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肝细胞生长因子和类胰岛素样生长因子对心肌干细胞的诱导作用
目的：探讨肝细胞生长因子（HGF）和类胰岛素样生长因子（IGF1）在外能否诱导心肌干细胞（CSCs）发生增殖并向心肌细胞定向分化。方法组织贴块法分离培养心肌干细胞，免疫荧光技术鉴定c-kit和CD34表达，流式细胞仪分选纯化c-kit ＋细胞，CFDA SE荧光探针示踪培养检测细胞增殖特征。实验分为单纯心肌干细胞组和与心肌共培养组，分别用HGF和IGF1干预，倒置显微镜观察细胞不同时期数量与形态的变化，活细胞工作站观察CFDA SE示踪剂荧光强弱，采集图像，进行统计学分析。免疫荧光技术检测Nkx2．5、心肌肌钙蛋白T（ cTnT）的表达。结果单纯心肌干细胞组，生长因子刺激后心肌干细胞数量与形态均无明显变化。与心肌共培养组，细胞均发生增殖与形态变化，Nkx2．5、cTnT阳性表达，有个别心肌干细胞分化为自发搏动的心肌细胞。结论心肌干细胞与心肌细胞共培养条件下，HGF和IGF1能够促进心肌干细胞增殖，联合作用能够诱导心肌干细胞向心肌细胞分化。
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脂肪间充质干细胞CD73亚群心肌分化能力评价
目的 探讨CD73+和CD73-脂肪间充质干细胞(ADMSCs)两个亚群向心肌分化能力的差异,筛选出心肌分化优势亚群,为进一步开展细胞治疗心肌疾患提供实验参考.方法 流式细胞仪分选CD73+/CD73-ADMSCs亚群,HE染色观测其形态.体外5-氮杂胞甙(5-aza)诱导CD73 +/CD73-亚群,免疫荧光法检测心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT),Real-time PCR检测cTnT、Gata-4变化;4'6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)标记两个亚群后,移植到大鼠心肌内,免疫荧光法检测移植细胞cTnT表达.结果 CD73+ ADMSCs形态以小细胞为主呈细长形或纺锤状,CD73-细胞以宽大扁平或方形等为主.体外成心肌诱导后,CD73+ ADMSCs心肌特异性cTnT表达率为45.5％、CD73-亚群为5.75％,基因水平上CD73+亚群表达cTnT、Gata-4明显高于阴性亚群(P＜0.01).体内CD73+亚群较阴性亚群高表达cTnT.结论 CD73+ ADMSCs较CD73-ADMSCs具有更高向心肌分化的潜能,CD73+ ADMSCs可能更具有心肌治疗的前景.
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MAPK通路对胚胎干细胞向心肌细胞分化的作用
目的 研究促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)通路对胚胎干细胞诱导分化心肌细胞的影响.方法 采用10-4M维生素C诱导小鼠R1胚胎干细胞分化为心肌细胞.以未经处理ESC心肌细胞分化(ESCM)相应时间点的总RNA作对照组,20 μM细胞外信号调节激酶(ERK)特异性抑制剂PD98059和20 μM p38 MAPK特异性抑制剂SB203580孵育细胞,诱导分化后期通过计数搏动拟胚体的比率和实时定量聚合酶链式扩增反应(RT-PCR)和免疫印迹(WesternBlotting)检测心肌标志物的表达确定其作用.结果 与对照组相比,诱导分化第14天,SB203580组搏动拟胚体比率显著降低(24％ vs.56％,P=0.025);RT-PCR和Western Blotting结果表明SB203580、PD98059组均可下调心肌特异性标志物表达,SB203580组更加明显.结论 MAPK通路与心肌细胞分化有关,以p38信号通路为主.
