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黑色素瘤抗原基因3在K562细胞内质网应激反应性凋亡中的表达及意义
本研究旨在探讨黑色素瘤抗原基因-3(melanoma antigen gene-3,MAGE-3)在内质网应激反应性凋亡中的表达及意义.应用Ca2+荧光指示剂Fura-2/AM通过荧光分光光度计测定白血病细胞系K562及其多药耐药细胞株K562/A02经thapsigargin作用前后细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)变化;Western blot检测GRP78蛋白表达变化;荧光显微镜观察细胞凋亡形态变化;TUNEL法检测细胞凋亡率;RT-PCR检测MAGE-3基因mRNA水平表达变化.结果显示:①毒胡萝卜素(thapsigargin)诱导K562和K562/A02细胞[Ca2+]i出现不同程度的升高并呈一定的浓度依赖性,同时诱导GRP78蛋白表达增加以及K562和K562/A02细胞典型的凋亡改变,细胞凋亡率亦呈一定的浓度依赖性;在静息状态下K562/A02细胞[Ca2+]i较K562细胞明显增高;②毒胡萝卜素诱导K562和K562/A02细胞凋亡过程中,MAGE-3 mRNA表达明显下调;此外,与K562细胞比较,K562/A02细胞MAGE-3 mRNA表达明显上调.结论:①毒胡萝卜素在一定浓度范围内可诱导K562及其多药耐药细胞株K562/A02发生内质网应激反应性凋亡,并可能与MAGE-3表达下调有关或MAGE-3基因可能参与此凋亡途径的调控;②MAGE-3可能具有抗凋亡活性,K562/A02细胞多药耐药性可能与细胞[Ca2+]i增高和MAGE-3表达上调有关.
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毒胡萝卜素诱导K562细胞凋亡及其机制的实验研究
本研究旨在探讨毒胡萝卜素对K562细胞的凋亡诱导作用及其可能机制.采用荧光显微镜观察凋亡细胞的形态变化,annexinV-FITC/PI双染法FCM检测凋亡率的变化,Ca2+荧光指示剂Fura-2/AM法荧光分光光度计测定细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)的改变,Rh123单染法FCM检测线粒体△ψm的变化,Western blot检测caspase-3,-7,-9,-12、细胞色素C和GRP78蛋白的改变.结果显示:4 μmol/L毒胡萝卜素作用K562细胞48小时后,荧光显微镜观察到细胞呈典型的凋亡形态变化,早期凋亡细胞核染色质呈固缩状、圆珠状或斑块状;晚期凋亡细胞核染色质呈固缩状或斑块状.1、2、4、8 μmog/L毒胡萝卜素作用K562细胞24和48小时后细胞凋亡率分别为7.51%、11.65%、23.22%、30.56%和12.85%、20.27%、31.51%、44.16%,在一定范围内呈剂量和时间依赖性,与对照组比较,均有统计学意义(P＜0.05).毒胡萝卜素诱导K562细胞[Ca2+]i升高以及线粒体△ψm下降,并均呈一定的浓度依赖性,与对照组比较,均有统计学意义(P＜0.05).Westem b1ot检测显示,毒胡萝卜素诱导K562细胞caspase-3,-7,-9,-12剪切活化、细胞色素C释放、GRP78表达上调.结论:毒胡萝卜素可诱导K562细胞发生内质网应激反应性凋亡,内质网是细胞内诱导凋亡的一个重要新场所;caspase-3,-7,-9,-12剪切和活化、线粒体△ψm破坏和细胞色素C释放是毒胡萝卜素诱导K562细胞凋亡的重要机制之一,线粒体参与内质网应激反应性凋亡途径并发挥重要作用.
