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Angelman综合征的遗传学诊断
目的 探讨Angelman综合征(Angelman syndrome,AS)的遗传学诊断,为临床诊断和遗传咨询提供信息.方法 应用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MS-PCR)对16例临床疑似AS病例进行基因诊断,并选择15号染色体特定区域内、外的短串联重复序列作为遗传标记对MS-PCR诊断阳性的AS核心家系进行连锁分析,以进一步确定其分子病理学类型.结果 应用MS-PCR技术诊断10例AS患儿,家系连锁分析显示10例AS患儿中有9例为15q11-13片段缺失型,1例为印记缺陷型.结论 MS-PCR检测能够诊断大部分AS,家系连锁分析可进一步区分其具体的分子病理学类型.开展相关的遗传诊断对临床诊断、遗传咨询以及产前诊断都具有积极的作用.
关键词： Angelman综合征 甲基化特异性PCR 短串联重复序列 -
EC-SOD基因甲基化与脑梗死的相关性
目的 研究细胞外超氧化物歧化酶(extracellular superoxide dismutase,EC-SOD)基因的甲基化状态与脑梗死的相关性.方法 入选83例脑梗死患者和94名对照者,根据颅脑磁共振结果记录患者梗死灶的大小,并评估颅内动脉的硬化程度,进行NIHSS评分及Barthel指数评定.应用甲基化特异性PCR检测外周血EC SOD基因的甲基化状态,并分析其与脑梗死的相关性.结果 脑梗死组EC-SOD基因启动子区甲基化检出率(30.1％)较对照组低(53.2％),差异有统计学意义(P＜0.05).以梗死灶直径4 cm为界,大面积脑梗死患者甲基化检出率(0)低于小面积脑梗死患者(39.1％),差异有统计学意义(P＜0.05).57例患者行颅脑MRA检查,无脑动脉硬化、轻度脑动脉硬化、中度脑动脉硬化、重度脑动脉硬化患者的EC SOD基因的甲基化检出率有下降趋势(分别为45.5％、42.9％、23.8％、14.3％),但差异无统计学意义(P＞0.05).脑梗死组中,甲基化程度高者的NIHSS评分较低,差异有统计学意义(P＜0.05);而Barthel指数较高,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论 脑梗死患者EC-SOD基因甲基化程度较正常对照低,其程度与患者梗死灶大小、脑动脉硬化程度及神经功能缺损严重程度相关.
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Leptin基因甲基化与糖尿病的相关性研究
目的 探讨瘦素基因启动子区甲基化及蛋白表达与糖调节受损(impaired glucose regulation,IGR)以及2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)的相关性.方法 采用甲基化特异性PCR对不同血糖水平的个体进行Leptin基因启动子区甲基化检测.用双抗体夹心ABC-酶联免疫吸附法检测血液标本中的瘦素蛋白表达量.结果 与正常对照组(59.2％)相比,T2DM和IGR组Leptin基因的甲基化率偏低(分别为31.5％和43.6％),差异具有统计学意义(x2分别为22.499,5.109,P值均＜0.05).T2DM与IGR组相比甲基化率偏低(x2=3.962,P＜0.05),差异具有统计学意义.患者的瘦素含量相对于正常人均偏高,但仅T2DM组与正常人差异具有统计学意义(q=6.81,P＜0.01).直线回归分析提示,瘦素含量随DNA甲基化程度的降低有增高的趋势,两者呈显著负相关(r=-0.95,P＜0.01).结论 Leptin基因启动子区甲基化与瘦素代谢紊乱可能参与糖尿病的发生和发展.检测IGR和T2DM患者Leptin基因启动子区的甲基化状态和基因蛋白表达,对于早期干预、延缓病程具有一定的参考价值.
