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赖型钩端螺旋体及澳洲型钩端螺旋体的ompL1和flaB2抗原基因序列分析
目的 构建赖型钩端螺旋体017株及澳洲型钩端螺旋体607株外膜蛋白抗原基因ompL1和内鞭毛抗原基因flaB2的重组质粒，并分别对ompL1及flaB2基因进行序列分析。 方法 通过聚合酶链反应扩增ompL1及flaB2，并将其分别克隆到pcDNA3.1/Myc-His(+)载体T7启动子下游，构建抗原基因表达质粒，进行序列测定分析。 结果 序列分析显示赖型钩体017株与澳洲型钩体607株的ompL1相同碱基949个（98.85%），碱基变异11个（1.15%）；flaB2的相同碱基823个（96.94%），碱基变异26个（3.06%），呈很高的保守性。 结论 赖型钩体017株与澳洲型钩体607株的ompL1及flaB2分别具有高度同源性。
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应用多重聚合酶链反应检测致病性霍乱弧菌
本研究分别针对霍乱弧菌的外膜蛋白基因(ompW)和肠毒素A亚单位基因(ctxA)设计引物,建立的多重聚合酶链反应(PCR)方法,可准确地将产毒霍乱弧菌与非产毒霍乱弧菌、副溶血性弧菌、河弧菌、志贺菌、沙门菌和致病性大肠埃希菌加以鉴别.
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沙眼衣原体主要外膜蛋白基因的克隆、序列测定和真核表达
沙眼衣原体(Ct)引起的泌尿生殖道感染已成为许多国家和地区常见的性传播疾病之一.其感染特点隐匿、迁延,症状不特异,相当一部分对治疗不敏感,易复发,终出现一系列严重的并发症和后遗症.
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钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL32的克隆、表达及应用于致病性钩体免疫血清的检测
目的 选取钩端螺旋体黄疸出血群(56601株)外膜脂蛋白LipL32进行克隆、表达和纯化,以获得能应用于致病性钩体检测的纯化重组蛋白.方法 用PCR法扩增黄疸出血群(56601株)外膜脂蛋白LipL32基因,与表达载体pET-30a连接并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白,免疫印迹(WB)鉴定活性后用电洗脱法进行纯化.将纯化的重组蛋白用间接和夹心ELISA法应用于22株兔免疫血清的检测,检测结果与钩体显微镜凝集试验(MAT)进行比较.结果 重组表达质粒在大肠杆菌中表达高产量的重组蛋白,WB结果显示重组蛋白具有免疫活性.纯化的重组蛋白对15株钩体标准致病株兔免疫血清全部检出,对7株腐生性钩体株兔免疫血清全部未检出,与MAT检测结果相符.结论 黄疸出血群(56601株)外膜脂蛋白LipL32基因在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白可应用于致病性钩体血清抗体的检测,为研制致病性钩体抗体检测试剂奠定了基础.
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登革热病毒Ⅰ型外膜蛋白DⅢ区的克隆、表达及重组蛋白的应用
目的选取DVⅠ外膜蛋白DⅢ区基因进行克隆、表达和纯化,以获得能应用于血清学诊断的纯化重组蛋白.方法用RT-PCR和套式PCR法扩增登革病毒Hawaii株外膜蛋白DⅢ区基因,与表达载体pET-30 a连接,构建重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,重组蛋白经Western-blot鉴定活性后用电洗脱法进行纯化.纯化的重组蛋白用间接ELISA法和捕获ELISA法应用于血清学检测,检测结果与间接免疫荧法进行比较.结果重组表达质粒在大肠杆菌中表达高产量的重组蛋白,Western-blot结果显示重组蛋白具有免疫活性.纯化的重组蛋白对登革热病毒Ⅰ型感染者具有很高的检出率,与间接免疫荧光法检测结果基本相符.结论 DVⅠ外膜蛋白DⅢ区基因在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白可应用于血清学检测.
