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Sombati癫(癎)细胞模型电压依赖性钾电流的变化
目的:采用全细胞膜片钳记录技术研究Sombati癫(癎)细胞模型电压依赖性K+电流的变化.方法:取SD新生乳鼠双侧海马,体外原代培养海马神经元,培养至第9天的部分海马神经元经无镁液处理3 h制备癫(癎)细胞模型,采用全细胞膜片钳技术分别记录正常组(未经无镁液处理的海马神经元)和致(癎)组(经无镁液处理3 h后更换为正常维持培养液的海马神经元)海马神经元的电压依赖性外向K+电流.结果:致(癎)组外向K+电流比正常组增大,峰值电流由(596.62±79.23)pA增至(978.68±53.23)pA,两组间比较差异有统计学意义(P=0.000).与正常组相比,致(癎)组的I-V曲线明显左移,I-V 曲线形态无显著改变.结论:Sombati 癫(癎)细胞模型中,电压依赖性外向K+电流显著增加可能是癫(癎)细胞模型(癎)性放电后为了保持细胞稳态的代偿性保护作用.
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阿米诺利敏感的小鼠生精细胞离子电流
目的 研究记录小鼠生精细胞上表皮钠通道电流.方法 应用机械分离获得小鼠单个生精细胞,采用全细胞膜片钳技术记录上皮钠离子通道电流.结果 当钳制电位在-50 mV、指令电压-100～+40 mV、步阶电压10 mV,测试脉冲为200 ms时,可记录到一快速激活并且不失活的电流.细胞外液中加入1 μmol/L的阿米诺利能显著性抑制该电流,并呈现出两类不同的作用(抑制率分别为58.49±9.82%,31.44±5.69%).结论 电流特性和阿米诺利敏感性特征表明,生精细胞上所记录到的电流是上皮钠通道电流.
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大鼠海马神经元急性分离和膜片钳方法的研究
应用酶消化及机械分离法分离出生10～15 d的大鼠海马神经元,从形态学及电生理学方面鉴定细胞活性.结果表明,该法可获得形态和生理特性良好的单个海马神经元.用0.5 μmol/L的TTX阻断Na+通道后,分别记录到典型的全细胞电压依赖性钾离子通道电流以及延迟整流钾通道电流.证实该方法适用于海马神经元膜片钳研究,对深入探讨药物和毒物对海马离子通道及信号转导机制的作用有重要价值.
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AMPA受体参与的出生后大鼠海马发育早期的电生理学特点
本研究旨在探讨α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体参与的出生后大鼠海马发育早期的电生理学特点.选择出生后0.5月龄、1月龄、2月龄和3月龄Wistar大鼠共计48只(每组各12只).应用全细胞膜片钳技术及MED64平面微电极阵列技术检测海马CA1区锥体神经元的被动膜特性及AMPA受体参与的自发兴奋性突触后电流(spontaneous exctitatory postsynaptic current,sEPSC)和场兴奋性突触后电位(field excitatory postsynaptic potential,fEPSP).结果显示,海马CA1区锥体神经元在出生后0.5～3月龄期间,在被动膜特性方面表现为:膜电容与静息膜电位无显著性变化;膜输入电阻与时间常数均显著下降.在主动膜特性方面,呈现出阶段性变化:0.5～1月龄期间,sEPSC的反应表现为:振幅显著升高,频率明显增大,上升时间及下降时间显著增加;1～3月龄期间,sEPSC的反应特性与0.5～1月龄期间相反.此外,0.5～3月龄期间,海马CA1区诱发出的fEPSP范围明显扩大,而幅值显著减小;各月龄海马CA1区诱发出的fEPSP幅值均可被AMPA受体竞争性拮抗剂6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(CNQX)明显降低.以上结果提示,在出生后大鼠海马发育早期过程中,AMPA受体作为调节突触传递和突触联系的主要兴奋性受体,可以促进海马的发育及功能成熟.