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黄芪多糖对毒胡萝卜素诱导大鼠心肌细胞损伤的影响
目的：探讨黄芪多糖对毒胡萝卜素诱导大鼠心肌细胞损伤的保护作用。方法将原代培养的乳鼠心肌细胞随机分为：对照组、毒胡萝卜素组、毒胡萝卜素加黄芪多糖组。应用0.01μmol/ L、0.1μmol/ L、1μmol/ L 毒胡萝卜素分别处理24 h、48 h、72 h；另用黄芪多糖10μg/ ml、50μg/ ml 处理，MTT 法观察存活率，LDH 法观察心肌细胞损伤程度。结果①应用0.01μmol/ L 毒胡萝卜素处理细胞24 h 时，与对照组相比，存活率、LDH 值变化不明显，无统计学差异（ P ﹥0.05）。当毒胡萝卜素为0.1μmol/ L，与对照组相比，处理48 h 心肌细胞存活率有显著降低，心肌细胞损伤率有显著升高，差异具有统计学意义（ P ﹤0.05）；毒胡萝卜素处理72 h 效果较明显（ P ﹤0.05）；当毒胡萝卜素浓度为1μmol/ L，处理24 h 时细胞存活率即有明显降低，细胞损伤率即有明显升高，差异具有统计学意义（ P ﹤0.05）。②与毒胡萝卜素组相比，10μg/ ml 黄芪多糖对毒胡萝卜素诱导的心肌细胞损伤仅有轻微的保护作用，差异无统计学意义（ P ﹥0.05）；而给予较大剂量的黄芪多糖50μg/ ml 可以显著改善心肌细胞存活率，减少 LDH 生成（ P ﹤0.05）。结论毒胡萝卜素诱导了心肌细胞损伤；而黄芪多糖可以显著抑制毒胡萝卜素诱导的心肌细胞损伤，并且呈现实验剂量范围内的浓度依赖性，其可能为黄芪多糖治疗心血管疾病提供新靶点。
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黄芪多糖对毒胡萝卜素诱导大鼠心肌细胞内质网应激的影响
目的：探讨黄芪多糖（APS）对毒胡萝卜素（Tg）作用下大鼠心肌细胞损伤以及内质网应激相关分子GRP78和 CHOP 的影响。方法原代培养 SD 大鼠乳鼠心肌细胞随机分为对照组、Tg 组和 Tg + APS 组。对照组：单纯培养基不给予任何药物处理；Tg 组：培养液中加 Tg；Tg + APS 组：培养液中加 Tg 和 APS；APS 组：培养基中仅加入 APS。MTT 法检测心肌细胞存活率，实时定量 PCR 法检测 GRP78和 CHOP 表达水平。结果与对照组比较，Tg 处理48 h 心肌细胞存活率降低，损伤较明显；与 Tg 组比较，APS 处理增加心肌细胞存活率，减少心肌细胞损伤。与对照组比较，Tg组 GRP78和 CHOP 表达水平显著升高；与 Tg 组比较，Tg + APS 组 GRP78和 CHOP 表达水平显著下调。结论黄芪多糖能够抑制 Tg 诱导的心肌细胞损伤，其机制可能与拮抗 GRP78和 CHOP 的表达、减轻内质网应激有关。
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毒胡萝卜素诱导内质网应激对小鼠调节性T细胞免疫功能的影响
目的 探讨内质网应激(ERS)特异性诱导剂毒胡萝卜素(TG)体外刺激对小鼠调节性T细胞(Treg)免疫功能及ERS相关信号通路的影响.方法 采用免疫磁珠分离法分选BALB/c小鼠脾脏Treg,流式细胞术检测其分选纯度.采用流式细胞术检测Treg叉头翼状螺旋转录因子(Foxp3)及细胞毒性T细胞相关抗原4(CTLA-4)表达的时间及剂量效应关系.Western blotting检测细胞ERS信号通路相关分子葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、真核细胞转录起始因子2α(eIF2α)、磷酸化eIF2α(p-eIF2α)、转录激活因子4(ATF4)表达/活化水平.将Treg单独或与效应T细胞(Teff)共培养,采用流式细胞术检测Teff的增殖活性,ELISA法检测Treg白细胞介素(IL)-10和转化生长因子(TGF)-β生成以及共培养上清中IL-2、IL-4、干扰素(IFN)-γ水平.结果 磁珠分选Treg的纯度为91.0％.依据Treg Foxp3及CTLA-4表达的时效-量效关系,选定TG 0.1μmol/L和12h为实验刺激浓度和时间.0.1μmol/L TG刺激12h后,Treg中ERS信号通路相关分子GRP78、磷酸化eIF2α、ATF4等表达/活化水平明显上调,差异均有统计学意义(P＜0.05).与对照组相比,TG刺激组Treg IL-10和TGF-β分泌量明显增加,其对Teff增殖活性抑制能力明显增强,与Teff共培养上清中IL-4/IFN-γ比值明显升高,IL-2水平明显下降,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 TG能够有效地活化Treg中ERS相关信号通路,进而显著增强Treg介导的免疫抑制反应.
