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人源中和性抗高致病性禽流感病毒H5N1基因工程全抗体的研制
运用噬菌体表面呈现技术,从禽流感病人恢复期血中获得淋巴细胞,通过基因工程手段,构建了人源抗H5NI禽流感病毒基因工程抗体文库.用纯化的人源H5N1禽流感病毒颗粒(A/Anhui/1/2005)及重组血凝素蛋白HA(A/Viet Nam/1203/2004)对Fab噬菌体抗体库进行富集筛选,成功地获得了抗禽流感病毒H5N1血凝素蛋白HA的人源单抗Fab段基因,并在大肠杆菌中获得有效表达.通过序列测定确定抗体轻重链型别,然后将阳性克隆的轻链和重链Fd段基因分别克隆入全抗体表达载体pAC-L-Fc后转染昆虫Sf9细胞,利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现全抗体的分泌型表达.用ELISA、IFA和流式细胞术对所获人源单抗的功能特性进行鉴定.结果表明,我们获得了2株特异性针对H5N1禽流感病毒血凝素蛋白HA而与甲1型和甲3型人流感病毒无交叉反应的人源单抗(AVFlulgG01、AVFlulgG03).微量中和试验结果表明,除A/Guangdong/1/2006外,AVFlu-IgG01能够广泛地中和HA基因进化上属于Clade 2的中国南方、北方及中部地区的H5N1禽流感病毒分离株,同时还对属于Clade Ⅰ的越南H5N1分离株A/Viet Nam/1203/2004具有中和活性;AVFluIgG03虽然不能中和A/Viet Nam/1203/2004,但是对属于Clade 2的所有中国H5N1分离株均具有中和作用.人源中和性抗禽流感病毒H5N1基因工程全抗体的获得不仅为高致病性禽流感病毒H5N1的预防和治疗带来了希望,同时也为其疫苗研制提供了新的思路.
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中和性流行性感冒病毒基因工程抗体在昆虫细胞中的全基因表达、纯化及鉴定
将中和性流行性感冒(流感)病毒基因工程抗体IV-2、IV-6的轻链和重链Fd段基因,分别克隆入全抗体表达载体pAC-L-Fc,构建成杆状病毒表达载体pAC-L-Fc-Ⅳ-2和pAC-L-Fc-Ⅳ-6,转染昆虫Sf9细胞,利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现抗体的分泌型表达,表达产物进行亲和层析分离纯化.SDS-PAGE电泳和Western blot法证实有完整免疫球蛋白的表达,免疫印迹法证实它们能与流感病毒血凝素蛋白特异性结合.经间接竞争性抑制ELISA法测定,抗体与流感病毒抗原结合的解离常数KD值分别为2.5×10-9M和3.0×10-9M.流感病毒基因工程全抗体经在昆虫细胞中的表达、纯化和抗体特性鉴定,获得了两株纯化的全抗体,可用于以后的动物模型呼吸道粘膜被动免疫抗感染的研究.
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基因工程抗体研究进展
基因工程抗体技术的发展十分迅速，其应用也极其广泛。本文将介绍 核糖体展示、噬菌体表面展示等基因工程抗体技术及应用进展。
关键词： 基因工程抗体 核糖体展示技术 噬菌体表面展示 技术 -
单克隆抗体和基因工程抗体在感染性疾病病原体检测中的应用
感染性疾病病原体的准确检测对于其有效防控极为重要,也是合理用药、有效治疗的前提.抗体因其高度的特异性和亲和力,已经成为免疫诊断中一个关键性的分子.其类型多样,从多克隆抗体到单克隆抗体,再发展到基因工程抗体,而基因工程抗体又包括单链抗体、双特异性抗体和多特异性抗体等.各类型抗体在感染性疾病的免疫诊断方面均有应用.本文就单克隆抗体和基因工程抗体在感染性疾病免疫学诊断方面的应用作一综述.