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3株钩端螺旋体外膜蛋白基因的序列分析
目的探讨钩端螺旋体外膜蛋白基因在钩体遗传分类中的作用.方法对我国的2株问号钩体赖型56601株和爪哇型56602株的外膜蛋白基因Ompl1进行PCR扩增,得到外膜蛋白基因并进行了全基因序列分析.测序的2株钩体与流感伤寒型RH52株进行了核苷酸序列比较和推导的氨基酸序列比较.结果赖型56601株和爪哇型56602株钩体Ompl1基因核苷酸序列与流感伤寒型RH52株的同源性分别为89%和80%,推导的外膜蛋白氨基酸序列的同源性分别为92%和88%.由此可以看出56601株、56602株与RH52株分别属于不同的血清群,这与Yasuda的遗传分类相一致.结论我国的赖型56601株和爪哇型56602株及流感伤寒型RH52株Ompl1基因的核苷酸序列存在一定差别,利用Ompl1基因可对钩端螺旋体进行分类和鉴定.
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恙虫病东方体Karp株56kDa与47kDa外膜蛋白基因的嵌合和嵌合基因在大肠杆菌的表达
将恙虫病东方体(Orientiatsutsugamushi,Ot)Karp株的56kDa和47kDa外膜蛋白基因嵌合,并使嵌合基因在大肠杆菌细胞内表达,产生双抗原融合蛋白.采用PCR方法,从Ot Karp株基因组DNA中扩增56kDa蛋白基因片段,将该片段分别与原核表达载体pQE30及47kD蛋白基因重组质粒pQE30/47连接,构建pQE30/56及pQE30/56-47重组质粒;用IPTG诱导转入大肠杆菌内的重组质粒的目的基因表达.SDS-PAGE显示,pQE30/56转化的大肠杆菌产生一约50kDa的融合蛋白和pQE30/56-47转化大肠杆菌产生一约90kDa融合蛋白(56-47融合蛋白),免疫印迹分析显示两融合蛋白均与OtKarp株感染鼠血清产生特异性反应,56-47融合蛋白分别与47kDa、56kDa重组蛋白免疫的小鼠血清产生特异性反应,以及56-47融合蛋白免疫血清与56kDa和47kDa重组蛋白反应.Ot Karp株的56kDa与47kDa外膜蛋白基因嵌合后在大肠杆菌细胞内实现了表达,表达的融合蛋白具有56kDa和47kDa外膜蛋白的抗原特性.
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贝氏柯克斯体30kDa外膜蛋白基因表达及重组外膜蛋白免疫保护性的研究
研制贝氏柯克斯体30kDa重组外膜蛋白和分析该重组蛋白的免疫保护作用.将克隆贝氏柯克斯体30kDa外膜蛋白基因与原核表达载体pQE30重组,用重组质粒转化大肠杆菌后用IPTG诱导转化菌表达重组蛋白;用纯化的重组蛋白免疫小鼠2次,用IFA和ELISA检查免疫小鼠的特异性抗体,以及用重组蛋白体外刺激小鼠T淋巴细胞增殖;免疫4周后,用柯克斯体毒株攻击免疫小鼠,攻毒后第7d,小鼠的主要脏器作病理学检查和柯克斯体量测定.(1)贝氏柯克斯体30kDa外膜蛋白基因在大肠杆菌细胞内表达,产生的重组蛋白约占全菌蛋白的14.6%,免疫印迹显示该重组蛋白能与贝氏柯克斯体感染小鼠血清反应.(2)ELISA检测出免疫小鼠血清中有高滴度的抗重组外膜蛋白抗体,免疫小鼠的脾淋巴细胞经重组外膜蛋白刺激后,细胞增殖水平显著高于非免疫小鼠.(3)免疫小鼠的肺、肝、脾,无明显病变,仅个别小鼠脾脏存在少量柯克斯体,而非免疫小鼠的肺、肝、脾病变十分明显,脾脏明显肿大并含有大量的柯克斯体.贝氏柯克斯30kDa重组外膜蛋白诱导小鼠产生抗贝氏柯克斯体的体液和细胞免疫应答能有效地抵御贝氏柯克斯体的感染.