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毒胡萝卜素对转化生长因子β1刺激的小鼠肺成纤维细胞凋亡的影响
目的 研究毒胡萝卜素对转化生长因子β1(TGF-β1)刺激的小鼠肺成纤维细胞周期、细胞凋亡及半胱氨酸特异性蛋白酶-12(Caspase-12)蛋白表达的影响.方法 液氮冻存的小鼠肺成纤维细胞株(L929),经复苏传代培养,同步化后分为3组:对照组、模型组和实验组,对照组的L929细胞只加入RPMI-1640培养基,模型组为L929 +5 ng·mL-1 TGF-β1,实验组为L929 +5ng·mL-TGF-β1诱导24 h+4μmol·L-1毒胡萝卜素干预24h.用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡情况,以免疫组织细胞化学方法检测Caspase-12蛋白表达.结果 细胞周期:各组间的G1期、S期、G2期变化差异均有统计学意义(均P＜0.05).对照组、模型组和实验组的G1期细胞比例分别为(58.72±8.35)％,(52.13±7.61)％,(73.02±9.32)％,这3组的S期比例分别为(29.50±4.24)％,(40.54±6.31)％,(21.66±4.17)％,这3组的G2期比例分别为(11.75±0.96)％,(7.62±3.22)％,(6.09±2.11)％,组间比较差异均有统计学意义(均P ＜0.05);但G2期实验组和模型组比较差异无统计学意义(P＞0.05);对照组、模型组、实验组的凋亡率分别为6.73％,5.03％,21.53％,caspase-12蛋白表达分别为3356.45±205.74,2645.56±168.36,5424.76±241.79,这2项指标组间比较差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 毒胡萝卜素可促进肺成纤维细胞凋亡,增加caspase-12蛋白表达.
关键词： 肺成纤维细胞 毒胡萝卜素 细胞周期 凋亡 半胱氨酸特异性蛋白酶-12 -
INS-1-3细胞内质网应激伴随 MODY基因通路表达的变化
目的：研究INS-1-3细胞（大鼠胰岛素高分泌细胞亚系）经毒胡萝卜素和衣霉素处理后造成内质网应激的基因表达谱变化。方法以正常培养的INS-1-3细胞为对照组，通过毒胡萝卜素（ TG组，0.1μmol／L，16 h）和衣霉素（ TM组，2.5μg／ml，16 h）建立内质网应激模型，收集样本进行数字基因表达谱分析，筛选差异表达基因并进行差异基因表达模式聚类分析，基因本体论（ GO）功能和pathway富集分析，并通过定量PCR对部分差异表达基因进行验证。结果 TG组和TM组分别与对照组比较，筛选出的差异基因数目分别为57个（其中上调基因45个，下调基因12个）和135个（其中上调基因99个，下调基因36个）。 GO功能显著性富集分析显示，细胞组分主要富集在内质网区域。pathway富集分析显示，共同显著富集的途径包括内质网应激、抗原的加工与提呈、蛋白运输和青少年发病的成人型糖尿病（MODY）通路。结论内质网应激的情况下，MODY信号通路相关转录因子表达发生变化可能与胰岛β细胞功能发生改变有关。
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毒胡萝卜素诱导A549细胞凋亡的实验研究
目的:探讨内质网应激诱导剂毒胡萝卜素(thapsigargin TG)对体外培养人肺泡Ⅱ型细胞来源的A549细胞生长及凋亡的影响.方法:体外培养A549细胞,经不同浓度TG(1μM、5μM、10μM)干预24小时,MTT检测细胞存活率、Hochest/PI染色观察细胞凋亡形态学、Wersten-blot检测活化caspase-3水平.结果:与对照组比较,经TG作用24小时后,活化caspase-3表达显著增加,细胞存活率下降,凋亡率增加,均呈浓度依赖性,P<0.005.结论:毒胡萝卜素能抑制A549细胞生长,诱导细胞凋亡.
