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人化SCID小鼠对肝癌抗原的体液免疫应答
为了较真实地反应人体内免疫系统对肝癌抗原的免疫应答,我们选择了SCID小鼠作为模型.实验选择4~12周龄SCID小鼠(免疫缺陷特性稳定),用人胎肝和胸腺细胞悬液(2×107只)经腹腔注途径主用适量(500U/只)IL-2诱导,对其进行了免疫重建.
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用RT-PCR方法从人胎肝细胞内克隆VEGF基因的研究
血管内皮细胞生长因子具有维持血管正常功能,促进血管内皮细胞增殖,提高血管通透性,改变细胞外基质的等作用,与创伤组织的修复和血管生成密切相关.为此,本研究利用RT-PCR技术钓取VEGF基因的cDNA序列.具体方法是,用常规方法从胎肝组织中提取纯度高RNA后进行甲醛变性凝胶电泳;电泳结束后,在紫外灯下可看见凝胶上有28s和18s两条清晰的电泳带,其亮度之比约为2:1,这显示:获得的RNA较完整,没有降解.取适量胎肝细胞总RNA,遵循PolyATtract(mRNA Isolation System的操作要求分离纯化mRNA后,以Oligo(dT)为引物,遵循cDNASynthesis System操作步骤合成dscDNA.根据文献报道的VEGF基因序列,用Goldkey软件设计的PCR反应体系中的上下游引物,它们分别为:上游引物为:5'-CGGCTAGCGC-CTCCGAAACCA TGAACT-3',下游引物为:5'-GGTAC-CTCACCGCCTCGGCTTGTCACATCT-3',两条引物5'端下画线碱基序列分别为NheI和KpnI的酶切位点.以逆转录反应的产物dscDNA为模板,用保真性强的pfu TaqDNA聚合酶进行扩增,其中设计的上下游引物浓度各为1mM,反应参数为:94℃变性30秒,60℃退火1分钟,72℃延伸1分钟,共25循环,后于72℃继续保温5min,反应产物以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定.研究发现:经PCR反应后,获得的DNA片段长度为470bp左右,与预先实验设计相吻合.用干净的刀片切下含DNA片段的凝胶条,以PCR产物纯化试剂盒回收.纯化的DNA片段催化dATP加尾后,插入pGEM-T-Easy克隆载体中,构建的重组体转化DH-5a细菌,筛选出的阳性克隆命名为pT-VEGF.提取的重组质粒DNA,用限制性内切酶NheI和KpnI进行双酶切鉴定,酶切得到470bp大小的DNA片段.这进一步表明:VEGF基因的cDNA序列已克隆成功.pT-VEGF阳性克隆在ABI377全自动测序仪上进行序列分析,结果显示:通过RT-PCR方法克隆出来的DNA序列,与Genebank网站上的人VEGF121的cDNA序列完全一致,由Kozak序列,转录起始密码子ATG,信号序列,编码序列和终止密码子等部分组成.因此,本研究克隆出了表达VEGF的cDNA序列,为下一步构建VEGF基因的表达载体,揭示VEGF作用的分子机制和体外大规模合成VEGF细胞因子奠定基础.
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β-ME和BHA体外诱导人胎肝CD34+细胞向神经组织细胞分化研究
目的:建立巯基乙醇(β-mercaptoethanol,β-ME)和丁羟回醚(butylated hydroxyanisole,BHA)体外诱导人胎肝(fetal liver,FL)干细胞向神经细胞分化模型.方法:采用MACS试剂盒分离人胚胎肝CD34+细胞,以DMEM+10%胎牛血清培养液培养;第五代细胞待细胞融合达80%后,用DMEM+10%胎牛血清+1mmol/L β-ME+0.2 mmol/L BHA诱导24 h,PBS洗涤.然后在无血清培养基中培养5 h～5 d.用免疫细胞化学方法分析诱导前后的细胞表型特点.结果:经β-ME+BHA诱导处理后,细胞表现神经元样细胞形态,表达神经组织细胞特异蛋白,如neustin、NeuN、NF-M、TuJ-1和NSE.统计显示81%细胞NeuN染色阳性,75%细胞TuJ-1染色阳性,47%染色NF-M阳性,90%染色NSE阳性.结论:β-ME和BHA能够诱导体外培养的人FL CD34+细胞分化为具有神经细胞特异性抗原和成分的神经样细胞;胚胎肝细胞具有向神经组织分化的潜能.
