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氯化锂对培养神经干细胞增殖分化的影响及其机制研究
目的 观察氯化锂对培养神经干细胞(NSCs)增殖及分化的影响,探讨Wnt信号途径对NSCs增殖分化的调控作用.方法 分离培养并传代扩增NSCs,显微观察结合流式细胞仪分析不同浓度氯化锂处理对NSCs形态、贴壁分化及细胞周期动力学的影响,Western印迹定量检测不同浓度氯化锂作用后NSCs糖原合酶激酶3β(GSK3β)、β-catenin的表达变化.结果 氯化锂作用后NSCs更多地保持悬浮生长的状态,离散细胞密度显著增加,神经球有减小分散趋势;氯化锂能显著抑制血清诱导的NSCs分化,表现为贴壁时间延长,细胞突起较对照组明显减少、缩短;流式细胞仪分析显示,氯化锂作用组NSCs处于S期的比例明显增高,G1期细胞呈现减少的趋势.且上述效应呈现一定的剂量效应关系.Western印迹显示,氯化锂能逐步增强β-catenin的表达,高浓度组能明显抑制GSK3β表达.结论 氯化锂能明显抑制NSCs分化,刺激其增殖,该效应可能与其对Wnt信号途径的活化有关.
关键词： 氯化锂 神经干细胞(NSCs) 糖原合酶激酶3β 增殖 分化 -
促红细胞生成素通过叉头状转录因子O1-糖原合酶激酶3β信号改善棕榈酸诱导HepG2细胞糖代谢
目的：观察促红细胞生成素（EPO）处理对棕榈酸（PA）诱导HepG2细胞糖异生及糖原合成的影响及作用机制。方法250μmol/L的PA作用HepG2细胞24 h，分别用5、10 U/ml EPO作用24 h，另外，EPO处理的HepG2细胞分别加入磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）特异性抑制剂LY294002或渥曼青霉素(wortmannin)预孵育1 h。比色法检测HepG2细胞糖原含量，Western blotting检测磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）、PI3K蛋白表达、蛋白激酶B（AKT）、叉头状转录因子O1（FOXO1）、糖原合酶激酶3β（GSK-3β）表达。多组间比较采用方差分析。结果与PA处理组相比，5 U/ml和10 U/ml EPO处理组细胞下游分子GSK-3β（分别为1.02±0.03比0.74±0.11、1.06±0.02比0.74±0.11，t=4.236、4.996，均P<0.05）及FOXO1磷酸化水平明显增强（分别为0.99±0.05比0.73±0.09、1.13±0.06比0.73±0.09，t=4.798、6.757，均P<0.05）。与EPO治疗组比较，加入抑制剂LY294002或wortmannin后，GSK-3β（0.68±0.09比1.12±0.14、0.76±0.10比1.12±0.14，t=-4.632、-3.655，均P<0.05）及FOXO1（0.92±0.02比1.15±0.06、0.72±0.07比1.15±0.06，t=-6.532、-7.984，均P<0.05）磷酸化水平均明显被抑制。结论在PA诱导的HepG2细胞，EPO可能通过PI3K/AKT介导的FOXO1、GSK-3β通路改善糖代谢。
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外源性神经生长因子对APP/PS1转基因小鼠Wnt/β-catenin信号通路的调节
目的:探讨外源性神经生长因子(NGF)对APP/PS1转基因小鼠Wnt/β-catenin信号通路的调节.方法:鼻腔给予小鼠NGF治疗14周,应用免疫组织化学检测小鼠脑内β淀粉样蛋白(Aβ)老年斑的分布,应用免疫印迹检测小鼠脑内糖原合酶激酶3β(GSK3β)、p-GSK3β、β-连环蛋白(β-catenin)和p-β-catenin的表达.结果:Aβ免疫组织化学显色结果显示,与对照组小鼠大脑内的Aβ老年斑相比较,NGF治疗组转基因小鼠大脑内的Aβ老年斑数量减少了30.22％,沉积减少了35.85％,差异有统计学意义.免疫印迹结果显示,外源性NGF减少APP/PS1转基因小鼠脑内GSK3β的表达,增加β-catenin的表达.结论:外源性NGF可能通过抑制GSK3β的活性和增加β-catenin的活性,激活Wnt/β-catenin信号通路,对神经元起保护作用.