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睫状神经营养因子对毒胡萝卜素所致大鼠海马神经元[Ca2+]i升高的抑制作用
目的:观察睫状神经营养因子(CNTF)对内质网钙泵特异性抑制剂毒胡萝卜素(thapsigargin,Tg)引起海马神经元内胞质游离Ca2+浓度([Ca2+]i)升高的抑制作用.方法:出生24 h以内SD大鼠海马神经元原代培养10～14 d备用,以活细胞内荧光探针Frua2/AM 实时检测[Ca2+]i.实验分3组:A组(n=20),EGTA(3 mmol/L);B组(n=40),EGTA(3 mmol/L)+ Tg(10 μmol/L);C组(n=12),EGTA(3 mmol/L)+Tg(10 μmol/L)+CNTF(500 U/μl).结果:用足量EGTA螯合细胞外Ca2+后,测得[Ca2+]i≤(30.73±7.25) nmol/L;加入EGTA+Tg后,[Ca2+]i显著升高([Ca2+]i≥[91.55±12.24] nmol/L);加入EGTA+Tg+CNTF后,升高的[Ca2+]i明显降低([Ca2+]i≤[26.09±7.16] nmol/L,P<0.01).结论:CNTF可明显减弱Tg的钙库质膜钙泵抑制作用,使胞质[Ca2+]i降低.提示CNTF通过增加胞内钙库对细胞内游离Ca2+的吸收作用来降低海马神经元的Ca2+负荷.
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毒胡萝卜素诱导大鼠皮层神经元内质网应激及丹红注射液的干预作用
目的:探讨毒胡萝卜素诱导大鼠皮层神经元内质网应激凋亡的机制及丹红注射液的干预作用.方法:体外培养SD乳鼠皮层神经元,免疫组织化学、免疫荧光染色鉴定神经元纯度.流式细胞术Annexin V、PI双标检测凋亡率及活性caspase-3、caspase-8、caspase-7、caspase-9表达,Western bloting免疫印迹分析caspase-12、GRP78、Bcl-2、细胞色素c蛋白表达,Fura-2/AM法荧光分光光度计检测细胞内钙浓度([Ca2+]i).结果:SD乳鼠皮层神经元可纯化体外培养.2 μmol/L 毒胡萝卜素作用神经元24、48 h 细胞凋亡率分别是 17.88%、21.38%,丹红治疗组分别是 6.30%、6.11%,两组比较差异有统计学意义(P<0.05).毒胡萝卜素诱导神经元GRP78表达上调,剪切活化caspase-3、caspase-8、caspase-9、caspase-12,使细胞色素c表达增加,Bcl-2表达减少.丹红注射液促进细胞Bcl-2表达,抑制细胞色素c释放,减少活化的caspase-3、caspase-8、caspase-9含量,稳定游离钙浓度.结论:毒胡萝卜素诱导神经元内质网应激反应性凋亡,丹红注射液能抑制体外培养神经元内质网应激所致凋亡.
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毒胡萝卜素对人胚肺成纤维细胞凋亡影响及部分机制的初步探讨
目的 研究内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)标识物葡萄糖调节蛋白(glucose regulated protein,GRP)和CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer binding protein homologous protein,CHOP)在人胚肺成纤维细胞凋亡过程中的表达变化,初步探讨毒胡萝卜素对人胚肺成纤维细胞凋亡的作用及部分机制.方法 体外用毒胡萝卜素(TG)诱导人胚肺成纤维细胞(MRC-5)后,采用流式细胞仪检测细胞的凋亡变化,RT-PCR检测细胞中GRP78、CHOP mRNA的表达变化,Western blot检测GRP、CHOP及Caspase-3蛋白的表达情况.结果 与对照组比较,经TG作用24 h后,细胞凋亡率增加,并呈浓度依赖性,差异具有统计学意义(P<0.05).TG组在24 h的GRP、CHOP表达均高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01);同时不同刺激组中Caspase-3的表达高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.01).结论 毒胡萝卜素可诱导人胚肺成纤维细胞发生凋亡,该凋亡可能与ERS有关.