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抗Pgp/抗CD3双特异双链抗体的生物学活性研究
目的研究抗Pgp/抗CD3双特异双链抗体介导的特异性靶向杀伤活性.方法采用亲和层析法分离纯化本室构建的抗Pgp/抗CD3双特异双链抗体可溶性表达产物,并用SDS-PAGE、Western blot及抗活细胞间接免疫荧光法鉴定纯化产物;采用51Cr释放试验测定其介导的体外靶向杀伤活性.结果纯化的抗Pgp/抗CD3双特异双链抗体具有与Jurkat细胞(CD3+)和K562/A02(Pgp+)细胞结合的活性;抗Pgp/抗CD3 双特异双链抗体具有介导激活的T淋巴细胞杀伤Pgp表达阳性的耐药肿瘤细胞的作用,杀伤作用的强弱显示出效靶比和剂量依赖关系,且可被CD3ScFv或PgpScFv特异性的阻断.结论抗Pgp/抗CD3微型双功能抗体有望成为治疗耐药肿瘤,特别是肿瘤残留灶和微小转移灶的治疗的一种新策略.
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抗CD3/抗CD20双特异双链抗体的生物学活性研究
目的研究抗CD3/抗CD20双特异双链抗体的生物学活性. 方法采用亲和层析法纯化本室构建的抗CD3/抗CD20双特异双链抗体可溶性表达产物,并用SDS-PAGE,Western blot和分子排阻层析鉴定纯化产物;采用FACS法和玫瑰花环试验测定纯化产物与靶细胞的结合活性;采用3H-TdR掺入实验和51Cr释放试验测定该双特异双链抗体的生物学性质. 结果纯化的抗CD3/抗CD20双特异双链抗体具有与Jurkat(CD3+)和Daudi细胞(CD20+)的结合活性,且能同时与Jurkat和Daudi细胞结合形成玫瑰花环,并能竞争性封闭亲代鼠源性抗体HIT3a和HI47与Jurkat和Daudi细胞的结合位点;该双特异双链抗体具有促有丝分裂原作用和介导激活的T细胞杀伤Daudi细胞的活性. 结论抗CD3/ 抗CD20双特异双链抗体具有与亲代鼠源性抗体HIT3a和HI47相同的性质,且能介导激活的T细胞杀伤表达CD20抗原的肿瘤细胞,是一个有望用于B细胞恶性肿瘤临床治疗的双特异性抗体.
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抗VEGF165的嵌合抗体在小鼠骨髓瘤细胞中的表达
目的 减少鼠源性单抗的免疫原性,获得抗人血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165, VEGF165)的人/鼠嵌合抗体.方法 将抗VEGF165鼠单抗VmD11的轻链可变区基因VL和重链可变区基因VH分别克隆到带有人IgG1轻链恒定区基因Cκ,重链恒定区基因Cγ1的真核表达载体pAcyc-neo-Cκ和psv2-gpt-Cγ1上,构建了真核表达载体pAcyc-neo-Cκ/hu和psv2-gpt-Cγ1/hu,并应用脂质体转染的方法将其共同导入小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0中进行表达.结果 转染后通过筛选培养获得了7个抗性细胞克隆,经亚克隆化培养得到4个稳定表达的阳性细胞株,ELISA检测到抗VEGF165人/鼠嵌合抗体表达,RT-PCR也证实了该嵌合抗体在mRNA水平上的表达.培养上清液中的抗体表达量约为10μg/L,腹水中约为100μg/L,经竞争ELISA实验和Western blot实验证实其具有与亲本鼠源单抗相同的VEGF165结合特性.结论 成功的构建了能与VEGF165结合的人/鼠嵌合抗体.