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用表达性差异显示分析技术分离人胎肝组织选择性表达基因
目的:建立4月龄人胎肝组织选择性表达基因EST库,为研究胚胎肝组织特异表达基因提供有力的工具.方法:采用表达性差异显示分析(representational difference analysis, RDA)技术建立4月龄人胎肝组织选择性表达基因EST库,并测定部分克隆核苷酸序列,以竞争PCR检测代表性基因的差异表达.结果与结论:以珠蛋白家族基因为标志,所建差减cDNA文库中α-珠蛋白家族基因的表达频率较未差减cDNA文库增高7倍,同时该文库也含有多种与肝生长密切相关的基因,表明RDA技术确是研究差异表达基因的有效手段,所建EST库富集胎肝特异表达基因.部分克隆序列分析获得2种未报道序列,其中一株含有丝/苏氨酸激酶结构域,表明可望从此库中分离具有重要未知功能的新基因.
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人类ERMAP基因在不同胎龄胚胎组织中的表达
人类ERMAP(human erythroid membrane associated protein,hERMAP)基因是从人胎肝cDNA文库中筛选出来的新基因.通过Northern blot检测,提示其高度特异表达于胎肝、成人骨髓等造血组织以及K562细胞;通过荧光蛋白转染试验证实其定位于293T细胞膜和其他胞质小体上;通过对其所编码的蛋白分子的分析显示其为一跨膜蛋白分子,属免疫球蛋白超家族成员.
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人胎肝大小与胎龄的关系
目前,对胎儿肝的形态结构和组织发生报道较多[1],但对于胎肝小同发育阶段肝的左右大径和胎龄之间关系的观察还未见报道.为了进一步探讨胎肝大小与胎龄的关系,我们对不同胎龄的人胎肝外形进行观察和测量.计算了相关系数,旨在为影像学动态观察胎儿的发育[5]以及胎儿外科提供参考.
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人胎肝MSCs的分离、鉴定及其向脂肪和成骨细胞的分化
目的:分离纯化人胎肝中的间充质样干细胞(mesenchymal-like stem cells,MSCs),观察化学因子诱导其定向分化的作用,并初步鉴定其生物学特性.方法:利用二步离心法、羟乙基淀粉沉淀法及细胞差速贴壁生长特性分离纯化人胎肝MSCs;流式细胞仪检测其细胞周期和表面标志;添加常规诱导液诱导其向脂肪、成骨细胞分化并加以鉴定.结果:从人胎肝中成功分离纯化得到MSCs,P3代细胞有91.2%的细胞处于GO/G1期;表达CD29、CD44、CD105和CD166,不表达造血细胞标志CD15、CD34、CD45,不表达与GVHD相关的HLA-DR、CD80、CD86、CD40、CD40L.在经典诱导条件下,人胎肝MSCs可向脂肪及成骨细胞分化.结论:人胎肝中含有较丰富的MSCs,人胎肝MSCs具有多向分化潜能,且免疫原性弱,是组织工程和细胞治疗较为理想的种子细胞.
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HSS的研究进展
肝细胞刺激物质(HepaticStimulatorySubstance,HSS)是目前唯一能特异性地促肝细胞生长的小分子蛋白,由于其特异性地促肝细胞生长的活性[1],参与肝细胞再生的调控等,故一直是肝炎治疗、肝细胞调控的研究热点.HSS的分子量约为12～18KD,耐热,在PH2～9的环境中仍能保持其生物学活性;不溶于乙醇,对蛋白酶敏感,但核糖核酸酶不影响其活性,其二硫键、三级结构的破坏不影响其活性.HSS存在乳肝组织或再生肝组织的肝细胞胞浆中,在非肝细胞中未发现HSS.HSS是由肝细胞合成的,是肝细胞的基因表达产物,肝细胞膜上有相应的受体.目前已能从猪、牛、鼠等多种动物的乳肝组织及人胎肝组织提取出HSS,但尚不能通过基因重组的方法获得.本文对HSS的研究现状作一综述.