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心房与心室肌细胞兴奋性不同的离子机理研究
心肌细胞兴奋性是维持正常的心脏活动的一个重要生理因素.本研究旨在使用全细胞膜片技术探讨豚鼠心房和心室肌细胞不同兴奋性的离子机理.结果显示,心室肌细胞兴奋性比心房肌细胞低.虽然豚鼠心室肌细胞的电压门控快Na+电流(INa)密度较低,但与其兴奋性较低并不相关,因为其在阀电位附近的可用度比率比心房肌细胞高.经典内向整流钾电流(IK1)在心室肌细胞比在心房肌细胞更大,这可能是心室肌细胞兴奋性较低的部分原因.此外,去极化引起的有内向整流特性的瞬时外向钾电流(Itoir)在心室肌细胞较大,并可能是其兴奋性较低的主要原因.在心室肌细胞,5 μmol/L Ba2+显著抑制Itoir,增强细胞兴奋性,并使INa激活的阈电位更负,其作用独立于对INa的影响.本研究结果证明,除经典的Ik1外,Itoir在豚鼠心房肌和心室肌细胞的兴奋性差异形成和心肌兴奋性维持中起着主要作用.然而,Itoir增加是否会通过降低兴奋性以保护心脏,还需要进一步研究.
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蝎毒耐热蛋白对大鼠急性分离海马神经元兴奋性的影响
应用全细胞膜片钳记录技术在电流钳模式下观察经持续高温等特殊处理后分离纯化的30～50 kDa蝎毒耐热蛋白(scorpion venom heat resistant protein,SVHRP)(国家发明专利,专利号ZL01 106166.92)对急性分离大鼠海马神经元兴奋性的影响.结果发现SVHRP可致海马神经元兴奋性降低.神经元经1×10-2 μg/mL SVHRP处理后动作电位发放模式改变,发放频率减少.在52个受检细胞中,有45个细胞产生位相放电(占86.54%);7个细胞产生重复放电(占13.46%).在产生位相放电的45个细胞中,有8个细胞在SVHRP处理后仍可以诱发出位相放电(占17.78%);37个细胞在SVHRP处理后无法诱导出位相放电(占82.22%),SVHRP处理后动作电位的产生与处理前相比,有显著差异(P＜0.01,n=45);在产生重复放电的7个细胞中,在1×10-2μg/mL SVHRP作用后均不能再次诱发出重复放电,而是产生一个动作电位或不再产生动作电位,药物处理前产生的动作电位个数为14.57±1.00,SVHRP处理后产生动作电位的个数为0.57±0.20,二者之间有显著性差异(P＜0.01,n=7).1×10-4 μg/mLSVHRP处理后,诱发动作电位产生的基强度由(75.10±8.99)pA增加到(119.85±12.73)pA(P＜0.01,n=8);阈电位由(-41.17±2.15)mV升至(-32.40±1.48)mV(P＜0.01,n=8);动作电位峰值由(68.49±2.33)mV下降至(54.71±0.81)mV(P＜0.01,n=8).由于神经元超兴奋性被认为是癫痫发作的基本机制之一,因此上述结果表明SVHRP有可能通过降低海马神经元兴奋性发挥其抗癫痫作用,这为蝎毒药物的进一步开发提供理论依据.
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硫酸镁对大鼠海马CA1区神经元钠电流的抑制作用
利用全细胞膜片钳技术研究了硫酸镁 (MgSO4) 对大鼠海马CA1区神经元钠电流的影响.结果表明, MgSO4可浓度依赖和电压依赖地抑制钠电流, 半数抑制浓度为4.05 mmol/L.这一抑制作用与刺激频率无关.结果还表明, 4 mmol/L MgSO4不影响钠电流的失活过程, 却使半数激活电压由-55.8±6.8 mV变为 -34.2±6.2 mV (n=8, P<0.01), 而激活曲线的斜率因子不变.结果提示, MgSO4抑制大鼠海马CA1区神经元的钠电流可能是其抗缺血缺氧造成的中枢神经系统损伤的机制之一.
关键词： 海马CA1区神经元 全细胞膜片钳技术 硫酸镁 (MgSO4) 钠电流 -
甲硫-脑啡肽对大鼠DRG分离神经元激活内向电流的抑制
本研究探讨了甲硫-脑啡肽(met-Enk)对ATP-激活电流(IATP)的调制作用.实验在大鼠新鲜分离背根神经节(DRG)神经元上进行.应用全细胞膜片钳技术所记录的IATP为内向电流.在被检测的DRG神经元中,90.0%(45/50)的细胞对ATP有反应.在45个对ATP敏感的细胞中:对大部分细胞(29/45)施加met-Enk(10-9～10-5mol/L)也引起一内向电流;少部分细胞(9/45)为外向电流;其余的细胞(7/45)未引起可检测的膜反应.预加met-Enk后IATP明显地被抑制,此种抑制作用为剂量依赖性的.在预加10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L met-Enk后,IATP的抑制分别为:13.2±5.4%(n=5)、39.2±8.6%(n=8)、54.1±8.6%(n=8)、43.3±7.9%(n=7);43.1±7.9%(n=7)(mean± SKM).阿片肽拮抗剂纳洛酮能翻转此种抑制效应.IATP的量-效关系表明,预加met-Enk后曲线明显压低,在浓度为10-3 mol/L时IATP下降约25%,而Kd值几乎不变.应用二次钳压技术胞内透析H-9(PKA抑制剂)能取消此种抑制作用.上述结果提示:met-Enk对IATP的抑制效应为非竞争性抑制作用,可能是由于阿片受体激活后,经相应的胞内信号转导途径使ATP受体磷酸化所致.