关键词： 血管内皮细胞生长因子 嵌合抗体 基因工程抗体 -
人源抗HBsAg Fab工程化大肠杆菌优化表达的实验研究
目的探讨表达人源抗HBsAg Fab工程化大肠杆菌的优化培养模式及诱导方法,以期大量获取人源抗HBsAg Fab.方法在摇瓶发酵条件下探讨工程菌的生长和表达规律,筛选佳的培养模式及诱导表达条件,后于发酵罐中行补料高密度发酵试验,以确定佳补料模式.结果由摇瓶发酵获得的数据表明,当培养体系处于对数生长中期为诱导表达的起点,在25℃下以0.2% arabinose诱导12h条件下Fab的产率佳,采用溶氧控制补料模式可使培养体系的大OD600达到55.2,相当于湿菌含量110g/L水平.同时,经证实Fab的抗原结合活性良好.结论确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺,为应用原核表达体系工业化大批量生产基因工程抗体奠定了基础.
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人源抗-HAV全分子抗体在CHO细胞中的表达
目的:构建人源抗-HAV全分子抗体的CHO细胞表达体系.方法:将抗-HAV抗体轻链全分子(信号肽与VL-CL)基因克隆至表达载体pCI-neo中;将重链信号肽、重链(γ)VH-CH1和Fc基因进行重组形成重链全分子基因,再将其克隆到真核表达载体pCdhfr1中.将轻、重链全分子表达载体共转染CHO/dhfr-细胞,用G-418和甲氨蝶呤(MTX)筛选细胞克隆,ELISA法检测细胞培养上清中的抗-HAV活性,增加MTX浓度进行加压筛选.用蛋白L亲和层析柱从培养上清中纯化重组抗体.结果:构建的真核表达载体可实现抗-HAV全分子抗体在CHO细胞中的分泌表达,纯化的重组抗体在还原SDS-PAGE中表现为相对分子质量约25000、50000两条带;Western印迹表明,重组抗体全分子和重链分子均可和羊抗人Fc抗体发生特异性免疫反应.结论:抗-HAV全分子抗体在CHO细胞中表达,为基因工程生产具有完整功能的全分子抗体奠定了基础.
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双特性抗体技术演进与作用模式的研究进展
双特异性抗体(BsAb)融合2种单抗的特异性,能够同时与不同的抗原或抗原表位结合,这种特殊的作用机制使其成为引入注目的治疗药物.经过多年的研究与发展,第一个双特异性抗体于2009年进入市场,另一个于2014年上市,还有众多双特异性抗体处于临床试验阶段.自然状态下不存在双特异性抗体,只能通过特殊方法进行制备.随着生命科学基础与应用研究的飞速发展,双特异性抗体的分子模式与制备技术在不断的演进,作用机制也在不断创新,应用范围更从肿瘤与炎症疾病,拓展到了遗传疾病.双特异性抗体有望成为未来抗体药物中的重要一员.
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真核细胞表达基因工程抗体的研究进展
大肠杆菌E.coli表达系统是非常常用、有效和方便的表达系统,可以进行许多异源蛋白的高效表达.然而原核细胞系统表达蛋白时,存在多种缺陷:真核基因通常含有内含子,原核细胞不能对其进行正确的剪切和拼接;缺乏真核生物的蛋白翻译后修饰和加工;表达产物多以包涵体形式存在,复性困难且效率很低;背景杂蛋白多、不易于纯化等,因此不可避免地对利用原核细胞表达基因工程抗体造成一定影响.
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胰腺癌的放射免疫治疗进展
胰腺癌是常见的肿瘤,但预后很差,传统治疗的结果令人失望,放射免疫治疗提供了一个新的治疗途径.单克隆抗体具有高度的特异性,放射性核素在肿瘤部位积聚高而达到杀伤瘤细胞的目的.完整的单抗因其分子质量较大而难于达到肿瘤内部,且易诱发人抗鼠抗体反应.基因工程抗体因具有更高的亲和力和更容易进入肿瘤内部,已成为放射免疫治疗的热点及突破胰腺癌临床治疗的关键所在,将在胰腺癌的治疗中发挥重要作用.
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Mab筛选和应用的研究进展
单克隆抗体(monoclonal antibodies,Mab)是指只针对一个抗原表位的结构与各种特性完全相同的高纯度抗体.