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糖原合酶激酶3β和腺瘤性结肠息肉病蛋白在气道上皮细胞机械损伤修复过程的时空分布
为了探讨糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)和腺瘤性结肠息肉病(adenomatous polyposis coli,APC)蛋白在气道上皮细胞(airway epithelial cells,AECs)损伤和修复中的作用,我们采用机械划线损伤的方法建立体外气道上皮损伤修复模型,采用Western blot、免疫荧光双标共聚焦成像和免疫沉淀的方法观察损伤修复过程中APC蛋白和GSK3β在AECs中表达及分布的动态变化.结果显示:(1)用Western blot方法观察到划线损伤0.5 h后即有GSK3β磷酸化增强(P＜0.05),6 h达到高峰(P＜0.05),持续到12 h(P＜0.05),24 h开始下降,而GSK3β总量大致保持一致.(2)在免疫荧光双标共聚焦成像实验中,划线损伤0 h组APC蛋白主要表达于胞浆,而划线损伤6 h后APC蛋白主要聚集于损伤前沿区的迁移活跃细胞.(3)免疫共沉淀的实验结果显示,划线损伤0 h时GSK3β和APC蛋白能共同沉淀,但在划线损伤6 h之后,两者发生了分离.以上结果表明:划线损伤后AECs立即启动修复过程,此时GSK3β的活性被抑制,促使APC蛋白游离出来;游离出来的APC蛋白则与微管正极结合,增加了微管的稳定性,从而调节细胞骨架运动,促进气道上皮的损伤修复.
关键词： 糖原合酶激酶3β 腺瘤性结肠息肉病蛋白 气道上皮细胞 损伤修复 -
糖原合酶激酶3β以细胞周期蛋白D1依赖性方式引发人肺腺癌细胞A549细胞周期阻滞
对糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)在细胞增殖中的作用研究,在不同细胞系和不同刺激因素作用下得出了不同结论,本文旨在探讨GSK3β在人肺腺癌细胞系A549细胞生长中的直接作用.A549细胞瞬时转染持续激活型S9A-GSK3β以及显性负突变型KM-GSK3β两种GSK3β突变型质粒,改变GSK3β活性.24 h后,分别进行细胞计数,流式细胞术及Western blot检测.结果显示,增强GSK3β活性可导致细胞数量下降,G1期细胞百分比升高.细胞周期蛋白D1表达水平被GSK3β下调.结果提示,GSK3β可能以细胞周期蛋白D1依赖性方式引发A549细胞的G1期阻滞,从而发挥生长抑制效应.
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GSK3β及其选择性剪接体mRNA实时荧光定量PCR检测体系的构建
目的 建立并评估检测糖原合酶激酶3β(GSK3β)及其选择性剪接体(GSK3β△ex8+9)mRNA的实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法.方法 提取慢性粒细胞白血病(CML)和CML急变期患者外周血或/和骨髓总RNA,分别扩增GSK3β及GSK3β△ex8+9目的片段并构建质粒标准品和标准曲线,建立qRT-PCR法并检测其重复性和特异性.结果 成功扩增出GSK3β(133 bp)和GSK3β△ex8 +9(219 bp)目的条带,建立了检测两目的基因的qRT-PCR法;相应的标准曲线显示循环阈值与模板浓度线性关系良好,相关系数(r)分别为0.997和0.999;两反应体系的重复性结果显示,批内和批间变异系数(CV)均＜2％;特异性结果显示,GSK3β反应体系扩增对照组mRNA仅显示GSK3β条带,GSK3 βAex8+9反应体系扩增对照组mRNA均无GSK3β △ex8+9条带出现.结论建立的qRT-PCR法重复性好,特异性强,可用于GSK3β和GSK3β△ex8+9基因表达的定量检测.
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糖原合酶激酶3β与肾脏病变的关系
糖原合酶激酶3(GSK-3)尤其是GSK-3β亚型广泛参与真核细胞有丝分裂、细胞分化、细胞骨架组装及上皮细胞存活等重要生命活动.长期使用锂制剂(GSK-3抑制剂)的患者会出现尿崩症,提示GSK-3β在肾脏尿液浓缩功能中发挥重要作用.肾移植受者应用雷帕霉素后GSK-3β活性被抑制,导致足细胞损伤发生蛋白尿.GSK-3β对于肾小管浓缩功能及足细胞构成完整有效的滤过屏障有重要作用.