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库容性Ca2+内流介导大鼠远端结肠平滑肌收缩
目的探讨库容性Ca2+内流( capacitative Ca2+entry,CCE)是否参与大鼠远端结肠平滑肌兴奋-收缩偶联过程.方法利用器官离体装置、张力换能器、Powerlab 4/25T数据采集分析系统测定远端结肠平滑肌的张力.结果毒胡萝卜素(thapsigargin,TG,10 nmol·L-1～1 μmol·L-1)诱导结肠平滑肌条产生持续的张力性收缩,不同浓度TG所致的同步收缩反应张力不同.在无钙Krebs液(包含1 mmol·L-1 EDTA)中使用TG将肌条培养35 min后,再加入Ca2+ 2.5 mmol·L-1,比未使用TG处理的肌条产生的收缩张力明显提高(99%±28% vs 70%±8%).且TG耗竭胞内钙库后再复钙所致的收缩效应,不受L型钙通道阻断剂verapamil影响,但可被SOC通道阻断剂La3+减弱.结论 TG耗竭胞内钙库后再复钙诱导的大鼠远端结肠平滑肌收缩反应由CCE介导,提示CCE是提供大鼠远端结肠平滑肌收缩的激活信号Ca2+的来源之一,参与完成结肠平滑肌兴奋-收缩偶联过程.
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毒胡萝卜素对ReNcell CX 人神经干细胞存活、增殖和凋亡的影响
目的 观察毒胡萝卜素对ReNcell CX人神经干细胞存活、增殖和凋亡的影响.方法 将ReNcell CX 人神经干细胞分为两组,实验组分别加入10、20、50、100 nM毒胡萝卜素,干预6h；对照组不加任何药物.采用分光光度计法测量两组乳酸脱氢酶(LDH)水平,免疫荧光显微镜下观测细胞增殖情况及Caspase-3水平.结果 实验组LDH、Caspase-3水平明显高于对照组,细胞增殖率明显低于对照组,且均呈剂量依赖性,P＜0.05或＜0.01.结论 毒胡萝卜素抑制神经干细胞存活和增殖;其机制可能为激活Caspase-3释放,促进神经干细胞凋亡.
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毒胡萝卜素诱导K562细胞凋亡及其调控机制的研究
目的 探讨毒胡萝卜素(TG)对K562细胞凋亡诱导作用及其调控机制.方法 Hoechst 33258染色荧光显微镜观察凋亡细胞形态改变;AnnexinⅤ-FITC/PI双染检测细胞凋亡率变化;RT-PCR检测bcl-2、bax、bcl-XL、XIAP、survivin基因表达变化并通过免疫组织化学技术检测其在蛋白质水平的表达.结果 TG作用后,K562细胞呈典型的凋亡细胞形态;细胞凋亡率均明显升高(P＜0.05),且在一定范围内呈浓度和时间依赖性;bax、bcl-XL、XIAP mRNA和蛋白质表达上调,survivin mRNA和蛋白质表达下调,bcl-2/bax比率降低.结论 TG可诱导K562细胞发生内质网应激反应性凋亡,其机制可能与Bax表达上调、survivin表达下调有关,bcl-XL、XIAP表达上调可能发挥拮抗凋亡的作用.