关键词： 胚胎干细胞 心肌分化 促分裂素原活化蛋白激酶 -
体外诱导人脐血间充质干细胞未能向心肌细胞转分化
目的 选择从人脐带血中分离出的间充质干细胞(UCB1-MSCs),通过5-氮胞苷(5-aza)进行诱导,对其体外向心肌细胞转分化的能力做初步探讨. 方法培养第11代hMSCs,加入6、9、12 μmol/L的5-aza分别作用24 h和48 h,相差显微镜观察细胞形态直到3周后实验结束.以未经处理的细胞为对照组.采用RT-PCR检测心肌转录因子MEF2C、GATA4、Nkx2.5和心肌特异性基因MLC-2v、MLC-2a、Connexin 43及α-actinin的表达;免疫荧光染色检测Connexin 43和α-actinin的表达,以共聚焦显微镜成像. 结果经5-aza诱导后观察3周未见细胞的自发搏动.诱导前后的hMSC均可不同程度的表达MEF2C、Connexin 43及α-actinin.在12 μmol/L水平诱导24 h和6、9、12 μmol/L水平诱导48 h共4个组中可见MLC-2 a的表达.GATA4 、Nkx 2.5和MLC-2 v在诱导前后均未见表达.免疫荧光染色显示诱导前后hMSCs的胞浆内存在散在排列无序的α-actinin和Connexin 43荧光,而始终未见肌小节结构. 结论经5-aza诱导UCB 来源hMSCs在基因水平可以表达部分心肌特异性基因,但是在诱导后的一个月时间内未见相应的心肌特异性结构出现,此类细胞向心肌细胞转分化的能力需再证实.
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两个部位脂肪来源干细胞的心肌细胞分化潜能比较
目的 比较心包部位和腹股沟部位脂肪组织来源干细胞(ADSC)的免疫表型和分化潜能.方法 取Wistar大鼠心包组织和腹股沟脂肪,消化分离原代ADSC,分别用流式细胞技术和免疫组织化学法检测两个部位ADSC的免疫表型和心肌源性转录因子的表达,并进一步用5- 氮杂胞苷分别诱导两个部位的ADSC向心肌细胞分化,分析诱导后心脏肌钙蛋白T(cTnT)的表达.结果 两个部位的ADSC具有相同的免疫表型:均为CD29、CD44、CD90阳性和CD34、CD45阴性细胞.原代心包部位的ADSC可以检测到少量cTnT阳性细胞,并有不同程度的GATA- 4、Isl- 1、Nkx- 2.5和MEF- 2c表达;而原代腹股沟部位的ADSC除了Isl- 1呈弱阳性表达外,其他因子均为阴性表达.两个部位的ADSC经诱导均定向分化成心肌细胞,但心包部位的ADSC的心肌分化能力大于腹股沟部位的ADSC(53%与32%,P<0.01).结论 不同部位的ADSC有共同的形态和免疫表型.心包部位的ADSC在转录因子和cTnT表达方面体现出较强的心肌分化潜能.
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hHO-1联合GATA-4修饰大鼠骨髓间充质干细胞抗凋亡及向心肌分化的实验研究
目的 探讨经人血红素加氧酶1 (hHO-1)基因和GATA-4基因联合修饰的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在缺血缺氧环境中抗凋亡及体外分化为心肌细胞样细胞的能力是否优于hHO-1或GATA-4单基因修饰的BMSCs.方法 采用全骨髓贴壁法分离、培养BMSCs并进行鉴定,重组腺病毒转染BMSCs,Western blotting法确定基因表达的佳时间;以缺氧无血清条件模拟体内缺血缺氧微环境培养基因修饰的BMSCs,采用CCK-8试剂盒和台盼蓝染色法分别检测缺血缺氧培养12、24、48、72h细胞存活率,流式细胞术检测缺血缺氧培养24h细胞凋亡情况,Western blotting及细胞免疫荧光法检测特异性心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)表达情况.结果 缺血缺氧培养12、24、48、72h的hHO-1 +GATA-4组细胞生存率均高于hHO-1组(P＜0.05)和GATA-4组(P＜0.05).缺血缺氧培养24h的hHO-1 +GATA-4组细胞凋亡率低于hHO-1组(P＜0.05)和GATA-4组(P＜0.05);GATA-4组与hHO-1 +GATA-组的cTnI表达差异无统计学意义.结论 hHO-1与GATA-4联合修饰可明显增强缺血缺氧BMSCs的存活;与GATA-4单基因修饰相比,联合修饰并没有增强BMSCs向心肌细胞分化的能力.