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氯化锂在肢体缺血后处理中对脑缺血再灌注大鼠的糖原合酶激酶3β/微管相关蛋白2a/b通路的影响
目的 探讨肢体缺血后处理中氯化锂对脑缺血再灌注大鼠糖原合酶激酶3β(GSK3β)及其下游微管相关蛋白2a/b(MAP2a/b)的影响.方法 将60只雄性SD大鼠随机分为假手术组,缺血再灌注组(I/R组),肢体缺血后处理组(LpostC组)和氯化锂组(LiCl组),15只每组.制作脑缺血再灌注,肢体缺血后处理及氯化锂干预大鼠模型,于大鼠脑缺血再灌注24 h后进行神经功能缺损评分和大鼠脑梗死体积测定;应用Western blotting法检测P-GSK3β(ser9),MAP2a/b的蛋白表达.结果 除了假手术组,I/R组神经功能缺损评分和脑梗死体积大,LpostC组较小,LiCl组神经功能缺损评分和脑梗死体积小(均P＜0.05).与I/R组相比,LpostC组磷酸化GSK3β(P-GSK3β)(ser9)及MAP2a/b表达增高(均P＜0.05).与LpostC组相比,LiCl组P-GSK3β(ser9)及MAP2a/b表达明显升高(均P＜0.05).结论 肢体缺血后处理使P-GSK3β(ser9)表达增加,激活GSK3β/MAP2a/b信号通路对脑缺血再灌注损伤起保护作用.氯化锂通过增加MAP2 a/b的稳定性增强对脑缺血后处理的脑保护作用.
关键词： 肢体缺血后处理 糖原合酶激酶3β 微管相关蛋白2 a/b 氯化锂 -
E-cadherin表达下调致GSK-3β磷酸化失活的分子机制研究
目的:探讨E-cadherin表达下调在肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中诱导GSK-3β磷酸化失活信号通路的调控机制.方法:运用RNA干扰技术建立E-cadherin表达缺失的稳定细胞株.Western blot实验检测稳定株细胞(HepG2-E-cadherin-shRNA) E-cadherin的表达水平以及GSK-3β与Akt的磷酸化水平；用10μmol/L P13K抑制剂(LY294002)处理HepG2-E-cadherin-shRNA细胞,Western blot检测细胞GSK-3β磷酸化水平,RT-PCR检测HepG2-E-cadherin-shRNA细胞PTEN和Egr-1的mRNA水平,Western blot检测细胞PTEN的蛋白表达水平.结果:Western blot实验结果表明,HepG2-E-cadherin-sh RNA稳定株细胞E-cadherin表达水平较空白对照组下调约82.54％,GSK-3β磷酸化水平较空白对照组上升约298.93％,Akt磷酸化水平较空白对照组上升约218.98％; LY294002作用4h后,GSK-3β磷酸化水平与空白对照组相比下降至48.13％; RT-PCR结果显示,下调HepG2细胞E-cadherin表达水平后,细胞PTEN的mRNA水平下降至76.14％,Egr-1的mRNA水平下降至66.89％,PTEN的蛋白表达水平下降至53.77％.结论:人HCC细胞中E-cadherin抑制性表达导致细胞内GSK-3β磷酸化失活很可能是通过PI3K/Akt的信号通路实现的.
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氟伏沙明对N2a细胞mTOR、Camk2γ及GSK-3β表达的影响
目的 探讨氟伏沙明对N2a细胞雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、钙/钙调素依赖性蛋白激酶2γ(Camk2γ)及糖原合酶激酶3β(GSK-3β)表达的影响及其可能机制.方法 将培养成功的N2a细胞随机分为3组,每组6个复孔,分别加入DMEM(D组)、氟伏沙明0.5μmol/L(F组)和BD1047(σ1受体阻断剂)0.2 μmol/L+氟伏沙明0.5μmol/L(BF组)培养48 h.Western blot检测各组mTOR、Camk2γ及GSK-3β的表达.结果 与D组相比,F组mTOR及Camk2γ表达上调,GSK-3β表达下调(P＜0.01);与F组相比,BF组mTOR及Camk2γ表达下调,GSK-3β表达上调(P＜0.01).结论 氟伏沙明的药理作用可能与激活σ1受体活性有关.