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THBS1基因甲基化与急性髓系白血病发病关系的研究
目的 探讨急性髓系白血病(AML)患者外周血白血病细胞及AML和骨髓增生异常综合征(MDS)细胞株中凝血酶敏感蛋白1 (THBS1)基因甲基化状态及其与AML发病的关系.方法 分别用改良型PRIM-1640培养基、IMDM培养基培养HL-60、HL-60/ADM、SKM-1、MV4-11细胞株;收集初诊急性髓系白血病患者30份(AML实验组)及健康成年人外周血20份(正常对照组),提取其各自基因组DNA;用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测2组外周血的THBS1基因甲基化发生率,以及白血病细胞株HL-60、HL-60/ADM、SKM-1、MV4-11中THBS1基因的甲基化水平.结果 AML组和对照组外周血中THBS1基因甲基化发生率为36.7％ (11/30)vs0(0/20) (P ＜0.01);HL-60、HL-60/ADM、SKM-1、MV4-11细胞株均发生THBS1基因甲基化.结论 AML患者外周血白血病细胞及AML、MDS细胞株中均发生THBS1基因甲基化,提示这一现象与AML的发病有一定相关性.
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支气管上皮细胞系BEP2D恶性转化过程中p16基因甲基化改变研究
目的研究人支气管上皮细胞系BEP2D恶性转化过程中p16基因甲基化改变以及p16基因mRNA转录情况.方法选取正常人支气管上皮细胞系BEP2D及其经α粒子照射20周(R-20)、21周(R-21)、35周(T-35)和54周(T-54)的BEP2D细胞株作为研究对象(其中R-20、R-21未发生恶性转化,而T-35、T-54已发生恶性转化),采用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR, MSP)检测各细胞株中p16基因的甲基化改变情况,再运用半定量反转录PCR(retro-translation PCR, RT-PCR)检测p16基因mRNA在各细胞株中的表达情况.结果①正常BEP2D细胞株p16基因未发生甲基化,而R-20、R-21、T-35和T-54细胞的p16基因均发生了甲基化改变.②与正常BEP2D 细胞相比,R-20、R-21、T-35和T-54细胞p16基因mRNA转录水平均降低.结论 p16基因甲基化改变发生在肺癌形成的早期阶段.p16基因甲基化可导致p16基因mRNA转录水平降低.
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RASSF1A基因启动子区甲基化状态在食管鳞癌诊断中的研究
目的:检测RASSF1A(ras association domain family 1A,RASSF1A)基因在肿瘤组织的甲基化频率差异,并且评价其对食管鳞癌的诊断价值.方法:收集食管鳞癌组织、癌旁组织各43例,记录病人的病理资料.应用甲基化特异性PCR法结合琼脂糖凝胶电泳检测RASSF1A基因在组织中的甲基化情况,比较甲基化基因检测与肿瘤标志物两种检测标志物在食管癌诊断中的价值.将实验结果录入统计软件,计数资料两组间比较采用χ2检验统计分析.结果:RASSF1A基因在肿瘤组织中的甲基化频率为34.88%,显著高于癌旁组织6.98%,差异有统计学意义(P=0.001);RASSF1A基因启动子区异常甲基化状态与患者年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、肿瘤深度、是否淋巴结转移及临床分期无明显关系(P>0.05),RASSF1A基因甲基化检测阳性检测率为34.88%,明显高于肿瘤标志物的阳性检测率11.62%,差异有统计学意义(P=0.011);结论:RASSF1A基因启动子区甲基化的检测在食管鳞癌的诊断中具有较高的价值.
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肺鳞癌INK4a/ARF基因启动子甲基化研究
目的分析肺鳞癌(SCC)及其周围正常肺组织INK4a、ARF基因启动子甲基化改变情况.方法收集外科手术切除标本SCC标本17例,同时选取周围正常肺组织作为对照,运用甲基化特异性PCR(MSP)方法对癌组织及其周围正常肺组织INK4a和ARF基因启动子的甲基化状态进行检测.结果17例SCC组织,13例INK4a扩增阳性,2例ARF扩增阳性;对应的正常肺组织,1例INK4a扩增阳性,1例ARF扩增阳性.卡方检验,INK4a在肺癌组织和正常肺组织之间差异有显著性,ARF在肺癌组织和正常肺组织之间差异无显著性.结论INF4a基因启动子甲基化是SCC的一个普遍性事件,参与SCC的形成过程,可作为SCC的分子诊断标志之一,而ARF基因甲基化在SCC则是一个相对罕见性事件.
