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自身免疫性血小板减少性紫癜患者的T细胞与细胞因子异常
1 介绍针对外来抗原体液免疫反应的启动是一项复杂的生物学行为,涉及众多细胞类型及其分泌产物.反应发生于当抗原如细胞表面糖蛋白首次与抗原递呈细胞(APC)作用时.APC通常是MHC-2+的巨嗜细胞或树突状细胞,某些情况下是B细胞.抗原肽转载至Ⅱ类分子,装运至APC胞膜重新表达并递呈至抗原特异Th细胞.当MHC-肽复合体以足够的亲和力为CD4+Th T细胞受体(TCR)识别,抗原特异信号1启动并激活APC/T内一系列相关分子事件成信号2(共刺激信号),T细胞完全活化(如CD40上调APC表面B7分子,与T表面CD28作用).这些APC/T作用促进抗原致敏B细胞分化成浆细胞,分泌抗原特异的IgG抗体.因此抗原特异Th细胞的任一缺陷或异常刺激将显著改变免疫反应进程.同时不能轻估Th细胞的其他重要作用,如决定针对外来抗原的抗体生成;抗体生成后反应调节的激活事件,如抗体的亲和成熟;调节性T细胞及或可溶性细胞因子分泌.
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靶向性肿瘤相关抗原TAG-72的scFv-CD28融合基因的真核表达载体的构建
目的构建含抗肿瘤相关抗原TAG-72单链抗体及CD28胞内区及跨膜区融合基因的哺乳细胞表达载体,为制备消化道肿瘤靶向性嵌合锚定T细胞,并探讨其对消化道肿瘤的杀伤活性.方法应用PCR法,将抗TAG-72单链抗体(single chain variable fragment,scFv)克隆入哺乳细胞表达载体pcDNA3.0,在5′端及3′端分别引入相应酶切位点;用RT-PCR法从正常人外周血T细胞克隆CD28胞内区及跨膜区的cDNA,然后将其克隆于scFv的下游,并在5′端及3′端引入相应的酶切位点.结果抗TAG-72 scFv cDNA片段为729 bp,与已知的序列相符;CD28胞内区及跨膜区的cDNA片段为240 bp,与Genebank公布的序列一致.重组的表达载体经酶切琼脂糖电泳测序加以证实.结论完成了抗肿瘤相关抗原TAG-72 scFv及CD28胞内区及跨膜区融合基因scFv-CD28-pcDNA3.0的构建,为制备消化道肿瘤靶向性嵌合锚定T细胞奠定了实验基础.
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HVEM重组腺病毒载体的构建与鉴定
目的HVEM突变体和EGFP共表达复制缺陷型腺病毒载体的构建与鉴定.方法 RT-PCR获得人HVEM的cDNA,使其与LIGHT分子结合的表位点突变,保留与BTLA结合的关键位点.构建经修饰的HVEM基因的复制缺陷型腺病毒载体Adv-mHVEM-IRES2-EGFP并对其进行鉴定和转染效率测定.结果成功构建HVEM突变体和EGFP复制缺陷型腺病毒载体,经过测序与预期一致.该载体能够表达突变的HVEM和EGFP蛋白,体外培养细胞转染效率达到95%以上.结论构建的腺病毒载体能够共表达目的基因的产物HVEM突变体和EGFP蛋白,对体外细胞具有高效转染能力.
关键词： 共刺激信号 HVEM突变体 BTLA腺病毒表达载体 -
激活T细胞负性共刺激信号对大鼠同种异体肾移植存活的影响
目的观察激活负性共刺激信号程序性死亡因子及配体(PD1-PDL1)对延长移植肾存活的效能.方法以PDL1Ig基因重组腺病毒为载体,将PDL1Ig基因转入BN大鼠供肾,以Lewis大鼠为受体,行同种肾移植为转染组,并以未转染BN供肾移植给Lewis受体为对照组;观察移植肾存活时间和术后肾功能变化.结果转染组移植肾存活(36±7.3)d,较对照组移植肾存活时间(8.6±1.2)d明显延长;移植组术后血清肌酐较同期对照组明显为低.结论PDL1基因局部转染可明显延长移植肾存活时间.
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小鼠抗人B7-1(CD80)单克隆抗体的制备及其对肿瘤细胞的抑制作用
目的 制备小鼠抗人B7-1 (CD80)单克隆抗体(mAb),研究其对天然表达B7-1的恶性肿瘤细胞体外生长和迁移的影响.方法 以人B7-1基因转染的L929-B7-1细胞免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术制备mAb,并通过流式细胞术检测mAb对肿瘤细胞膜型B7-1的识别.以天然表达B7-1的Daudi细胞、Raji细胞及8266细胞为观察对象,分别加入(5、10、20、40) μg/mL B7-1 mAb处理,采用噻唑蓝(MTT)法检测mAb对肿瘤细胞体外增殖的影响,TranswellTM法分析mAb对肿瘤细胞体外迁移的影响,流式细胞术分析mAb对肿瘤细胞凋亡的诱导作用.结果 成功制备1株能稳定分泌小鼠抗人B7-1 mAb的杂交瘤,命名为5G10.经流式细胞术分析,该抗体与Daudi、Raji、8266、U266、BEL-7402及MCF-7肿瘤细胞的阳性结合率分别为(96.30 ±2.12)％、(95.70±1.79)％、(96.80±2.48)％、(23.20 ±2.35)％、(1.68±0.35)％、(0.55±0.04)％;与对照组相比,20μg/mL 5G10 mAb明显抑制Daudi细胞、Raji细胞及8266细胞的增殖,肿瘤细胞迁移率明显降低,细胞凋亡率明显增加.结论 小鼠抗人B7-1 mAb能特异性识别和结合不同肿瘤细胞膜表面的B7-1,并能显著抑制天然表达B7-1的肿瘤细胞的体外生长、迁移并促进其凋亡.