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过表达PDCD4逆转胃癌顺铂耐药的初步机制
目的 程序性细胞死亡因子(PDCD4)是近年来新发现的一类促凋亡基因,文中主要研究PDCD4逆转胃癌顺铂耐药的分子机制,为胃癌的耐药机制研究和治疗提供新的基因靶点.方法 通过在人胃癌细胞系SGC7901/DDP中稳定过表达PDCD4基因,实验分为对照组(仅转染pCMV质粒),高表达组(仅转染pCMV-PDCD4质粒),对照加药组(转染pCMV质粒并加入顺铂处理),高表达加药组(转染pCMV-PDCD4质粒并加入顺铂处理),进行细胞免疫荧光﹑流式细胞术、RT-PCR和Western blot实验.实验分为空载加药组(转染pCMV质粒并加入顺铂处理)﹑PDCD4加药组(转染pCMV-PDCD4质粒并加入顺铂处理)和PDCD4加激活剂组(转染pCMV-PDCD4质粒,先加入SC79再加入顺铂处理)进行pAkt回补实验.结果高表达组PDCD4蛋白和mRNA表达较对照组明显升高(P<0.05),高表达加药组PDCD4蛋白和mRNA表达较对照加药组明显升高(P<0.05).流式细胞术检测细胞早期凋亡水平显示,高表达加药组顺铂诱导的细胞早期凋亡率(25.22％)较对照加药组(21.08％)显著增高(P<0.05).通过Western blot法表明,相较于对照加药组,高表达加药组中pAkt、pGSK3β和BCL-2的表达量均有明显降低(0.73±0.06 vs 0.42±0.04、0.88±0.05 vs 0.53±0.08、1.15±0.13 vs 0.84±0.14),差异均有统计学意义(P<0.05);而相较于对照加药组,高表达加药组中促凋亡蛋白BAK的表达水平则明显升高(1.28±0.09 vs 1.48±0.09),差异有统计学意义(P<0.05).PDCD4加药组pAkt、pGSK3β表达较空载加药组、PDCD4加激活剂组明显降低(P<0.05),PARP(C)表达较空载加药组、PDCD4加激活剂组明显升高(P<0.05).结论 过表达PDCD4能够通过pAkt/pGSK3β促进顺铂引起的胃癌细胞凋亡,有利于逆转细胞顺铂耐药的形成.
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糖原合酶激酶3β对体外加压培养下的视网膜神经节细胞的作用
目的 研究体外加压培养的视网膜神经节细胞(RGCs)中糖原合酶激酶3β(GSK3)活性变化及其对RGCs存活的影响。方法 实验研究。混合培养大鼠RGCs，分为RGCs无加压对照组、单纯RGCs加压组（60 mmHg压力下培养24h）、RGCs加压+10 mmol/L氯化锂（Licl，GSK3β抑制剂）组和RGCs加压+20 mmol/L Licl组。采用免疫荧光法检测RGCs中磷酸化丝氨酸9位点GSK3β(pS9-GSK3β）的表达情况；以MTT法检测吸光度(OD)值反映RGCs活性。对数据进行单因素方差分析。结果 加压组pS9-GSK3β表达的荧光密度平均光密度（MOD）值为0.057±0.012，较对照组(0.085±0.023)低，而加压+10 mmol/L Licl组和加压+20 mmol/L Licl组pS9-GSK3β表达的荧光密度(分别为0.081±0.016和0.099±0.024)均较加压组大，且随着Licl浓度的增加，pS9-GSK3β表达的荧光密度增大。MTT结果显示，4个实验组的OD值差异有统计学意义（F=14.539，P＜0.05）。加压组OD值(0.109±0.016)较对照组(0.135±0.015)低(P＜0.05)，细胞活性较低；而加压+20 mmol/L Licl组中OD值(0.159±0.014)较加压组高(P＜0.05)，细胞活性较高。结论 压力培养下，视网膜神经节细胞中pS9-GSK3β表达减少，提示GSK3β活性增强，RGCs活性降低。Licl作为GSK3β的抑制剂，可能对RGCs有保护作用。
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6-羟基-1-氢-吲唑保护 MPP +诱导凋亡的 SH-SY5Y 细胞的机制