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透骨消痛胶囊对毒胡萝卜素诱导的内质网应激(PEKR信号通路)介导的大鼠体外培养关节软骨细胞凋亡的影响
目的:观察透骨消痛胶囊对毒胡萝卜素(thapsigargin,TG)诱导的内质网应激(PEKR信号通路)介导的大鼠体外培养关节软骨细胞凋亡的影响.方法:采用4周龄SD大鼠膝关节软骨建立软骨细胞体外培养体系,将培养的第3代软骨细胞分为空白组、模型组及透骨消痛胶囊高、中、低剂量组.空白组不进行干预;模型组及透骨消痛胶囊高、中、低剂量组先以2 μmol·L-1 TG干预4h,然后模型组更换为正常培养基,透骨消痛胶囊高、中、低剂量组分别更换为浓度为100 μg·mL-1、50 μg·mL-1、25 μg·mL-1的含透骨消痛胶囊培养基干预24h.干预后以MTT法检测各组软骨细胞活性、以AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞术检测各组软骨细胞凋亡率、以Western Blot法检测各组软骨细胞中激活转录因子4(activating transcription factor4,ATF4)、结合免疫球蛋白(binding immunoglobulin protein,BIP)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶12(cysteine aspartate specific protease 12,Caspase12)和Caspase3的表达量.结果:①软骨细胞活性.5组软骨细胞吸光度比较,差异有统计学意义(0.428±0.009,0.226±0.028,0.345±0.025,0.301 ±0.035,0.269±0.033,F=39.462,P=0.000).模型组吸光度低于空白组(P=0.000);透骨消痛胶囊高、中、低剂量组吸光度均高于模型组(P=0.000,P=0.000,P=0.022);透骨消痛胶囊中、低剂量组的吸光度均低于高剂量组(P=0.019,P=0.000);透骨消痛胶囊低剂量组与中剂量组比较,差异无统计学意义(P=0.085).②软骨细胞凋亡率.5组软骨细胞凋亡率比较,差异有统计学意义[(3.270±0.231)％,(30.003±4.128)％,(12.383±0.933)％,(15.387±2.961)％,(20.143±3.472)％,F=37.560,P=0.000].模型组软骨细胞凋亡率高于空白组(P=0.000);透骨消痛胶囊高、中、低剂量组软骨细胞凋亡率均低于模型组(P =0.000,P=0.000,P=0.001);透骨消痛胶囊低剂量组软骨细胞凋亡率低于高剂量组(P =0.007),透骨消痛胶囊高、低剂量组与中剂量组比较,差异均无统计学意义(P=0.216,P=0.063).③软骨细胞内质网应激(PEKR信号通路)关键蛋白含量.5组软骨细胞中ATF4含量比较,差异有统计学意义(0.257±0.028,0.435±0.033,0.315±0.023,0.276±0.038,0.351±0.043,F=13.057,P=0.001).空白组及透骨消痛胶囊高、中、低剂量组的ATF4含量均低于模型组(P =0.000,P=0.001,P=0.000,P=0.012);透骨消痛胶囊低剂量组的ATF4含量高于中剂量组(P=0.022);透骨消痛胶囊高剂量组的ATF4含量与透骨消痛胶囊中、低剂量组比较,差异均无统计学意义(P =0.188,P=0.229).5组软骨细胞中BIP含量比较,差异有统计学意义(0.227±0.026,0.432±0.022,0.294±0.035,0.263±0.020,0.339±0.032,F=25.416,P=0.000).空白组及透骨消痛胶囊高、中、低剂量组的BIP含量均低于模型组(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.002);透骨消痛胶囊低剂量组的BIP含量高于中剂量组(P=0.006);透骨消痛胶囊高剂量组的BIP含量与透骨消痛胶囊中、低剂量组比较,差异均无统计学意义(P =0.185,P =0.072).5组软骨细胞中Caspase12含量比较,差异有统计学意义(0.252±0.027,0.346±0.028,0.294±0.011,0.315±0.024,0.325±0.019,F=7.345,P=0.005).模型组的Caspase12含量高于空白组(P=0.001);透骨消痛胶囊高剂量组的Caspase12含量低于模型组(P=0.018);透骨消痛胶囊中、低剂量组的Caspase12含量与模型组比较,差异均无统计学意义(P=0.126,P=0.277);透骨消痛胶囊中、低剂量组的Caspase12含量与高剂量组比较,差异均无统计学意义(P=0.277,P=0.126);透骨消痛胶囊中、低剂量组的Caspase12含量比较,差异无统计学意义(P =0.614).5组软骨细胞中Caspase3含量比较,差异有统计学意义(0.265±0.028,0.380±0.017,0.317±0.026,0.304±0.019,0.333±0.022,F=10.507,P=0.001).模型组的Caspase3含量高于空白组(P=0.000);透骨消痛胶囊高、中、低剂量组的Caspase3含量均低于模型组(P =0.006,P=0.002,P=0.029);透骨消痛胶囊中、低剂量组的Caspase3含量与高剂量组比较,差异均无统计学意义(P=0.496,P=0.387),透骨消痛胶囊中、低剂量组的Caspase3含量比较,差异无统计学意义(P =0.138).结论:透骨消痛胶囊能抑制TG诱导的大鼠体外培养关节软骨细胞发生由内质网应激(PEKR信号通路)介导的细胞凋亡,其作用效果与药物剂量无明显关系.