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Wnt8a在小鼠胚胎心肌分化中的作用
目的 研究wnt8a在小鼠胚胎心肌分化中的作用.方法 实验组以二甲基亚砜(DMSO)作为诱导剂,对照组以DMSO和Frizzled-8/Fc作为诱导剂,诱导小鼠胚胎干细胞心肌细胞分化,检测分化过程中Wnt8a的表达,对比分化率.结果 两组在分化第2,3,4天Wnt8a表达,分化细胞具有自动收缩性;实验组分化率为92.22%,对照组分化率为37.78%,差异性具有统计学意义.结论 Wnt8a促进小鼠胚胎心肌分化.
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三氯乙烯对人胚胎干细胞心肌分化的影响和机制
目的:探讨三氯乙烯(TCE)对人胚胎干细胞心肌发育分化的影响.方法:以人胚胎干细胞H9体外心肌定向分化为模型,分化培养液中添加不同剂量的TGE(分别为处理组100 ppb组,1 ppm组,10 ppm组)以及DMSO(对照组).对诱导后形成的拟胚体以及不同发育阶段的细胞进行检测,通过MTT法测定细胞的生存能力,统计有自主节律跳动的拟胚体的数量;流式细胞仪计数分析细胞分化比例;荧光定量PCR检测心肌特异性基因表达;并应用基因芯片方法初步筛选检测三氯乙烯对心肌细胞钙离子通道相关的基因表达的影响.结果:TCE的三个浓度处理组均未显示细胞毒性,但高浓度组明显抑制向心肌细胞分化,能产生自主节律搏动的拟胚体比例显著降低,同时心肌特异性标记物cTnT表达随剂量的增加而显著降低.在具有自主节律性的拟胚体中,钙离子通路的相关基因表达受到影响.结论:推测TCE通过降低成熟心肌的比例,以及影响心肌细胞中钙离子通道相关基因表达来共同导致心脏发育异常.
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经典Wnt信号通路在心肌细胞分化作用的研究进展
缺血性心脏病已成为发达国家的主要死因,并有着惊人的发病率[1].急性心肌梗死后,心脏自我更新能力有限及重构导致左室功能下降[2].间充质干细胞(MSCs)在40年前被首次从骨髓中分离出来,并且成为细胞心肌成型术的主要种子细胞之一.以其独特的优势如易于分离、扩增,同种异体移植时无免疫原性以及多向分化潜能等受到普遍关注[3-5].
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P19胚胎癌细胞体外定向心肌细胞分化模型的构建
目的:如何在体外将胚胎干细胞培育转化为大量的心肌细胞并进行移植,使之成为具有成熟心肌细胞功能?实验采用不同诱导剂对P19胚胎干细胞进行诱导,拟构建体外定向心肌细胞分化模型.方法:实验于2006-09/2007-03在日本东京工业大学生体分子机能工学研究室完成.①材料:P19细胞由日本东北大学加龄医学研究所提供.钙粘素融合蛋白N-cad-Fc由本研究室合成.②实验方法:P19细胞按1×107 L-1密度接种进行悬浮培养,分别以终浓度1,5,10,50,100 nmol/L视黄酸及0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%二甲基亚砜各自诱导4 d,将形成的细胞聚集体分别接种于预铺有0.1%明胶、2.5mg/LN-cad-Fc、10mg/LN-cad-Fc基质的24孔板中培养10d.③实验评估:观察不同诱导条件及不同基质上的细胞跳动情况,免疫荧光染色检测心肌特异性蛋白Troponin T的表达,RT-PCR法检测心肌细胞标志性基因cardiac actin、gata-4的表达.结果:①P19细胞经1,5,10 nmol/L视黄酸或0.5%、0.75%、1%二甲基亚砜诱导后,均出现可自主节律跳动的细胞.P19细胞聚集体悬浮培养至20d,预铺有0.1%明胶、2.5mg/L N-cad-Fc及10mg/L N-cad-Fc基质的培养板上节律跳动细胞团的出现率分别为44.6%、71.3%和70.1%.②药物诱导后,P19细胞心肌特异性蛋白Troponin T呈阳性表达.③与传统预铺有明胶的培养板比较,在预铺有N-cad-Fc的培养板上心肌标志性基因cardiacacdn、gata-4的表达均明显升高,但10mg/LN-cad-Fc的表达量略低于2.5 mg/L N-cad-Fc.④分别在上述不同基质上单层培养的P19细胞,二甲基亚砜诱导14 d后均仍呈上皮样细胞形态,未见跳动细胞出现.RT-PCR检测无心肌标志性基因表达.结论:①使用0.5%～1%二甲基亚砜或1～10 nmol/L视黄酸可成功诱导P19细胞心肌分化,心肌特异性蛋白Troponin T的表达早于心肌跳动的出现.②作为一种基质模犁来模拟细胞间黏附,2.5 mg/L N-cad-Fc是较适宜P19细胞心肌分化的条件.③P19细胞心肌分化有赖于药物诱导和细胞成团的共同作用,细胞间黏附分子对其分化有促进作用.
