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联合利用嵌套缺失和酚筛选法构建和鉴定目的基因的缺失突变体
目的 介绍一种快捷、无突变的目的基因缺失体构建和鉴定方法.方法 用Mlu I 和 Sac I酶将GCLC/pGL3在GCLC基因与pGL3连接处切开,形成以GCLC端为3'凹端而pGL3载体端为3'凸端的线型载体.利用外切核酸酶Ⅲ从GCLC基因端(3'凹端)单向逐一切除GCLC基因上的核苷酸,并在不同的时间终止其反应以获得一系列的GCLC基因缺失体.将GCLC基因缺失体与pGL3载体自身环化构建成GCLC基因序列缺失体的pGL3报道载体.后用酚抽提和凝胶电泳法粗略挑选出不同长度的GCLC/pGL3缺失突变体.结果 利用嵌套缺失法构建出各种长度的GCLC基因的缺失突变体,且不存在基因突变的现象.利用酚筛选法快速鉴定出29种不同长度的缺失突变体.结论 联合利用嵌套缺失和酚筛选法可以高保真而快速地构建和鉴定目的基因的缺失突变体.
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白介素-15突变体在大肠杆菌中的克隆表达及鉴定
目的:构建两株IL-15末端缺失突变体以研究其N、C端对其功能的影响.方法:以pBV220为载体,在大肠杆菌中进行表达.表达产物以包涵体形式存在,经过SDS-PAGE纯化,复性,以CTLL-2增殖实验检测野生型及突变体的生物活性.结果:N端缺失突变体失去了增殖活性,而C端缺失突变体保持了对CTLL-2的生长刺激活性.
关键词： 白细胞介素类 缺失突变体 克隆 表达 CTLL-2增殖实验 -
急性肺血栓栓塞的溶栓治疗
急性肺血栓栓塞(APE)的溶栓治疗始于30年前.长期以来,人们一直在探求能够提高疗效、降低出血风险的药物和治疗方法.随着优质溶栓药物的开发及溶栓方案、给药途径的改进,APE的溶栓治疗已取得了长足的进展.现有溶栓剂主要有链激酶(SK)、尿激酶(UK)、重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA),均为纤溶酶原激活剂,是具有启动-放大纤溶系统的有效药物.它通过激活纤溶酶原而溶解血栓,使其降解成可溶性肽类.目前新一代溶栓剂如:重组组织型纤溶酶原激活剂t-PA缺失突变体(r-PA)、TNK-组织型纤溶酶原激活剂(TNK-t-PA)、重组葡萄球菌激酶(r-Sak)等溶栓剂还在不断涌现.
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日本七鳃鳗Lj-RGD3缺失突变体Lj-113人工合成序列的基因克隆与蛋白表达
目的 获得突变体Lj-113的基因重组蛋白,为其与野生型活性比较打下物质基础.方法 对日本七鳃鳗RGD缺失突变体Lj-113进行基因全序列人工合成,并以Nde I与Hind III为酶切位点构建于pET23b载体上,获得阳性基因重组质粒pET23b-Lj113.CaCl2法将重组质粒转化入大肠杆菌BL21表达菌中,对其进行终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达,并对表达蛋白进行组氨酸亲和层析纯化蛋白.结果 成功获得七鳃鳗RGD缺失突变体的基因重组蛋白的可溶性表达.结论 人工合成基因序列可通过分子克隆方法获得其蛋白的表达.
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全基因组分析乙型肝炎病毒缺失变异及其与干扰素疗效的关系
干扰素是治疗慢性乙型肝炎(CHB)的主要药物之一,但其有效率仅为20%～40%[1-3].研究显示,HBV一些特定位点的变异具有抵抗干扰素的作用,这些位点的变异虽然可以抵抗干扰素的作用,但不足以说明干扰素抵抗的机制.目前大多数研究是以HBV的部分片段或特定位点作为研究对象,并不能反映患者体内病毒的真实状态,具有一定的局限性.为进一步了解HBV的生物学特性对干扰素疗效的影响,本研究采用全基因克隆的方法[4]从CHB患者血清中扩增HBV全基因组DNA,分离检测HBV基因组缺失突变体,分析HBV变异与干扰素疗效之间的关系.