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贝氏柯克斯体34×103重组外膜蛋白的免疫保护性的研究
原核细胞表达贝氏柯克斯体34×103外膜蛋白基因,评价34×103重组外膜蛋白的免疫保护性.用PCR从我国贝氏柯克斯体分离株的基因组中扩增34×103外膜蛋白基因,用该基因与原核表达质粒重组,构建重组表达质粒;用IPTG诱导重组质粒在大肠杆菌细胞内表达重组蛋白.用重组蛋白皮下接种免疫BALB/c小鼠2次,在加强免疫后的第28天,用ELISA法检测小鼠的血清特异性抗体水平以及作体外脾淋巴细胞增殖试验检查小鼠的特异性细胞免疫水平;用10ID50贝氏柯克斯体腹腔注射攻击免疫小鼠,攻击后第7天病理学检查小鼠脏器的组织病变和染色镜检脾脏的贝氏柯克斯体量.SDS-PAGE和免疫印迹分析证明重组质粒转化的大肠杆菌产生了34×103重组蛋白,重组蛋白能与贝氏柯克斯体感染小鼠血清发生特异性反应.ELISA法检测出免疫小鼠血清中有高滴度的抗重组蛋白抗体,免疫小鼠的体外淋巴细胞增殖水平显著高于非免疫小鼠.组织病理学检查发现免疫小鼠的肺、肝、脾无明显病变,仅个别小鼠脾脏存在少量柯克斯体,而非免疫小鼠的肺、肝、脾病变十分明显,脾脏肿大并含有大量的柯克斯体.重组34×103外膜蛋白具有的免疫保护性,能够诱导机体产生有效的抗贝氏柯克斯体的体液和细胞免疫应答.
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表达胞壁结合型贝氏柯克斯体27kDa外膜蛋白的重组卡介苗构建
构建能够表达胞壁结合型贝氏柯克斯体27kDa外膜蛋白的重组卡介苗.用PCR技术从卡介苗(BCG)基因组扩增分支杆菌19kDa抗原的细胞壁结合区基因和从贝氏柯克斯体基因组扩增27kDa外膜蛋白基因,将它们分别插入大肠杆菌-分支杆菌穿梭质粒(pSMT3)的XbaⅠ/BamHⅠ和BamHⅠ/HindⅢ位点.将重组的穿梭质粒转化大肠杆菌和从大肠杆菌提取重组穿梭质粒转化卡介苗.从含潮霉素的培养基筛选到具有该抗生素抗性重组卡介苗菌落,用免疫印迹分析重组质粒转化的卡介苗,发现一约27kD的蛋白带与贝氏柯克斯体27kD重组蛋白免疫兔血清特异反应,用27kD重组蛋白免疫兔血清做间接免疫荧光检测重组卡介苗,结果为阳性.重组卡介苗能表达贝氏柯克斯体27kDa外膜蛋白,表达的27kDa外膜蛋白存在卡介苗菌体表面,卡介苗菌体表面的27kD抗原可能有效地诱导特异性的抗Q热免疫应答.
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幽门螺杆菌低分子量外膜蛋白的基因克隆、重组载体构建
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是上消化道疾病的主要致病菌,它的感染不但与B型胃炎和消化性溃疡的发生有密切关系,而且与非溃疡性消化不良,MALT淋巴瘤和胃癌也有重要关系,并已被世界卫生组织列为胃癌等肿瘤的相关致病菌[1,2,3].Hp在我国普通人群的感染率较为高50%～80%[4].随着分子生物学技术的发展,幽门螺杆菌致病机理研究的进一步深入,有效抗原的筛选,以及基因工程菌株构建的运用,将预防和根治Hp的感染成为了可能.因此,本实验以Hp特快特异性基因--18kDa外膜蛋白基因,经PCR扩增,构建重组载体,为在原核生物表达创造条件,同时为疫苗的研究以及快速诊断试剂盒的开发奠定基础.
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幽门螺杆菌低分子质量外膜蛋白编码基因的克隆与重组载体构建
目的:构建幽门螺杆菌18kDa外膜蛋白编码基因重组载体,为Hp的疫苗开发、快速诊断试剂盒的研究奠定基础.方法:用PCR从Hp染色体DNA中扩增18kDa外膜蛋白的编码基因片段,将目的基因、pQE30质粒同时经BamHI、HindⅢ双酶切、纯化、连接、转染以及筛选含插入片段的重组载体.结果:经酶切、测序分析插入的基因片段为表达Hp18kDa外膜蛋白编码基因,有2%碱基发生变异,以及1.68%氨基酸残基改变.与文献相比,有高度的同源性.结论:Hp外膜蛋白编码基因克隆、重组载体的构建为该基因编码的蛋白质有效表达提供了条件,同时也为疫苗开发和快速诊断试剂盒的制备打下了基础.