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NKX2-5诱导P19细胞向心肌分化的研究
目的 探索NKX2-5在心肌分化中的作用和机制.方法 实验分转染组和未转染组,转柒组为稳定表达NKX2-5的P19细胞,未转染组为P19细胞.两组细胞悬浮培养4 d,形成聚集体后贴壁培养,于贴壁培养的4 d、8 d、12 d、16 d,免疫荧光双标和Western blot检测横纹肌α肌动蛋白(α-SA)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达;取贴壁培养16 d的细胞透射电镜观察细胞超微结构变化.结果 转染组α-SA和cTnT两种蛋白在聚集体贴壁4 d时没有表达,8 d、12 d、16 d出现表达和共表达.转染组部分细胞出现幼稚的细胞连接和肌丝样结构;未转染组没有发现两种蛋白的表达,电镜观察未发现分化的细胞.结论 稳定表达NKX2-5基因的P19细胞可向心肌分化,但不适于作为心脏发育的体外模型.
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Apelin/APJ与胚胎心肌分化
胚胎发育中心脏祖细胞迁移至生心区并分化为心肌细胞是心脏形成的基础.研究心肌分化对了解心脏发育异常以及应用干细胞治疗缺血性心脏病具有重要意义.近研究发现apelin/APJ信号通路与祖细胞的迁移及心肌分化有关.本文就apelin/APJ与胚胎心肌分化的关系做一综述.
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PM2.5染毒干扰心肌细胞分化发育的体外实验
[目的]研究PM2.5染毒对心肌细胞分化发育的影响.[方法]利用P19畸胎瘤干细胞,建立体外心肌定向分化模型,MTT法检测PM2.5染毒对P19细胞毒性,PM2.5染毒浓度为0、1、10、100 mg/L,选择未产生明显细胞毒性的10 mg/L PM2.5于P19细胞未分化时期染毒48h后启动分化.显微镜下观察形态学改变,实时荧光定量PCR检测不同分化期OCT4、ISL-1、MLC2V的表达变化(OCT4、ISL-J、MLC2V分别为干细胞全能性阶段、心肌前体期、成熟心肌期标志基因),免疫荧光及流式细胞术检测成熟心肌肌钙蛋白cTNT的表达效率.[结果]与对照组相比,PM2.5组细胞形态学发生改变;分化各阶段的标志物表达异常:OCT4在未分化时期表达降低约80％(P＜0.01),分化启动后反而增高(P＜0.05);ISL-1于心肌前体期表达降低为对照组的59％(P＜0.01);MLC2V于成熟细胞期表达降低为对照组的39％(P＜ 0.01).成熟心肌cTNT表达比例由对照组的61％下降到47％,但差异无统计学意义.[结论]心肌分化早期染毒PM2.5,可阻碍干细胞向心肌细胞的分化过程.