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基因工程抗体的研究进展及临床应用
自从1975年,Kohler和Milstein发现的杂交瘤技术以来,单克隆抗体技术已被广泛地应用于疾病的诊断及治疗中.鼠杂交瘤是单克隆抗体的第一个可靠来源,但是临床反复应用会导致抗鼠免疫反应.临床上理想的抗体应该是完全人源化的,而人源单抗的生产在技术上难以克服融合率低、建株难、不稳定、产量低、人体不能随意免疫等问题.20世纪80年代中期,随着基因工程技术的发展以及抗体分子遗传学的深入研究,应用基因工程技术来改造现有优良的鼠单抗的基因,减少抗体中的鼠源成分,尽量保留原有抗体的特异性,此技术主要是将免疫球蛋白基因结构与功能同DNA重组技术有机结合起来,在基因的水平上将免疫球蛋白分子进行重组后导入转染细胞后表达,基因工程抗体是继多克隆抗体和单克隆抗体之后的第三代抗体.本文主要介绍基因工程抗体的进展情况及临床应用.
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利妥昔单抗在治疗抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎的研究进展
肾脏是抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎(anti-neutrophil cytoplasm antibody associated systemic vasculitis,AASV)常累及的器官,常表现为急进性肾炎,死亡率高.尽管大多数AASV患者对免疫抑制剂和糖皮质激素治疗有较好的疗效,但是本病的高复发率、治疗过程中的毒副作用、高感染率等都导致AASV的预后不佳.利妥昔单抗(rituximab,RTX)是一种特异性针对CD20分子的基因工程抗体,能与B淋巴细胞表面的CD20结合,并通过补体介导的细胞毒作用等机制对B淋巴细胞进行特异性清除,从而达到治疗作用.
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抗人IL-2Rα基因工程抗体Fab的构建和表达
目的:构建和表达抗人IL-2Rα基因工程抗体Fab片段,并测定该抗体片段的生物学活性.方法:采用连续PCR方法构建抗人IL-2Rα抗体Fab克隆载体5G1-pA22,并通过限制性酶切反应将抗人IL-2Rα抗体Fab基因从克隆载体5G1-pA22重组入表达载体pET-28b,并在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导以包含体形式高效表达,该表达产物约占菌体蛋白20%以上.经超声破碎、洗涤、变性和复性后,采用双抗体夹心ELISA法及体外抗体竞争抑制试验鉴定表达产物的生物学活性.结果:抗人IL-2Rα基因工程抗体Fab成功构建,并以包含体形式表达,表达产物的产量达1 mg/ml.双抗体夹心ELISA法试验表明抗体Fab段与IL-2Rα有特异的结合能力,体外抗体竞争抑制实验表明Fab段可拮抗IL-2与活化T细胞表面IL-2Rα有特异的结合,抑制T细胞活化,增殖,抑制率达90%以上.结论:成功地构建了抗人IL-2Rα抗体Fab段,并获得高效表达,其具有较好的生物学活性.
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抗乙型肝炎病毒表面抗原的IgG全抗体表达载体的构建
目的 构建抗乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的IgG全抗体杆状病毒表达载体.方法 用PCR方法扩增抗HBsAg 抗体Fab片段的轻链(L)及重链Fd段(VH+CH1)基因片段,将杆状病毒载体pAC-k-Fc与L基因连接,重组为过渡表达载体pAC-k-L-Fc,再与Fd基因连接,构建重组表达载体pAC-HBs-Fc,并进行酶切鉴定及DNA测序分析.确定正确后,转染昆虫细胞sf9,用免疫荧光检测IgG的表达.结果 PCR扩增的片段约650 bp,与预期值一致.载体pAC-k-L-Fc和pAC-HBs-Fc的酶切片段和DNA序列与预期结果一致.转染sf9细胞呈阳性荧光反应,未转染细胞呈阴性荧光反应.结论 已成功构建表达载体pAC-HBs-Fc,为表达抗人HBsAg的IgG全抗体奠定了基础.