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内质网功能状态对卵巢癌细胞顺铂敏感度的影响
目的 探讨内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)功能状态对卵巢癌细胞顺铂(DDP)敏感度的影响.方法 卵巢癌细胞系SKOV3接受40 μmol/L DDP处理24 h后,qRT-PCR检测ERS相关基因改变;同时内质网示踪染料(ER-tracker)观察内质网形态变化;分别用ERS稳定剂牛磺熊去氧胆酸钠(tauroursodeoxycholate,TUDCA)或ERS诱导剂毒胡萝卜素(thapsigargin,TG)预处理SKOV3,再接受DDP处理,应用流式细胞术检测细胞凋亡率;应用Western blot法检测内质网应激相关蛋白GRP78和CHOP是否表达;从临床卵巢癌患者腹水中分离与培养原代卵巢癌细胞后,采用流式细胞术比较TUDCA及TG预处理对原代卵巢癌细胞DDP敏感度影响,Western blot法检测凋亡相关蛋白PARP和Caspase-3的变化.结果 顺铂处理卵巢癌细胞系SKOV3后能够引起明显的ERS,ERS相关蛋白明显上调,内质网形态呈现颗粒化;TUDCA可以显著下调DDP引起的杀伤作用(P＜0.05),显著降低GRP78和CHOP蛋白水平;TG可以显著上调DDP引起的杀伤作用(P＜0.05)、GRP78和CHOP蛋白水平;在卵巢癌腹水原代细胞中TUDCA亦可显著抑制DDP引起的杀伤作用(P＜0.05),TG亦可显著上调DDP引起的杀伤作用(P＜0.05).结论 改变ERS的功能状态能够影响卵巢癌细胞对顺铂的敏感度.
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毒胡萝卜素诱导舌鳞癌细胞Cal-27凋亡的实验研究
目的:研究毒胡萝卜素对人舌鳞状细胞癌CAL-27细胞活力及凋亡的影响.方法:用不同浓度的毒胡萝卜素处理培养的CAL-27细胞,用噻唑蓝(methyl thiazol tetrazolium,MTT)法测定CAL-27细胞增殖情况,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色观察细胞形态学变化,通过膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(fluoresceine isothiocyanate,FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)双染标记流式细胞术检测细胞凋亡的比例,Western blot检测凋亡相关蛋白半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶3(cysteinyl as-partate-specific protease-3,Caspase-3)等活化情况.结果:毒胡萝卜素剂量依赖性抑制CAL-27细胞生长,其半数抑制浓度(50％inhibitory concentration,IC50)为15.09μmol/L.DAPI染色结果显示,细胞核变小,染色质皱缩.流式细胞仪检测结果显示,随着毒胡萝卜素剂量的增加,晚期凋亡细胞比例增加.Western blot结果显示,毒胡萝卜素浓度与Caspase-3、Caspase-9活化呈正相关,并影响其他凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/Leukemia-2,bcl-2)和B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(B cell lymphoma/leukemia-2 as-sociated X protein,bax)表达.结论:毒胡萝卜素可以显著抑制CAL-27细胞增殖,并可诱导CAL-27细胞凋亡,其作用机制与Caspase-3和Caspase-9活化有关.