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外源表达Nkx2-5基因诱导P19细胞向心肌分化
目的:构建人Nkx2-5基因融合绿色荧光蛋白真核表达质粒pEGFP-N1-Nkx2-5,探讨外源性Nkx2-5基因诱导P19细胞向心肌分化的作用.方法:以真核表达质粒pEFSA-HA-Nkx2-5为模板,PCR扩增得到人Nkx2-5基因,将目的片段亚克隆到pEGFP-N1载体,鉴定正确.将重组质粒pEGFP-N1-Nkx2-5以脂质体法转染P19细胞,G418筛选2周,聚集4d,贴壁培养16d.以免疫细胞化学检测desmin、α-sarcomeric actin和cardiac Troponin T(cTnT)的表达.结果:将Nkx2-5基因正确插入pEGFP-N1载体,外源表达Nkx2-5基因可使P19细胞在无诱导剂、聚集条件下表达desmin、α-sarcomeric actin和cTnT蛋白.结论:成功构建真核表达质粒pEGFP-N1-Nkx2-5,外源表达Nkx2-5基因诱导P19细胞向心肌分化.
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5-氮杂胞嘧啶诱导人骨髓基质干细胞心肌分化
目的:研究5-氮杂胞嘧啶(5-aza)诱导人骨髓基质干细胞(hMSC)心肌分化过程中心肌特异转录因子和心肌特异基因的表达变化.方法:取传至第8代hMSC,以3μmol/L的5-aza孵育细胞24h,分别在诱导后3d、1周、2周和3周4个时间点提取细胞RNA,以RT-PCR方法检测细胞心肌特异转录因子Nkx2.5和心肌特异基因(connexin43、ANP等)的表达.结果:hMSC经5-aza诱导后,形成肌节样结构.RT-PCR的结果显示,5-aza可诱导心肌特异基因connexin43和ANP的表达,随诱导时间延长,connexin43和ANP的表达量逐渐增加.5-aza还能诱导hMSC表达心肌特异转录因子Nkx2.5,并持续表达至3周.结论:5-aza在体外可诱导hMSC向心肌细胞分化,5-aza可能通过诱导心肌特异转录因子的表达而启动hMSC心肌化的过程.
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多氯联苯对P19细胞向心肌分化进程的影响
目的 探讨多氯联苯对P19细胞向心肌分化进程的影响.方法 在P19细胞向心肌细胞分化的培养液中加入多氯联苯(Aroclor 1254)2.5 μmol/L,同时设立阴性对照组.显微镜下连续观察P19细胞形态的变化,并采用实时荧光定量RT-PCR技术对分化过程的第0、4、10天中GATA4及Nkx2.5基因mRNA的表达水平进行检测.结果 在分化全程(0 ～ 10天),实验组与对照组无细胞形态上的差别;而GATA4、Nkx2.5基因的表达量除在分化开始前(第0天)差异无统计学意义外,在分化中期(第4天)及末期(第10天),实验组中GATA4、Nkx2.5基因的相对表达量均显著低于对照组.结论 多氯联苯可通过对早期心脏发育相关重要基因的表达影响心肌分化进程.
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同源盒基因Nkx2-5促进5-氮胞苷诱导的单层P19细胞表达心肌标志物
目的:探讨同源盒基因Nkx2-5基因在5-氮胞苷(5-aza)诱导单层生长的P19细胞向心肌细胞分化中的作用.方法:以稳定表达Nkx2-5的P19细胞为实验组,P19细胞为对照组.两组细胞均单层培养并以5-aza(1μmol/L)诱导,倒置显微镜下观察细胞的生长状态;在诱导后4、8、12、16 d,以RT-PCR检测转录因子GATA-4、α-肌球蛋白重链(α-MHC)和心房利钠多肽(ANP)基因的表达.结果:对照组经5-aza诱导后ANP没有表达;GATA-4在8、12、16 d有表达;α-MHC在12、16 d有表达.实验组5-aza诱导后,GATA-4在诱导4、8、12、16 d有表达;α-MHC和ANP都是在5-aza诱导后的8、12和16 d表达.两组结果比较显示实验组GATA-4和α-MHC基因的表达时间提前;两组除α-MHC在12 d的表达无差异外,其他取材时间点实验组两个基因的表达量与对照组相比均增高,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01).结论:Nkx2-5促进5-aza诱导的单层生长的P19细胞向心肌分化.