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原代培养海马神经元的多种电压门控钙通道电流成分
本文旨在探讨原代培养的海马神经元上电压门控钙通道电流(voltage-gated calcium channel currents,VGCCs)的记录和分离.本文建立了一种稳定、高效的记录海马神经元VGCCs的海马神经元培养体系.此法获得的成熟的海马神经元克服了急性分离的海马神经元的缺陷,细胞破膜后20 min电流不发生明显衰减.应用全细胞膜片钳技术证实,在本实验条件下,不损伤神经细胞膜的电学特性,可成功地记录到海马神经元的多种VGCCs成分(如L,N,P/Q,T等).
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丹皮酚对家兔心室肌细胞时外向钾电流的抑制作用
目的 探讨丹皮酚(Paeonol,Pae)对家兔心室肌细胞瞬时外向钾电流(transient outward potassium current,Ito)及其动力学的影响.方法 用酶解法分离单个兔心室肌细胞.全细胞膜片钳技术记录Pae对兔心室肌细胞Ito的影响前后变化.结果 Pae 100 μg/ml作用心肌细胞5 min,可使Ito明显减小.指令电位为+50 mV时,可使Ito从(41.45±5.89)pA/pF减少到(8.97±2.78)pA/pF,两者之间有显著性差异(n=6,P＜0.01).冲洗15 min后,Ito部分恢复至(39.74±0.82)pA/pF(n=6,P＜0.01,与给药后比较),接近给药前的峰值,表明该药对Ito的抑制作用是可逆的.在50～400 μg/ml范围内,Pae对Ito的抑制作用表现为浓度依赖性,IC50的平均值为101.55 μg/ml.Pae 100 μg/ml使各膜电位水平下Ito减小,I-V曲线下移.Pae不改变Ito稳态激活动力学曲线.但使失活动力学曲线显著左移,即向超极化方向移动,50% Ito失活曲线点分别为(-45.3±3.5)mV和(-81.19±2.9)mV(n=8,P＜0.01),与对照组相比,差异有显著性.同时可使Ito失活后恢复时间延长,用药前后50% Ito恢复时间分别为(20.1±2.5)ms和(45.1±2.2)ms(n=8,P＜0.01),与对照组相比,有显著性差异.结论 Pae对家兔心室肌细胞Ito具有显著的抑制作用,这可能是Pae发挥抗心律失常作用的另一电生理基础.
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地昔帕明对大鼠背根神经节神经元钠电流的影响
目的:研究地昔帕明(desipramine,DMI)对大鼠背根神经节神经元电压依赖性钠电流的影响.方法:分离单个大鼠背根神经节,应用全细胞膜片钳技术观察地昔帕明对内向钠电流(INa)的影响.结果:地昔帕明浓度依赖性地抑制INa,即分别加入10,50,100μmol/L的DMI可使钠电流的抑制率达(5.56±0.62)%,(54.67±13.39)%和(86.63±16.08)%,并且,50μmol/L的DMI可使INa稳态失活曲线左移,V1/2分别由对照组的-(43.71±0.79)mV降低至-(47.91±1.14)mV,k值无明显变化.结论:DMI浓度依赖性地抑制背根神经节神经元Na+通道,并改变通道的失活,这可能是其影响痛觉传导通路,产生镇痛作用的机制之一.
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BmKNJX10对大鼠背根神经节神经元外向钾电流的影响
目的:作者运用柱层析和高效液相色谱的方法,从东亚钳蝎毒素中分离纯化获得一个长链组分BmKNJX10,质谱报告结果显示其相对分子质量为7214.本文研究其对神经元钾电流的影响. 方法:采用全细胞膜片钳技术,观察了BmKNJX10对大鼠背根神经节(DRG)神经元外向钾电流(IK)的作用. 结果:BmKNJX10以浓度依赖的方式对IK有明显的促进作用.在刺激电压为+20 mV 时,10 mg/L、30 mg/L、50 mg/L和70 mg/L BmKNJX10对IK的增大率分别为(17.1±3.9)%(n=4)、(25.1±6.2)%(n=4)、(45.3±2.8)%(n=5)和(70.2±11.1)%(n=3). 结论:BmKNJX10具有开放钾通道的功能,可能属于一个新的钾通道毒素多肽.