关键词： 肺鳞癌 INK4a/ARF基因 甲基化 甲基化特异性PCR -
表观遗传学DNA甲基化与非创伤性产前诊断
表观遗传学研究与DNA序列改变无关,仅发生表现型改变的过程,DNA甲基化是表观遗传学具特征的标志之一,DNA甲基化技术的进展将其应用领域扩大到非创伤性产前诊断.甲基化特异性PCR可快速、灵敏地根据胎儿和母亲之间DNA甲基化的差异从母血浆中检测胎儿DNA.
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1例染色体平衡易位型Prader-Willi综合征的细胞分子遗传学诊断和发病机制研究
目的 探讨1例Prader-Willi综合征(Prader-Willi syndrome,PWS)患儿的遗传学诊断及发病机制.方法 对患儿的血样本进行染色体核型分析,采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific PCR,MSPCR)及多重连接探针扩增(MS-multiplex ligation-dependent probe amplification,MS-MLPA)技术对患儿的DNA样本进行基因分析.结果 该患儿染色体核型45,XY,-5,-15,t(5,15)(q34q13),甲基化特异性PCR(MS-PCR)监测到特异性PWS相关基因的甲基化,确诊该患儿为PWS患者.进一步MS-MLPA证实PWS是由于染色体的平衡易位导致父源性15q11～q13区域的缺失所致.结论 细胞分子遗传学实验对PWS的临床诊断以及分子遗传基础的分析都具有积极的作用.
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卡波西肉瘤中HHV-8 ORF50启动子基因甲基化的研究
目的:探讨人类疱疹病毒8型(HHV-8)ORF50启动子区在经典型卡波西肉瘤(经典型KS)与艾滋相关型卡波西肉瘤(AIDS-KS)中甲基化状态的差异.方法:采用甲基化特异性PCR (MSP)检测经典型KS与AIDS-KS的甲基化状态,分析检测结果.结果:37例经典型KS中14例发生甲基化,甲基化阳性率为38％；18例AIDS-KS中5例发生甲基化,甲基化阳性率为28％.两者甲基化状态的差异无统计学意义(P＞0.05).结论:经典型KS与AIDS-KS中HHV-8ORF50启动子的甲基化状态无明显的差异,HHV-8ORF50启动子的甲基化状态可能与HIV感染无关.
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人乳腺癌细胞系RUNX3基因启动子甲基化状态研究
目的:探讨人乳腺癌细胞系中抑癌基因RUNX3启动子甲基化状态,并分析其与RUNX3基因表达的相关性.方法:运用甲基化特异性PCR(MSP)检测5种乳腺癌细胞系和一种人类正常乳腺细胞系中RUNX3启动子甲基化状态,运用RT-PCR和Western 印迹检测这些细胞系中RUNX3基因mRNA和蛋白的表达.结果:在6种细胞系中,有两种(T47D、MCF7)呈高甲基化状态,并且这两种细胞系的RUNX3 mRNA和蛋白表达阴性.SKBR3中没有检测出RUNX3启动子区的甲基化,但RUNX3 mRNA和蛋白表达阴性.结论:乳腺癌细胞系中RUNX3基因由于启动子区甲基化而失活,但尚有其它失活机制存在,需进一步研究探讨.
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胃癌患者外周血与胃癌组织中BRCA1基因甲基化的关系及其意义
目的:检测胃癌患者外周血及胃癌组织中BRCA1基因启动子甲基化状态,并探讨两者的关系及意义.方法:采用甲基化特异性PCR(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)技术检测37例胃癌患者外周血及胃癌组织中BRCA1基因启动子甲基化状态.结果:胃癌患者外周血和胃癌组织中BRCA1基因启动子甲基化率分别为40.5％ (15/37)和48.6％(18/37),二者相关系数r=0.848(P =0.0004).结论:胃癌患者外周血与胃癌组织中BRCA1基因启动子存在高比例的甲基化,而且两者甲基化率有良好的一致性.胃癌患者外周血BRCA1基因启动子甲基化的检测具有简便、快捷、可靠的特点,外周血BRCA1基因启动子甲基化有可能成为治疗胃癌的靶点.