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AGR2对毒胡萝卜素作用下人肺癌NCI-H460细胞增殖及凋亡的影响
目的:观察anterior gradient 2(AGR2)基因在内质网应激诱导剂毒胡萝卜素作用下对人肺癌NCI-H460细胞增殖能力及凋亡的影响.方法:通过慢病毒介导的shRNA建立AGR2基因沉默的稳定细胞系;采用集落形成实验检测AGR2在毒胡萝卜素作用下对细胞增殖能力的影响;流式细胞术分析在毒胡萝卜素作用下AGR2对细胞凋亡的影响.结果:成功构建AGR2基因沉默的稳定细胞系,Western blot结果显示AGR2的蛋白表达水平显著降低(P<0.01);在未经药物处理条件下,AGR2基因缺失对NCI-H460细胞集落形成率及凋亡无显著影响;毒胡萝卜素作用24 h后,AGR2基因沉默的细胞集落形成率远低于对照组(P<0.05);流式细胞术检测结果显示AGR2基因缺失提高了毒胡萝卜素诱导的细胞凋亡率(P<0.05).结论:AGR2基因缺失不影响正常条件下NCI-H460细胞的存活及凋亡能力,但可使毒胡萝卜素作用下细胞的增殖能力显著下降,细胞凋亡率显著提高.本研究揭示了AGR2在内质网应激状态下促进肺癌细胞增殖和减轻细胞凋亡的作用,为进一步探讨AGR2在肺癌发生发展及耐药性中的作用提供了理论依据.
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PERK／Nrf2途径参与毒胡萝卜素和衣霉素诱导的H9 c2细胞内质网应激相关细胞凋亡
目的：研究蛋白激酶R样内质网激酶（ PERK）／核因子红系相关因子2（ Nrf2）途径介导的内质网应激反应在不同浓度的毒胡萝卜素（thapsigargin， TG）和衣霉素（tunicamycin， TM）诱导的H9c2细胞凋亡中的作用。方法：在不同浓度TG和TM诱导的H9c2细胞模型上，采用Annexin V／PI双标法和TUNEL法检测细胞凋亡，CCK－8法检测细胞活力；以Western blot检测磷酸化PERK、Nrf2及活化转录因子4（ ATF4）等蛋白水平，免疫荧光法检测Nrf2的核转位。结果：与对照组比较，TG浓度为20 nmol／L、TM浓度为160μg／L处理H9c2细胞48 h时可诱导H9c2细胞凋亡，增加PERK磷酸化、Nrf2核转位和ATF4的表达；内质网应激抑制剂牛磺酸和熊去氧胆酸处理细胞后明显减轻TG和TM诱导的H9c2细胞凋亡，并下调PERK磷酸化、Nrf2核转位和ATF4的表达。结论：PERK／Nrf2途径参与TG和TM诱导的H9c2细胞内质网应激相关细胞凋亡。
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神经元高尔基体碎裂与Rab30表达变化的关系
目的 探讨HT22神经元高尔基体的碎裂与小分子GTP结合蛋白-30(Rab30)表达变化的关系及意义. 方法 将体外常规培养的小鼠海马神经元细胞系HT22分为对照组、毒胡萝卜素处理3h组和毒胡萝卜素处理5h组.采用细胞免疫荧光染色技术观察高尔基体的形态及Rab30的定位;实时荧光定量PCR技术检测Rab 30 mRNA的表达;Western blotting检测Rab30、顺式高尔基体基质蛋白-130(GM130)、高尔基体抗凋亡蛋白(GAAP)蛋白的表达. 结果 毒胡萝卜素诱导了HT22神经元高尔基体的碎裂,毒胡萝卜素的作用时间越长,高尔基体的碎裂程度越大.海马神经元中存在Rab30的表达,且主要定位于高尔基体.对照组、毒胡萝卜素处理3h组、毒胡萝卜素处理5h组细胞中Rab 30 mRNA表达均依次下调,相对表达量分别为1.00±0.00、0.73±0.05、0.53±0.01,差异有统计学意义(P＜0.05).对照组、毒胡萝卜素处理3h组、毒胡萝卜素处理5h组细胞中Rab30、GM130、GAAP蛋白表达均依次下调,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 毒胡萝卜素诱使HT22神经元高尔基体的碎裂可能与细胞内Rab30的表达量降低有关.
关键词： 高尔基体 小分子GTP结合蛋白-30 海马神经元 毒胡萝卜素