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幽门螺杆菌Mr 26 000外膜蛋白编码基因在DH5α中的表达
目的构建含幽门螺杆菌(H.pylori)Mr 26 000外膜蛋白编码基因的重组载体并在E. coli DH5α(PREP4)中表达.方法用PCR从H.pylori染色体中,扩增Mr 26 000外膜蛋白编码基因片段.将目的基因与pQE30同时经BamH Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切、纯化、连接后,转化含有目的基因的重组载体.以含目的基因片段的重组载体转化大肠杆菌DH5α并表达.表达产物经纯化后,用ELISA法检测其抗原性.结果插入的基因片段为H.pylori Mr 26 000的外膜蛋白编码基因与Tomb等报道相比较,有1.1%的碱基发生变异, 1.5 1%的氨基酸残基改变;目的基因经表达其蛋白Mr为26×103 ,可溶性表达产物占全菌总蛋白的20%以上;目的蛋白经Ni2+-NTA琼脂糖树脂纯化后,其纯度达95%以上,且该目的蛋白可被H.pylori阳性患者的血清所识别,具有良好的抗原性.结论成功地克隆并表达了H.pylo ri Mr 26 000的外膜蛋白编码基因,为H.pylori蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的研究打下了基础.
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赖型钩体pDC38核酸序列测定及其与流感伤寒型钩体外膜蛋白基因ompL1核酸序列的类似性匹配
为了探讨赖型钩体pDC38插入片段基因组DNA编码、位置与ompL1基因的关系,作者采用在流感伤寒型钩体外膜蛋白基因ompL1首尾区段设计一对引物,以pDC38插入片段作模板进行PCR扩增、测定和类似性匹配(alignment).结果发现:pDC38含有2.7kb和3.0kb两个插入片段,3.0kb片段含有1个ompL1基因全拷贝.结论:类似性匹配表明,pDC38和ompL1相同碱基864个(90%),碱基变异(不配对)96(10%)个, pDC38可用于钩体诊断、分类、鉴定、疫苗和发病机理的研究.
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赖型钩体弱毒株外膜蛋白基因的序列分析
目的:探讨赖型钩体弱毒株外膜蛋白基因的特点及其与强毒株的差别.方法:对问号钩体赖型56601株的外膜蛋白基因进行PCR扩增得到外膜蛋白基因并进行了全基因序列测定,并与我国特有的强毒株017株进行了Ompl1基因核苷酸序列、推导的氨基酸序列以及亲水性和疏水性和二级结构的比较.结果:赖型钩体56601株和017株Ompl1基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列同源性均为99%.结论:赖型钩体56601株和017株Ompl1基因核苷酸序列存在较小差别,可能与毒力强弱有关.另外,两株钩体Ompl1基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列同源性很高,从分子水平上说明了同型弱毒疫苗可对强毒株产生完全的免疫保护.
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幽门螺杆菌Mr 26 000外膜蛋白编码基因的克隆及表达
目的构建含幽门螺杆菌(Hp)Mr 26 000外膜蛋白编码基因的重组载体,并在E. coli BL21中表达.方法用PCR从Hp染色体中,扩增Mr 26 000外膜蛋白编码基因片段.将目的基因与pET32a(+)同时经BamH I、Hind Ⅲ双酶切、纯化、连接后,构建含有目的基因的重组载体.以含目的基因片段的重组载体转化大肠杆菌BL21(DE30)并表达.表达产物经纯化后,用ELISA法检测其抗原性.结果经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hp Mr 26 000的外膜蛋白编码基因,与Tomb等的报道相比较,有1.1%的bp发生变异,1.51%的氨基酸残基改变.经SDS-PAGE分析发现,融合基因表达的蛋白Mr为46×103,可溶性表达产物占细菌总蛋白的38.96%.重组蛋白经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后,其纯度达95%以上.ELISA法检测显示,该重组蛋白可被Hp阳性患者的血清所识别,具有良好的抗原性.结论成功地克隆并表达Mr为26 000的Hp外膜蛋白编码基因,为Hp蛋白疫苗的研制和快速诊断试剂盒的研究打下了基础.