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KCNE1胞外N段功能的研究
目的：研究电压依赖性钾离子通道-IKs通道的调节亚基KCNE1胞外肽段(氨基端肽段，简称N段)的功能，探究胞外N段在KCNE1调控IKs通道中的作用。方法：通过分子生物学技术制备KCNE1的N段缺失突变体；利用Western Blot方法了解突变体的蛋白表达情况；以细胞免疫染色方法观察突变体的亚细胞定位情况；以全细胞膜片钳记录技术检测突变体(与KCNQ1共表达)的通道电流特征。结果：成功构建KCNE1胞外N段缺失的突变体KCNE1-ΔN，突变体体外表达正常；与野生型相比：KCNE1-ΔN在细胞内的分布出现蛋白集聚现象；通道的电流密度减小，激活电压相比较出现了明显的左移，即通道的激活速率变快。结论：KCNE1的N段对其蛋白表达无明显影响，但对蛋白的转运起重要作用；N段参与了KCNE1对通道电流大小的调节，以及对通道激活特征的调控。
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基孔肯雅病毒包膜蛋白E2的全基因合成及原核表达
目的 通过对全长基孔肯雅病毒包膜蛋白E2(CHIKV-E2,1~404 aa)及其跨膜疏水区(351~378 aa)缺失突变体E2(1~350 aa)进行原核表达,分析跨膜疏水区对E2蛋白在大肠杆菌中表达的影响.方法 利用ExPasy预测软件对E2蛋白跨膜疏水区进行预测分析,根据GenBank数据库中CHIKV-E2氨基酸序列获得其对应的基因序列.结合重叠延伸PCR(OE-PCR) 原理设计用于全基因合成的核酸引物对CHIKV-E2全长基因(404 aa)进行体外合成,构建全长E2蛋白及其缺失突变体原核表达质粒,将序列正确的两种重组质粒分别转至E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测重组质粒的表达情况.结果 OE-PCR法成功合成了大小为1 212 bp的编码CHIKV-E2(1~404 aa)蛋白的全长基因,构建了全长E2蛋白及其缺失突变体重组表达质粒 pET21b-E2(1~404)和pET21b-E2(1~350),经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE结果显示缺失突变体pET21b-E2(1~350)融合蛋白表达量较pET21b-E2(1~404)有明显提高.结论 E2蛋白跨膜疏水区(351~378 aa)对该蛋白的原核表达具有重要影响,缺失该疏水区的突变体在大肠杆菌中表达量比全长E2蛋白表达量明显提高.
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伪狂犬病毒VP22蛋白C-端系列缺失突变体的构建及亚细胞定位分析
以绿荧光蛋白(GFP)为标记,构建了一系列伪狂犬病毒VP22蛋白的C-端缺失突变体与GFP融合表达的真核表达质粒,脂质体介导转染Hela细胞,通过荧光显微镜观察分析各个缺失突变体的亚细胞定位,发现伪狂犬病毒VP22蛋白与核定位有关的结构域在第60个到第90个氨基酸残基之间,第111个到第159个氨基酸残基有可能与形成细胞核内的颗粒有关,与微管蛋白结合有关的结构域可能在第187到第241个氨基酸残基之间.上述研究结果为进一步深入研究伪狂犬病毒VP22蛋白的结构与功能奠定了基础.
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IPS-1基因缺失突变体真核表达载体的构建与鉴定
目的 构建干扰素β启动刺激因子1(IPS-1)的300～444位氨基酸缺失突变体重组质粒,并初步鉴定.方法 通过重叠延伸PCR法获得缺失300～444位氨基酸的突变体△IPS-1,构建缺失突变体重组质粒pEF-BOS-FLAG-△IPS-1,并经XbaⅠ及claⅠ双酶切及测序鉴定.结果 双酶切缺失突变体重组质粒pEF-BOS-FLAG-△IPS-1后,琼脂糖凝胶电泳可见1 250 bp附近的片段.DNA测序结果做BLAST分析,显示重组质粒含有1 266 bp的目的 基因片段,读码框正确,无碱基错配和移码突变.结论 成功构建了缺失300～444位氨基酸的IPS-1基因重组真核表达载体pEF-BOS-FLAG-△IPS-1.
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含ITIM的新型膜蛋白分子LLIR及其跨膜缺失突变体的克隆与功能研究
树突状细胞(dendritic cells, DCs)是重要的抗原提呈细胞,其部分功能需要通过膜受体来介导,研究DCs表面的受体是了解抗原提呈功能机制的途径之一.研究得较早的与DCs功能相关的膜表面分子有DEC-205和MMR,这两个分子都是Ⅰ型跨膜蛋白,胞外含有数个C型lectin结构域,对于DCs摄取抗原的功能很重要.另外,也有带lectin结构域的Ⅱ型跨膜分子被发现,如CLEC-1、CLEC-2、Dectin-1、Dectin-2,这些分子的胞外段都含有一个CRD,除了在DCs表达以外,也在髓系细胞和单核细胞中表达.