目的：研究6-羟基-1-氢-吲唑对1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP +)诱导凋亡的 SH-SY5Y 细胞的保护作用机制。方法体外培养人神经母细胞瘤细胞 SH-SY5Y,以200μmol/ L MPP +诱导 SH-SY5Y 细胞凋亡建立体外帕金森病细胞模型。 Western blot 法分别检测200μmol/ L MPP +和200μmol/ L MPP +联合0.1μmol/ L 6-羟基-1-氢-吲唑作用后 SH-SY5Y 细胞内糖原合酶激酶3β(GSK-3β)、周期依赖性蛋白激酶5(CDK5)以及凋亡蛋白酶3(caspase-3)的活性。结果200μmol/ L MPP +作用 SH-SY5Y 细胞8 h, GSK-3β、CDK5与 caspase-3活性升高。200μmol/ L MPP +联合0.1μmol/ L 6-羟基-1-氢-吲唑作用 SH-SY5Y 细胞8 h,GSK-3β、CDK5与 caspase-3的活性降低。结论6-羟基-1-氢-吲唑对MPP +诱导凋亡的 SH-SY5Y 细胞的保护机制可能是抑制GSK-3β、CDK5和 caspase-3的活性。
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活血通痹汤塌渍疗法治疗兔膝骨关节炎的效果及其机制
目的 观察活血通痹汤塌渍疗法对兔膝骨关节炎的治疗作用,并探讨其可能的机制.方法 将72只新西兰大白兔随机分为空白组、模型组、扶他林组、42℃塌渍组、37℃塌渍组、32℃塌渍组,每组12只.除空白组外,其余5组均采用关节制动法建立兔右侧膝骨关节炎模型,建模时间为4周.建模第5周,扶他林组右侧膝关节外用扶他林软膏,1次/d;42℃塌渍组、37℃塌渍组、32℃塌渍组均采用活血通痹汤行塌渍疗法治疗,并调整塌渍时的温度分别为42、37、32℃,1次/d.分组处理28天处死各组动物,观察右侧膝关节软骨大体情况及软骨组织病理改变.取各组右侧膝关节软骨组织,采用real-time PCR法检测Wnt蛋白(Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a)mRNA相对表达量;Western blotting法检测连环素蛋白(β-catenin)、糖原合酶激酶3β(GSK-3β)蛋白表达.结果 空白组右侧膝关节软骨大体情况及软骨组织均正常,模型组呈明显骨关节炎改变.42℃塌渍组关节表面较光滑,可见轻度肿胀及滑膜充血;软骨细胞数目较多,分布较均匀,可染色,潮线模糊但有层次;37℃塌渍组、扶他林组、32℃塌渍组均可见关节软骨表面不平整,伴有肿胀及滑膜充血;软骨细胞数量较少,分布比较乱,有局部细胞积聚,潮线较模糊.空白组、42℃塌渍组、37℃塌渍组、扶他林组、32℃塌渍组、模型组膝关节软骨组织Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a mRNA相对表达量及β-catenin、GSK-3β蛋白相对表达量均依次升高,组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05).结论活血通痹汤塌渍疗法治疗兔膝骨性关节炎的效果较好,以42℃条件下的治疗效果佳;其作用机制可能与调控Wnt/β-catenin信号通路有关.
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下调糖原合酶激酶3β活性改善脑缺血再灌注大鼠学习记忆障碍的机制研究
目的 探讨下调糖原合酶激酶3β(GSK-3β)活性对脑缺血再灌注大鼠学习记忆障碍改善作用的机制.方法 30只SD大鼠随机分为空白对照组、模型组、SB组,采用大脑中动脉线栓法(M ACO)将模型组、SB组大鼠进行缺血再灌注造模,并予以SB组大鼠尾静脉注射SB216763(SB)后,对3组大鼠进行水迷宫测试、电跳台测试,进一步采用电生理检测海马CA3区海马长时程增强(LTP),检测皮质和海马cAMP反应元件结合蛋白(CREB)、β-连环蛋白(β-catenin)水平和磷酸化及NR2A/B的蛋白水平,检测脑组织CREB、β-catenin及NR2A/B的分布,皮质和海马CREB、β-catenin和NR2A/B的mRNA水平.结果 模型组水迷宫测试、电跳台测试均较空白对照组差(P<0.01),SB组水迷宫测试、电跳台测试均优于模型组(P<0.05或0.01);模型组与空白对照组比较,高频刺激后峰电位幅值和兴奋性突触后电位(EPSP)斜率均明显减小(P<0.01),SB组与模型组比,高频刺激后峰电位幅值和EPSP斜率均增大(P<0.01);SB组皮质和海马CREB、β-catenin及NR2A/B的蛋白水平均高于模型组(P<0.05或0.01);SB组皮质和海马CREB、β-catenin的磷酸化水平低于模型组(P<0.05);CREB、β-catenin及NR2A/B主要分布于大脑海马组织;SB组皮质和海马CREB、β-catenin和NR2A/B的mRNA水平均高于模型组(P<0.05或0.01).结论 下调糖原合酶激酶3β活性可通过增强LTP、增加脑组织CREB、β-catenin和NR2A/B的表达,从而对脑缺血再灌注大鼠的学习记忆障碍起到改善的作用.