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MSP法检测胃癌组织中RASSF1A基因启动子区甲基化改变
目的:探讨抑癌基因RASSF1A启动子区CpG岛甲基化与胃癌及临床病理特征的关系.方法:采用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)法检测60例胃癌组织及相应癌旁组织和30例对照组织中RASSF1A基因启动子区甲基化状态.结果:胃癌组织中RASSF1A基因启动子区CpG岛甲基化率为65.0%(39/60),显著高于癌旁组织6.7%(4/60),及对照组0%(0/30)(P＜0.01).胃癌组织中不同年龄、性别、分化程度及淋巴结转移与否的RASSF1A基因甲基化率的差异均无统计学意义.结论:胃癌中RASSF1A基因启动子区的高甲基化提示其与胃癌的发生密切相关,MSP法对RASSF1A基因启动子区甲基化的检测有望成为胃癌早期监测的重要方法.
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宫颈癌中p16基因启动子异常甲基化的检测
目的:探讨宫颈癌组织及外周血浆中p16基因启动子异常甲基化的状况及其在宫颈癌诊断中的价值.方法:用甲基化特异性PCR技术对宫颈癌组织,正常宫颈组织及相对应血浆中p16基因进行甲基化的检测.结果:45例宫颈癌组织中p16基因异常甲基化率为33.3％(15/45),相对应血浆中p16基因甲基化的检出率为20％(9/45),而正常对照组织未检出甲基化.血浆中甲基化的改变与宫颈癌组织甲基化状态显著相关(P＜0.05).p16基因甲基化发生率与年龄、病理分级、临床分期之间无统计学相关性(P＞0.05).结论:p16基因CpG岛甲基化是宫颈癌发生的高频事件,其甲基化检测在宫颈癌早期诊断中有一定的应用价值.
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胃癌组织中Caveolin-1基因外显子2甲基化状态检测
目的:应用甲基化特异性PCR(MSP)技术检测胃癌组织中Caveolin-1基因外显子2启动子区域5'端CpG岛甲基化状况,探讨Caveolin-1基因甲基化在胃癌发生发展中的作-用.方法:收集30例胃癌组织和6例距肿瘤5 cm以上的癌旁正常胃组织,运用标准蛋白酶K消化、酚-氯仿抽提法提取组织中基因组DNA,采用CpGenome DNA Modification Kit对DNA进行修饰后以甲基化特异性引物及非甲基化引物进行PCR,通过琼脂糖凝胶电泳及产物测序判定结果.结果:6例癌旁正常胃组织Caveolin-1基因外显子2启动子区域5'端CpG岛均为甲基化阴性.30例胃癌组织中有27例甲基化阳性,甲基化率为90%(27/30).其中16例胃癌组织(53.3%)仅有甲基化引物扩增出目的条带,表现为完全甲基化;11例胃癌组织(36.7%)甲基化与非甲基化引物均扩增出目的条带,表现为部分甲基化.统计结果显示胃癌组织中Caveolin-1基因外显子2启动子区域甲基化率显著高于癌旁正常胃组织.结论:胃癌组织中存在Caveolin-1基因外显子2启动子区域高甲基化,且可能参与胃癌的早期过程.
关键词： 胃肿瘤 caveolin-1基因 甲基化 甲基化特异性PCR -
CpG岛的生物信息学预测及甲基化特异性PCR分析技术的建立
1 材料和方法1.1 材料 CpGenome Universal Methylated DNA和CpGenome Universal Unmethylated DNA购自Chemicon公司.亚硫酸氢钠和氢醌购自Sigma公司.Wizard DNA Clean-Up systems购自 Promega公司.
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膀胱癌中BLU基因启动子高甲基化和转录水平
目的 研究膀胱癌中BLU基因启动子甲基化状态、转录水平及其意义.方法 采用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR, MSP)技术和逆转录PCR(RT-PCR)技术分别检测54例膀胱癌患者癌组织及45例相应癌周正常组织、3例非肿瘤患者的正常膀胱组织中BLU基因启动子甲基化状态和转录水平.结果 ①31.5%(17/54) 膀胱癌组织中BLU基因高甲基化,相应癌周正常组织和3例正常膀胱组织均未发现该基因高甲基化改变;②甲基化状态与膀胱癌临床病理参数无明显相关性;③在45例膀胱癌组织中,BLU表达缺失率为42.2%(19/45);④BLU mRNA表达缺失与肿瘤临床分期和病理分级相关(P＜0.05);⑤在启动子高甲基化的膀胱癌中,92.3%(12/13)BLU mRNA表达异常下调或缺失.结论 膀胱癌中频繁发生BLU基因的高甲基化和mRNA表达缺失,其高甲基化可能是基因转录失活的重要原因.