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人纤溶酶原kringle区缺失突变体的毕赤酵母表达、产物纯化及鉴定
目的 研究人纤溶酶原 kringle 区缺失突变体(PLGΔK)的毕赤酵母(Pichia pastoris)表达、产物纯化及理化性质鉴定.方法 采用7.5 L发酵罐对工程菌 PLGΔK/GS115 进行高密度培养、甲醇诱导表达,培液经离心、超滤、离子交换层析、凝胶滤过、透析后冷冻干燥.等电聚焦电泳、HPLC、质谱分别检测 PLGΔK 等电点、纯度和分子量;纤维蛋白平板、肽底物S-2403 分别测定PLGΔK 激活后的纤维蛋白和酰胺水解活性.结果 7.5 L高密度发酵可获得约为400 mg/L培液的表达量,经三步纯化后制备的PLGΔK纯度大于96%.理化分析显示PLGΔK的等电点为7.5～7.8,分子量:27.787 kD,比活性:23.6 U/mg.结论 初步建立了PLGΔK的酵母高密度发酵及纯化工艺,所制备半成品活性与血浆提取的PLG相近,具备放大生产和应用的潜力.
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人纤溶酶原K5突变体在大肠杆菌中的优化表达
[目的]提高K5突变体(mK5)在原核系统的单位表达量.[方法]调整可能影响表达的参数:抗生素浓度、pH、A600值、IPTG终浓度、诱导时间、诱导温度,同时固定其它参数.通过电泳分析,获得mK5在原核系统pET22b-BL21的优表达条件:组氨酸结合柱亲和层析、纯化获得mK5蛋白,SDS-PAGE和Western-blot方法鉴定mK5蛋白;MTT法分析mK5对人视网膜毛细血管内皮细胞(HRCEC)增殖的影响.[结果]优化后的表达条件为:适细菌培养温度为37℃,佳抗生素浓度为50 μg/mL羧苄青霉素,适pH值为7.0,在A600为0.9～1.0时加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG为佳诱导条件,37℃诱导10 h为佳诱导时间;优化条件后inK5纯化蛋白得率为21 mg/L,产量较优化前(15 mg/L)提高近30%;inK5特异性地抑制HRCEC的增殖,IC50=40 nmol/L.[结论]本研究确定了mK5蛋白诱导表达的适参数,并获得具有生物活性的高纯度、高表达量的重组蛋白.为工业化大规模发酵生产提供了基本参数.
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结缔组织生长因子全长及其缺失突变体重组腺病毒的构建和鉴定
目的:结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor,CTGF)含有4个不同功能结构域,构建表达带有3×Flag标签的全长基因及5个缺失突变体的重组腺病毒,以研究CTGF各结构域的功能和作用机制.方法:通过聚合酶链反应(Polymerasechain reaction,PCR)等克隆方法制备目标质粒DNA,然后通过腺病毒穿梭载体与骨架载体的重组、包装构建全长CTGF和缺失突变体重组腺病毒.用anti-Flag抗体作为一抗做Western blot检测目的基因表达情况.结果:通过腺病毒基因组DNA PCR确认有CTGF全长和缺失突变体的存在;Western blot法验证了CTGF全长和缺失突变体的表达.结论:成功构建了6个表达CTGF全长和缺失突变体的重组腺病毒,为进一步研究CTGF的结构域功能奠定了基础.
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Trim22缺失突变体真核表达载体的构建
目的:构建Trim22缺失突变体的真核表达载体,为进一步研究Trim22与HIV-1衣壳蛋白的相互作用奠定基础.方法:以野生型Trim22真核表达质粒为模板,用PCR方法扩增出5种类型Trim22缺失突变体的基因片段,克隆到5-Flag-pcDNA3.1(+)真核表达载体,通过酶切、菌落PCR及测序进行鉴定.将该载体转染HEK293T细胞,用蛋白印迹及免疫沉淀检测Trim22缺失突变体的蛋白表达.结果:通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建5种人Trim22缺失突变体的表达载体,载体均可以在HEK293T细胞巾表达.结论:成功构建5种人Trim22缺失突变体的真核表达载体,为探寻Trim22与HIV-1衣壳蛋白相互作用的关键结构域奠定了基础.