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二甲亚砜诱导人骨髓基质干细胞心肌分化中的基因表达
目的研究二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)诱导人骨髓基质细胞(human bone marrow stromalcells,hBMSC)心肌分化过程中心肌特异转录因子和心肌基因的表达变化.方法取第8代hBMSC,以DMSO诱导24 h.在诱导后21天,通过免疫荧光染色检测干细胞标志CD90和肌性标志Desmin表达变化,并在诱导后1、2、3周提取RNA.以RT-PCR方法检测细胞心肌特异转录因子(Nkx2.5和GATA4)和特异基因(connexin43、ANP等)的表达变化.结果经DMSO诱导后,MSC体积变大,细胞排列趋于一致,连接紧密,并逐渐形成肌节样结构,CD90阳性细胞减少,Demin阳性细胞增加.在DMSO诱导hBMSC后1周,开始可检测到细胞发生转录水平变化(Nkx2.5、GATA-4表达和connexin43、ANP表达),并均可持续至诱导后3周;前三者的表达量有随诱导后时间延长而增加的趋势.结论DMSO在体外可诱导hBMSC向心肌前体细胞分化,DMSO可能通过诱导心肌特异转录因子的表达而启动hBMSC心肌化的过程.
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骨髓间充质干细胞的克隆培养及其向心肌细胞的诱导分化
目的建立骨髓间充质干细胞(MMSC)的单细胞克隆,筛选具有心肌特异性分化潜能的c-kit+MMSC克隆,进行体外心肌诱导分化研究.方法取成年雄性SD大鼠骨髓细胞,进行原代培养和单克隆培养.通过c-kit免疫细胞化学标记和RT-PCR检测,筛选出向心肌特异性分化的MMSC克隆.然后用5-氮杂胞苷诱导分化,RT-PCR检测诱导前后心肌特异性基因表达的变化.结果骨髓中含有多种MMSC克隆,以不同形态和大小的成纤维细胞样克隆数目多.较大的成纤维细胞样克隆和扁平多角形细胞克隆均表达c-kit.用5-氮杂胞苷诱导后,表达Nkx2.5的c-kit+MMSC克隆的细胞形态和排列方式发生变化.诱导后2周,细胞变为短柱状,且平行排列;第3周,相邻细胞间形成明显的细胞连接;第4周,由多个细胞相互连接形成肌管样结构,并可观察到肌管的自发性搏动.心室肌特异性肌球蛋白轻链(MLC-2v)mRNA从第3周开始明显表达.结论骨髓中含有多种干细胞克隆.筛选具有心肌特异性分化潜能的MMSC克隆并构建心肌干细胞库,将为临床干细胞移植治疗心肌梗死提供理想的干细胞来源.
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通过患者来源iPS细胞建立阵挛性癫痫伴破碎红纤维综合症心肌细胞疾病模型
目的 对阵挛性癫痫伴破碎红纤维综合症(MERRF)患者来源的诱导多能干细胞(iPSC)进行体外分化,获得携带MERRF疾病相关线粒体突变的心肌细胞,评估其在建立MERRF的心肌细胞疾病模型中的价值.方法 采用定向分化的方法体外将患者来源的iPSC及对照H9分化为心肌细胞,免疫荧光染色和RT-PCR对两组心肌细胞进行鉴定,并对心肌细胞的搏动频率进行统计,比较两组心肌细胞的功能.结果 患者来源的iPSC及H9均成功分化为心肌细胞;在心肌分化的第10、13、15、16天,MERRF-iCMs平均搏动频率分别为13次/分、24次/分、15次/分、18次/分,H9-iCMs平均搏动频率分别为80次/分、96次/分、120次/分、120次/分,差异均具有统计学意义(P均＜0.05).结论 通过患者来源iPSC向心肌细胞的分化及功能评估,获得了携带MERRF疾病相关线粒体突变的心肌细胞模型.
关键词： 阵挛性癫痫伴破碎红纤维综合症 诱导多能干细胞 线粒体遗传病 心肌分化