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17-甲氧基-7-羟基-苯骈呋喃查耳酮对小鼠心室肌细胞膜钠电流的影响
目的 观察17-甲氧基-7-羟基-苯并呋喃查耳酮 (YLSC) 对小鼠心室肌细胞膜上钠电流的影响.方法 采用Langendorff逆行主动脉灌流法急性分离昆明小鼠心室肌细胞, 全细胞膜片钳技术记录心室肌细胞膜钠电流 (INa) 在灌流YLSC前后的变化情况.结果 YLSC灌流可使INa的电流幅值减小, I-V曲线上移, 但I-V曲线形状、大激活电位和反转电位基本不变.INa的电流密度在膜电位-40 m V达到大峰值, 给药前的峰电流密度值为 (-22.31±2.20) p A/p F, 400μmol·L-1 YLSC灌流给药后为 (-10.64±0.97) p A/p F, 与给药前比较有显著差异 (n=5, P<0.05), 对钠电流的抑制率为 (48.9±3.6) ％;400μmol·L-1 YLSC给药前后的半数激活电压分别为 (-49.51±1.22) m V和 (-48.13±2.34) m V, 斜率因子分别为2.43±0.36和3.39±0.64, 给药前后无显著差异 (n=5) .YLSC使失活曲线左移, 给药前后半数失活电压分别为 (-73.29±1.09) m V和 (-76.79±1.62) m V, 斜率因子分别为-12.13±2.15和-11.45±1.91, 给药前后有显著差异 (n=5, P<0.05) .结论 YLSC能通过降低钠通道失活电压, 促进钠通道失活而抑制钠通道电流.
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应用膜片钳技术研究豆腐果苷对hERG钾通道电生理功能的影响
目的:探讨豆腐果苷对hERG钾离子电流的影响及潜在心脏毒性.方法:使用稳定转染hERG基因的CHO细胞,通过全细胞膜片钳技术检测不同浓度豆腐果苷对hERG通道电流活动的作用.结果:豆腐果苷对hERG钾通道的IC50约为47 μmol/L,比临床常规剂量下人体内峰浓度高1 000倍以上.结论:临床常用剂量下,豆腐果苷发生与hERG通道抑制作用相关的心脏安全性问题的可能性非常小.
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过氧化氢对大鼠心室肌细胞L-型钙通道电流的影响
目的:研究过氧化氢(H2O2)对单个大鼠心室肌细胞L-型钙通道电流(Ica,L)的影响.方法:用急性酶解法获得单个大鼠心室肌细胞;用标准的全细胞膜片钳技术记录钙通道电流,观察5 mmol·L-1 H2O2引起单个大鼠心室肌细胞Ica,L改变.结果:在5 mmol·L-1 H2O2作用下,大鼠心室肌细胞Ica,L峰值电流密度从 4.89±0.52 pA/pF增加至 9.80±0.65 pA/pF(P<0.05,n=10),电流-电压曲线下移,但激活电位、峰电位和翻转电位无明显改变;H2O2对Ica,L激活时间常数-电压曲线无明显影响,但可使其灭活时间常数-电压曲线明显向上移;H2O2对Ica,L稳态激活曲线无明显改变,但可使其稳态失活曲线明显左移,V0.5从 (-26.85±5.3) mV 左移至(-37.20±4.5) mV (P<0.05,n=5).结论:H2O2可以增加大鼠心肌细胞Ica,L,且使其失活明显减慢.
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大豆苷元对大鼠心室肌细胞INa的影响
目的 观察大豆苷元对大鼠心室肌细胞钠通道电流(INa)的影响,探讨其抗心律失常的机制.方法 MTT比色法检测大豆苷元对心室肌细胞活力的影响;单酶解法分离大鼠单个心室肌细胞;全细胞膜片钳技术观察、记录、分析大豆苷元给药前后大鼠心室肌细胞INa及其动力学特征的变化.结果 MTT实验表明,大豆苷元的IC5030～100μmol·L-1,由此选定用于后续实验的药物浓度为0.3～10μmol·L-1.膜片钳实验结果表明,当给予终浓度为0.3、1、3、10μmol·L-1大豆苷元后,药物对INa呈浓度依赖性抑制现象;大豆苷元0.3μmol·L-1时对INa作用的时间过程也具有一定影响,随时间推移缓慢减小;1、3、10μmol·L-1大豆苷元使I-U曲线上移;在此同等条件下,激活曲线向去极化方向移动、稳态失活曲线向超极化方向移动和失活后恢复曲线的τ值延长.结论 大豆苷元对大鼠心室肌Na+通道有明显的抑制作用,这可能是其抗心律失常的机制之一.