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肺癌患者MPDZ基因异常甲基化的研究
目的:探讨肺癌组织以及相应的外周血浆和痰液中MPDZ基因异常甲基化的情况,以及其在肺癌诊断中的作用.方法:采用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测49例肺癌组织、20例癌旁正常组织以及相应的外周血浆和痰液中MPDZ基因甲基化发生情况.结果:49例肺癌组织中MPDZ基因甲基化发生率为67％(33/49),癌旁正常组织中的MPDZ基因甲基化发生率为0(0/20)(P=0.00).MPDZ基因甲基化检出率与临床分期相关(P=0.039),但与患者的年龄、性别、是否吸烟、肿瘤的分化程度以及肿瘤的病理分类无显著相关(P＞0.05).33例癌组织MPDZ基因发生了甲基化的肺癌患者相应血浆的DNA标本中有25例发生了甲基化,甲基化检出率为76％(25/33);痰液标本中有18例发生了甲基化,甲基化检出率为55％(18/33).16例癌组织MPDZ基因未甲基化的肺癌患者其对应的血浆和痰液标本未检出该基因甲基化.提示痰液和血浆标本中MPDZ基因甲基化能较好地反映肿瘤组织中该基因的甲基化状况.结论:MPDZ基因在肺癌患者的癌组织中、血浆中及痰液中均有较高比例甲基化检出率,提示MPDZ基因甲基化可能在肺癌的诊断中具有一定的价值.
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新疆哈萨克族食管癌survivin启动子区CpG岛甲基化状态及其临床意义
目的:检测消化道肿瘤早期相关基因survivin mRNA在哈萨克族食管癌组织中的表达及其启动子区CpG岛甲基化状态,并进一步探究survivin启动子甲基化是否参与了食管癌的发生.方法:提取哈萨克族食管癌患者癌组织及远端无癌组织RNA,RT-PCR检测组织中survivi nmRNA的表达水平,甲基化特异性PCR (methylation specific PCR,MSP)检测survivin启动子区CpG岛的甲基化状态.结果:在20对食管癌组织标本中,癌组织中survivin mRNA阳性表达率(95％)明显高于远端无癌组织(65％)(P＜0.05).癌组织及远端无癌组织中survivin基因启动子区CpG岛多为杂合型甲基化,且两种组织间甲基化状态无明显差异(P＞0.05).结论:survivin mRNA表达水平的增高在哈萨克族食管癌的发生、发展过程中起到了一定的作用,但其表达与启动子区CpG岛甲基化无关,提示甲基化并未直接调控该基因的表达并促进哈萨克族食管癌的发生发展.
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新疆哈萨克族和汉族食管癌患者FHIT基因甲基化及其与预后的关系
目的:探讨和比较新疆哈萨克族和汉族食管癌患者FHIT基因甲基化状态及其与食管癌发生及预后之间的关系.方法:采用甲基化特异性PCR法(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)测定哈、汉两民族共71例食管癌及癌旁组织标本FHIT基因启动子区甲基化状况,建立Cox回归模型分析临床病理指标及FHIT基因甲基化水平等因素与预后的关系.结果:36例哈族食管癌患者癌组织和癌旁组织的FHI7基因启动子甲基化率分别为58.3％和19.4％,35例汉族食管癌患者癌组织和癌旁组织的FHIT因启动子甲基化率分别为51.4％和14.3％,两民族癌组织FHIT基因的甲基化率均明显高于癌旁组织(P＜0.01)；哈、汉民族食管癌患者癌组织之间、癌旁组织之间FHIT因启动子甲基化率无显著性差异(P＞0.05).预后因素分析表明肿瘤浸润程度、TNM分期、淋巴结转移区域数是影响哈、汉民族食管癌预后的独立危险因素,女性性别是保护因素.结论:FHIT基因启动子区甲基化状态与新疆哈族、汉族食管癌的发生有密切的关系,但可能与食管癌预后无关.
