓样分化蛋白-2(myeloid differentiation protein-2,MD-2)mRNA、髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)蛋白及其mRNA表达的影响.方法:将32只雄性Wistar大鼠随机分为:正常对照组、模型对照组、地塞米松组、宣白承气汤组,每组8只.尾静脉注射LPS 6 mg/kg制备大鼠ALI模型.宣白承气汤组在造模前灌胃3d,按7.56g生药/kg宣白承气汤水煎液灌胃,1次/d;地塞米松组在造模前1h按5 mg/kg腹腔注射地塞米松,造模6h后麻醉取材.采用免疫组化ABC法和实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测MD-2mRNA、MyD88蛋白及其mRNA的表达,并于光镜下观察大鼠肺组织病理变化.结果:与正常对照组相比,模型组MD-2mRNA、MyD88蛋白及其mRNA的表达均明显上调(P＜0.01);与模型组相比,地塞米松组和宣白承气汤组MD-2mRNA、MyD88蛋白及其mRNA表达明显降低(P＜0.01);地塞米松组和宣白承气汤组相比无显著差异(P＞0.05).病理学观察,与正常组相比,模型对照组大鼠肺组织出现大片出血及坏死,宣白承气汤组和地塞米松组大鼠肺组织病理改变明显轻于模型对照组,肺细支气管偶见炎症改变,水肿较轻,炎性细胞渗出较少.结论:宣白承气汤能减轻内毒素致ALI大鼠肺组织损伤,对肺损伤有保护作用,其机制可能与其能降低内毒素致ALI大鼠MD-2mRNA、MyD88蛋白及其mRNA的表达有关.
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TLR4在anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导THP-1细胞表达TF中的作用探讨
目的:探讨TLR4及相关信号分子在anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导单核细胞株THP-1表达组织因子(TF)中的作用.方法:利用荧光定量PCR(Real-time PCR)检测anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ诱导THP-1细胞TF mRNA表达,采用试剂盒检测细胞TF活性;利用自制的β2GPⅠ胶联亲和层析柱(β2GPⅠ-Affi-Gel)分析β2GPⅠ与THP-1细胞表面相应受体结合情况;Real-time PCR及Western蛋白印迹检测anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导细胞表达TLR4、MyD88、MD-2情况;观察TLR4途径抑制物--紫杉醇是否干预anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物对细胞的作用.结果:Anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100 μg/ml)诱导THP-1细胞TF表达显著增加(P＜0.05);THP-1细胞表面的TLR4能够结合于β2GPⅠ-Affi-Gel柱;Anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100 μg/ml)刺激THP-1细胞表达TLR4、MyD88、MD-2显著升高(P＜0.05);紫杉醇(1 μmol/L)能够抑制anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物对细胞的刺激效应.结论:TLR4及相关信号分子在anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导THP-1细胞表达TF中具有重要作用.
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抗菌药物对酒精性肝病大鼠创伤弧菌脓毒症肝组织Toll样受体及促炎性细胞因子的影响
目的 探讨抗菌药物对酒精性肝病大鼠创伤弧菌(VV)所致脓毒症肝组织Toll样受体(TLR)和促炎性细胞因子的影响.方法 将制威酒精性肝病模型的66只SD大鼠随机分为酒精性肝病对照组(A组)、酒精性肝病抗菌药物对照组(AA组)、酒精性肝病VV脓毒症模型组(AV组,共4组)和酒精性肝病VV脓毒症抗菌药物治疗模型组(AVA组,共5组),并设正常对照组(N组),同时采用RT-PCR技术检测各组大鼠不同时点肝组织内TLR4、髓样分化蛋白-2(MD-2)、IL-1β和IL-6 mRNA表达及其动态变化.结果 AV组大鼠在染菌后各时点肝组织TLR4、MD-2、IL-1β和IL-6mRNA表达水平均较N组和A组升高(均P＜0.05或0.01),AVA组肝组织TLR4、MD-2、IL-1β和IL-6 mRNA表达水平均较同时点AV组降低(均P＜0.05或0.01).结论 酒精性肝病大鼠VV脓毒症肝组织TLR4、MD-2、IL-1β和IL-6 mRNA表达水平均随脓毒症病情进展而增高,而应用足量抗菌药物则可通过显著降低肝组织TLR4、MD-2、IL-1β和IL-6mRNA的表达水平,从而对酒精性肝病W脓毒症大鼠发挥明显的治疗作用.