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钠-钙交换体单克隆抗体NCX-2D2对异丙肾上腺素诱发成年大鼠心律失常的抑制作用
目的 观察钠-钙交换体单克隆抗体NCX-2D2 对异丙肾上腺素( isoproterenol,ISO)诱发大鼠心律失常的影响,并探讨其电生理机制.方法 利用ISO建立大鼠离体和在体心律失常模型,观察NCX-2D2抗体对心律失常的影响;通过全细胞膜片钳技术,观察NCX-2D2抗体对大鼠心室肌细胞INa/Ca、ICa-L和DADs的作用.结果 10 mg·L-12D2抗体可明显抑制ISO诱发大鼠离体心脏心律失常的发生( P <0.01);80 μg·kg-12D2抗体可明显抑制ISO诱发麻醉大鼠心律失常的发生(P<0.01);5 mg·L-12D2 抗体可部分抑制ISO对大鼠心室肌细胞INa/Ca的增大作用(P<0.01),以及对ICa-L的增大效应(P<0.01),并可有效抑制ISO诱发大鼠心室肌细胞DADs的发生(P<0.05).结论 钠-钙交换体单克隆抗体NCX-2D2可明显抑制异丙肾上腺素诱发的大鼠室性心律失常,其抗心律失常机制与抑制心肌细胞钠-钙交换体和L-型钙通道,从而减轻钙超载和抑制延迟后除极有关.
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花生四烯酸乙醇胺对大鼠心肌细胞L型钙电流的影响
目的 研究anandamide(花生四烯酸乙醇胺)对单个大鼠心肌细胞L型钙电流(ICa-L)的影响.方法 应用全细胞膜片钳技术记录ICa-L,并观察anandamide对该电流的作用.结果 (1)anandamide 浓度依赖性地减小ICa-L,其IC50 值为(1.3±0.3)μmol·L-1.(2)1 μmol·L-1 anandamide可明显使稳态失活曲线左移,失活中点电压(V1/2)由(-34.4±0.2)mV变为(-42.2±0.6)mV,K值由(5.7±0.2)变为(6.4±0.4),表明anandamide改变了钙通道失活的电压依赖性.anandamide 1 μmol·L-1对稳态激活曲线无明显影响.结论 anandamide可使稳态失活曲线左移而剂量依赖性地减小ICa-L.
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松果体素抑制大鼠海马神经元甘氨酸激活的全细胞电流
目的 研究松果体素对培养的大鼠海马神经元甘氨酸激活的全细胞电流(Igly)的调控.方法 在培养的大鼠海马神经元上,采用全细胞膜片钳技术,研究松果体素对甘氨酸激活的全细胞电流的调控.结果 松果体素以浓度依赖的方式可逆地抑制Igly,并且这种抑制作用是非竞争性的,松果体素的抑制作用没有特异的亚基选择性.结论 松果体素能以非竞争的方式直接抑制甘氨酸受体介导的电流,这种抑制作用可能对海马区域神经网络的兴奋性产生影响.
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苯佐卡因对大鼠背根神经节神经元河豚毒素不敏感型钠离子通道的影响
目的 研究苯佐卡因(BZC)对大鼠背根神经节(DRG)神经元河豚毒素不敏感型(TTX-r)钠电流的影响,探讨其镇痛作用的机制.方法 酶解法分离新生大鼠单个DRG神经元,应用全细胞膜片钳技术记录不同浓度BZC对TTX-r钠电流的影响.结果 BZC浓度依赖性静息阻断TTX-r钠电流,30、100和300 μmol·L-1的BZC分别使TTX-r钠电流峰值抑制率达(18.83 ± 8.51)%、(33.08 ± 9.19)%、(58.91 ± 12.02)%,并使TTX-r钠电流稳态失活曲线浓度依赖性向超极化方向移动.结论 BZC浓度依赖性阻断DRG神经元TTX-r钠离子通道并改变通道的失活,可能是其影响痛觉传导通路以及产生镇痛作用的机制之一.