关键词： B7-1(CD80) 单克隆抗体 共刺激信号 细胞增殖 细胞迁移 -
鼠抗人4-1BB单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定
目的:鼠抗人4-1 BB分子功能性单克隆抗体(mAb)的研制及其生物学特性的鉴定.方法:以高表达人4-1 BB分子的转基因细胞293T/4-1 BB为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,并以293T/4-1BB为阳性抗体筛选细胞,293T/mock为阴性抗体筛选细胞,经免疫荧光标记和流式细胞术(FCM)分析、反复筛选和多次克隆化培养,筛选出特异分泌鼠抗人4-1BB分子mAb的杂交瘤细胞株；采用Western blot、间接免疫荧光法、竞争结合抑制试验、3H掺入和细胞凋亡分析等方法对mAb进行生物学特性的鉴定.结果:成功获得3株持续、稳定分泌鼠抗人4-1BB mAb的杂交瘤细胞株,命名为1G5、4B11和9F11.对mAb的生物学功能的研究结果表明,3株mAb均能识别活化T细胞和单核细胞来源的树突状细胞(Mo-DC)表达的4-1BB分子.mAb 4B11能有效地激发T细胞体外增殖、抑制其凋亡,并能促进Mo-DC体外扩增,上调CD80、CD83、CD86和CD1α的表达.结论:获得的3株分泌鼠抗人4-1BB mAb的杂交瘤,所分泌的抗体具有特异性地识别人4-1BB分子；其中4B1 1 mAb具有激发T细胞增殖及促进Mo-DC体外扩增与成熟的作用,为激发型4-1BB mAb.
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两株新的鼠抗人OX40L单克隆抗体的研制及其生物学功能的初步研究
目的:鼠抗人OX40L分子功能性单克隆抗体(mAb)的研制及其生物学特性的鉴定.方法:以高表达人OX40L分子的基因转染细胞L929/OX40L为免疫原, 常规免疫BALB/c小鼠, 采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合, 经流式细胞术(FCM)分析和多次克隆化培养, 筛选出特异分泌鼠抗人OX40L分子mAb的杂交瘤细胞株;采用Western blot、 Ig亚型快速定性试纸法、染色体核型分析、竞争结合抑制试验、间接免疫荧光法和MTT增殖试验等对单抗的生物学特性进行鉴定.结果:获得2株持续、稳定分泌鼠抗人OX40LmAb的杂交瘤细胞株, 分别命名为4D6和5C2.对mAb生物学功能的研究结果表明, 2株mAb均能识别成熟DC细胞以及Jurkat、 SHI-1、 U937等白血病细胞株表面的OX40L分子.对其中SHI-1白血病细胞株增殖影响的实验显示, 这2株抗体对SHI-1的增殖都具有一定的抑制作用.结论:成功地获得了2株鼠抗人OX40L功能性mAb杂交瘤, 其所分泌的抗体能特异地识别人OX40L分子, 并影响表达OX40白血病细胞株的体外增殖, 为进一步研究OX40/OX40L的生物学功能奠定了基础.
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调节免疫耐受的新靶点蛋白激酶Cθ
随着分子生物学技术的广泛应用, 人们对免疫应答及免疫调节机制的研究逐步上升到分子水平, 抗原受体及其它细胞膜分子介导的信号传递过程的研究,已成当代免疫学研究的主要前沿领域.
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B7蛋白家族及其在血液系统疾病治疗中的应用
T细胞对肿瘤细胞的免疫应答受到两种信号共同调节,首先肿瘤细胞表面的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)与T细胞表面的受体相互作用;其次免疫细胞、组织细胞或者肿瘤细胞产生的次级信号(secondary signals)对T细胞具有共刺激或者抑制作用[1].次级信号机制是一个十分复杂的调控网络,由多种免疫球蛋白、肿瘤坏死因子、趋化因子、细胞因子以及黏附蛋白构成.B7家族是参与次级信号机制的主要分子,在调节正常免疫与自体免疫的平衡方面发挥重要作用.针对B7家族蛋白的治疗手段包括:造血干细胞移植、抗肿瘤疫苗、工程T细胞等等.
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CTLA-4Ig在诱导器官移植免疫耐受中的研究新进展
目前器官移植大障碍依然是术后排斥反应的发生.因此,寻找诱导免疫耐受的方法一直是器官移植领域的研究热点.抗原特异性T细胞的有效活化除需要TCR识别抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)提呈的MHC -肽作为第一信号外,还必需有APC和T细胞表面的共刺激分子之间相互作用所提供的共刺激信号作为第二信号才能顺利完成,阻断该第二信号而仅有第一信号则可以引起T细胞克隆无能甚至是凋亡,从而诱导器官移植免疫耐受.第一个发现可介导协同刺激信号的分子是T细胞表面的CD28分子和APC表面的B7分子,它们在移植后排斥反应的发生中起着非常重要的作用,体外阻断协同刺激反应,尤其是阻断CD28与B7分子的信号转导,可抑制T细胞活化,诱导T细胞克隆免疫无应答.现就利用CTLA-4Ig阻断CD28/B7通路来诱导抗原特异性免疫耐受的研究新进展做一综述.