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髓样分化蛋白-2在转导内毒素信号中的作用及临床意义
在脂多糖(LPS)诱导的细胞信号转导过程中,髓样分化蛋白-2(MD-2)与LPS和Toll样受体4(TLR4)分别结合,发挥桥梁分子的作用,介导TLR4对LPS的识别.LPS是与MD-2结合,而不是TLR4,没有MD-2的参与,细胞也不能发生反应或反应微弱.MD-2可被分泌到血浆中,形成可溶性的MD-2,对只含有TLR4而无MD-2的细胞进行远程调控.表明MD-2在转导内毒索信号中具有重要作用.MD-2具有分子质量小、核酸片段短、便于调控等特点,是极具潜力的新型抗炎靶点.
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性别差异对脓毒症大鼠肝脏Toll样受体4和髓样分化蛋白-2基因表达的影响
目的探讨性别差异对脓毒症大鼠肝脏组织Toll样受体4(TLR4)和髓样分化蛋白-2(MD-2)基因表达的影响.方法以脂多糖(LPS)按5 mg/kg体重由大鼠腹腔注射制作脓毒症动物模型,注射后2 h留取肝脏组织检测TLR4、MD-2和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因表达,同时测定各组大鼠血浆中丙氨酸氨基转移酶(ALT)及雌二醇含量.结果正常雌雄性大鼠肝脏组织均可表达少量TLR4、MD-2、TNF-α基因,其中雌性组分别为0.175±0.034、0.211±0.044、0.201±0.068;雄性组分别为0.205±0.061、0.243±0.049、0.243±0.063,两组数据差异无统计学意义(P＞0.05),但LPS刺激后雌性大鼠肝脏组织上述指标分别为0.615±0.089、0.708±0.181、0.730±0.118,血浆中ALT含量为(81.07±10.72)U/L;雄性组分别为0.723±0.091、1.123±0.272、0.881±0.156,ALT含量为(106.39±14.21)U/L,雌性组各项指标均明显低于雄性大鼠(P＜0.05).相关分析表明雌性及雄性脓毒症大鼠肝脏组织TLR4及TNF-α基因表达与相应性别大鼠血浆中雌二醇含量呈显著负相关(P＜0.05).结论LPS刺激后大鼠肝脏组织TLR4、MD-2及TNF-α基因表达存在性别差异,内源性雌激素的作用可能导致雌性脓毒症大鼠肝脏组织损伤较雄性轻.
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脓毒症大鼠心肌Toll样受体4和髓样分化蛋白-2基因表达的变化和意义
目的探讨脓毒症大鼠心肌组织内毒素信号转导复合受体-Toll样受体4(TLR4)/髓样分化蛋白-2(MD-2)基因表达的变化情况,研究其与心肌组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因表达的关系.方法采用腹腔注射5 mg/kg体重内毒素(LPS)制作大鼠脓毒症模型.动物分为正常对照组(10只),内毒素注射后1、2、6 h组(各10只),利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测心肌组织TLR4/MD-2以及TNF-α的基因表达.结果LPS注射后1 h,TLR4/MD-2及TNF-α基因表达开始升高,2 h达高峰,6 h逐渐下降,各时间点的表达均显著高于对照组(P＜0.01).相关分析表明,心肌TLR4/MD-2基因表达分别与TNF-α基因表达呈显著正相关(P＜0.05).结论LPS可上调心肌组织TLR4/MD-2基因表达并诱导早期炎症细胞因子TNF-α基因表达.TLR4识别LPS信号是以TLR4/MD-2复合受体的形式完成的,而且在识别过程中,MD-2是TLR4必需的作用分子.
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分化诱导剂PMA对THP-1源性巨噬细胞膜表面受体MD-2表达的影响
目的 探索豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)对诱导分化后THP-1细胞膜表面受体髓样分化蛋白-2(MD-2)表达和分布的影响及其与炎症因子TNF-α、IL-6分泌的关系.方法 采用PMA梯度剂量(0、1、5、10、50、100 ng/ml)诱导THP-1细胞48 h后观察贴壁细胞形态并计算贴壁率；实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测贴壁细胞膜表面受体MD-2、CD14 mRNA相对表达量,ELISA检测细胞培养上清中分泌性MD-2(sMD-2)、TNF-α和IL-6的分泌水平；进一步通过Western blot检测贴壁细胞的MD-2蛋白表达、激光扫描共聚焦显微镜观察MD-2在贴壁细胞的分布和定位.结果 梯度PMA剂量(1～100 ng/ml)48 h成功诱导悬浮THP-1细胞贴壁；激光扫描共聚焦显微镜观察显示PMA诱导后MD-2主要表达于胞膜和胞浆,诱导质量浓度增加对MD-2的表达和分布均无显著影响；RT-qPCR检测THP-1细胞经PMA梯度剂量(1～100 ng/ml)诱导后MD-2和CD14 mRNA相对表达量较诱导前均显著升高(P＜0.01),诱导剂量组之间无显著差异(P＞ 0.05)；ELISA检测THP-1细胞经PMA梯度剂量(1～100 ng/ml)诱导后,细胞培养上清中的TNF-α、IL-6分泌水平依次显著增加(P＜0.01),sMD-2仅诱导前后有明显统计学差异(P＜0.01)；Western blot检测显示梯度剂量PMA诱导后细胞内MD-2蛋白表达较诱导前显著增加,诱导剂量组之间无显著差异.结论 1～100 ng/ml PMA均可将THP-1细胞诱导分化为成熟巨噬细胞,增加诱导质量浓度可显著提高炎症因子TNF-α、IL-6的分泌水平,但对其膜表面受体MD-2表达和分布无明显影响.