关键词： 乙型肝炎病毒表面抗原 基因工程抗体 杆状病毒 -
人源抗乙型肝炎病毒表面抗原基因工程IgG全抗体的表达、纯化及初步鉴定
目的 对人源抗乙型肝炎病毒表面抗原的基因工程IgG全抗体进行表达、纯化及初步鉴定.方法 用含Fc片段抗-HBsAg Fab抗体基因的载体pAC-HBs-Fc,与杆状病毒线性DNA共转染昆虫细胞sf9,产生重组抗-HBsAg的全抗体.以不同浓度的HBsAg包被酶标板孔,用间接ELISA法检测培养上清中抗体的表达及特异性;用蛋白G亲和层析柱进行抗体的纯化,并对纯化的抗体进行SDS-PAGE、Western blot和竞争性ELISA分析.结果 上清中表达的重组IgG抗体仅与HBsAg呈阳性反应,特异性良好,纯化后其纯度达97.1%.经SDS-PAGE和Western blot分析可见,IgG抗体轻链和重链的相对分子质量分别约为27000和55000,为人源IgG抗体.CHO表达的HBsAg和血源性HBsAg能竞争性抑制该重组IgG抗体与E.coli表达的HBsAg反应,其抑制率分别为55.9%和81.9%.结论 人源抗乙型肝炎病毒表面抗原的基因工程IgG全抗体可在杆状病毒载体表达系统中成功表达.
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抗CD3/抗CD19微型双功能抗体的构建、表达及活性测定
背景与目的:微型双功能抗体是基因工程抗体的-种形式,它具有两个抗原结合位点,可选择性募集效应细胞到靶细胞周围,介导特异性杀伤作用.本实验构建抗CD3/抗CD19微型双功能抗体(diabody)载体,表达纯化后测定其生物学活性.方法:用重叠PCR(overlap PCR)和PCR方法,构建抗CD3/抗CD19 diabody 载体,转化感受态大肠埃希菌进行原核表达.表达产物经抗His-tag亲和层析柱分离纯化,12%SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定.应用间接免疫荧光和竞争性免疫荧光结合流式细胞分析技术(PACS)检测生物学活性.结果:基因重组质粒经测序证实序列正确.抗CD3/抗CD19 diabody能够在原核表达系统中进行可溶性表达.12%SDS-PAGE显示28×103和26×103各有-条带,Western blot在28×103显示有条带,与预期相符.表达产物经纯化定量可达5 mg/L.FACS检测抗CD3/抗CD19 diabody可与CD19+ Raji细胞和CD3+ Jurkat细胞特异结合,并能竞争性抑制HIT3a和HIT19a与上述细胞的结合活性.结论:本实验成功构建了抗CD3/抗CD19 diabody,并且能够进行可溶性表达,可与CD19+ Raji细胞和CD3+ Jurkat细胞特异结合,为以后的抗体功能实验奠定了基础.
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人源抗Met基因工程抗体scFv的改造与特性分析
目的:将已制备的抗Met单链抗体基因与人IgG Fc基因片段融合,表达有活性的融合蛋白分子,以增强单链抗体的可溶性.方法:从人淋巴细胞提取总RNA,经RT-PCR扩增并制备人IgG的Fc基因片段,并克隆于已构建好的pBAD-scFv原核表达载体中,转化大肠杆菌Top10,经阿拉伯糖诱导表达融合蛋白scFv-Fc.所表达的可溶性蛋白经亲和层析纯化、SDS-PAGE、Western blot分析鉴定,并用ELISA检测抗体效价.结果:序列分析表明重组质粒pBAD-scFv-Fc基因序列正确;SDS-PAGE分析表明,scFv-Fc融合蛋白分子量为60 ku,且为可溶性蛋白;该蛋白经过His亲和层析纯化、ELISA检测,结果表明,该融合蛋白能够与抗原分子Met特异性结合.结论:改造后的抗体融合蛋白scFv-Fc能与人Met特异性结合,增加了抗体蛋白溶解度,有利于抗体的大量制备.