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人类髓样分化蛋白-2的原核表达
目的:在大肠杆菌DH-5α中表达人类髓样分化蛋白-2(human myeloid differentiaton protein-2,hMD-2)与谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione-s-transferase,GST)的融合蛋白(GST/hMD-2),并对融合蛋白进行免疫学鉴定及初步的变性复性处理.方法:建立GST/hMD-2表达菌,在不同温度下以不同浓度IPTG诱导不同时间后采样,用SDS-PAGE分析各种组合条件下融合蛋白的表达量和溶解性;用Western-Blot鉴定融合蛋白免疫性;用尿素变性和透析法对融合蛋白进行初步纯化.结果:在37℃经0.4 mmol/L IPTG诱导4 h后,GST/hMD-2可获高表达量(约占菌体总蛋白的20%),未见可溶性表达;Western-Blot证实GST/hMD-2能与抗MD-2单克隆抗体特异性结合;GST/hMD-2溶于8 mol/L尿素,梯度透析后纯度提高至40%.结论:hMD-2可在大肠杆菌DH-5α中与GST融合表达.
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干扰素-γ增强内毒素对血管内皮细胞核因子-κB的活化及其机制
目的探讨干扰素(IFN)-γ对内皮细胞上Toll样受体4(toll like receptor-4,TLR4)和髓样分化蛋白-2(myeloid differentiation protein-2,MD-2)表达的影响以及在内毒素(LPS)对内皮细胞激活中的影响. 方法分离、培养人脐静脉内皮细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法检测IFN-γ刺激后内皮细胞TLR4、MD-2 表达的变化;TransAM法检测核因子(NF)-кB活性,酶联免疫吸附分析(ELISA)法检测IL-8水平. 结果 IFN-γ能明显上调内皮细胞TLR4、MD-2的表达,并且TLR4、MD-2表达的增加与IFN-γ呈一定的剂量依赖关系;IFN-γ对内皮细胞NF-кB的活性无明显影响,但用IFN-γ孵育后的内皮细胞却对LPS的反应明显增强,NF-кB活性明显增高,白细胞介素(IL)-8分泌明显增加,且与IFN-γ呈剂量依赖关系. 结论 IFN-γ通过上调内皮细胞上的LPS受体-TLR4、MD-2而促进LPS对内皮细胞的活化.
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髓样分化蛋白-2在内毒素激活内皮细胞核因子-кB中的作用
目的探讨髓样分化蛋白-2(myeloid differentiation protein-2,MD-2)在内毒素(LPS)对内皮细胞核因子-кB(NF-кB)激活中的作用. 方法以ECV304细胞为模型,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测内皮细胞MD-2 mRNA的表达;转染MD-2功能突变体,观察MD-2在内毒素对内皮细胞NF-кB激活和内皮细胞分泌IL-8中的作用. 结果内皮细胞有MD-2 mRNA的表达,转染MD-2的突变体能明显抑制内毒素对内皮细胞NF-кB的激活和内皮细胞IL-8的分泌. 结论 MD-2在内毒素对内皮细胞NF-κB激活中发挥着不可缺少的作用,且在内毒素对内皮细胞激活/损伤效应中占有重要的地位.
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创伤患者外周血单核细胞Toll样受体4和髓样分化蛋白-2基因表达的变化
目的研究创伤患者外周血单核细胞内内毒素复合受体Toll样受体4(TLR4)/髓样分化蛋白-2(MD-2) mRNA的表达变化,观察其与临床预后的关系. 方法 35例创伤患者[损伤严重度评分(ISS)≥9分]与14例正常对照,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增TLR4、MD-2,以β肌动蛋白(β-actin)的表达作为内参照,比较TLR4、MD-2的表达水平;采用鲎试剂法测血浆脂多糖(LPS)浓度;同时观察患者的预后情况. 结果所观察的创伤患者中,血浆LPS浓度均发生不同程度的升高;TLR4、MD-2基因的表达均降低,但预后良好的可在伤后第5天恢复正常水平,预后差的在伤后第5天的表达仍处于低水平. 结论创伤可引起内毒素血症,创伤后人外周血单核细胞内TLR4、MD-2 mRNA的表达与患者的免疫机能、预后情况密切相关.