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慢性高眼压模型鼠视网膜神经节细胞及视神经中9位丝氨酸磷酸化糖原合酶激酶3β的表达变化
目的 观察慢性高眼压模型鼠视网膜神经节细胞(retina ganglion cells,RGCs)和视神经中9位丝氨酸磷酸化糖原合酶激酶3β[p-GSK3β(ser9)]的表达变化,探讨GSK3β是否在慢性高眼压RGCs及视神经退行性病变中发挥作用.方法 取健康SD大鼠30只,随机分为3组:模型对照组、慢性高眼压模型2周组、慢性高眼压模型4周组,每组10只.取大鼠右眼,采用巩膜上静脉结扎并烧灼法建立大鼠慢性高眼压模型.分别于造模后2周和4周取5只大鼠眼球行冰冻切片,尼氏染色观察RGCs数目,免疫荧光染色观察RGCs和视神经中p-GSK3β(ser9)的变化;各组取另外5只大鼠眼视网膜,Western blot检测p-GSK3β(ser9)及总-GSK3β的表达.结果 造模前3组大鼠右眼眼压差异无统计学意义(P=0.89);造模后3组间眼压差异有统计学意义(P＜0.01),慢性高眼压模型2周组和4周组眼压与模型对照组比较明显升高,分别升高了59.13％和26.93％,差异均有统计学意义(均为P＜O.01).视网膜尼氏染色RGCs计数发现模型对照组RGCs数为(149±12)个,慢性高眼压模型2周组和4周组RGCs数较模型对照组明显减少,分别为(120±10)个和(86±7)个,差异均有统计学意义(均为P＜0.05);且4周组比2周组进一步减少(P＜0.01).慢性高眼压模型2周组和4周组视网膜中p-GSK3β(ser9)阳性着色,同模型对照组相比,其RGCs层及视神经中p-GSK3β(ser9)染色荧光减弱;4周组较模型对照组减弱更明显.与模型对照组相比,慢性高眼压模型2周组和4周组视网膜中总-GSK3β的表达差异无统计学意义(F=0.24,P=0.79);而3组间p-GSK3β(ser9)表达差异有统计学意义(P＜0.01),与模型对照组相比,慢性高眼压模型2周组和4周组视网膜中p-GSK3β(ser9)分别减少了19.89％和36.46％(均为P ＜0.05).慢性高眼压模型4周组比2周组视网膜中p-GSK3β(ser9)表达持续减少,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 慢性高眼压模型鼠RGCs数目减少,RGCs和视神经中p-GSK3β(ser9)表达减少,推测p-GSK3β(ser9)表达变化可能参与了慢性高眼压模型鼠RGCs及视神经退行性病变.
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糖原合酶激酶3β在轻型/重症急性胰腺炎细胞模型中的表达
目的 探讨糖原合酶激酶3β(GSK3β)在轻型/重症急性胰腺炎发病中的表达及作用方法 采用单独雨蛙素、雨蛙素联合脂多糖刺激分别构建轻型急性胰腺炎(MAP)和重症急性胰腺炎(SAP)的细胞模型,分别在2、4、8、12、24 h收集细胞培养基上清,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测淀粉酶、脂肪酶、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的表达变化,流式细胞术检测细胞凋亡率及坏死率,实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测GSK3β及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3、-8、-9 mRNA表达变化.结果 雨蛙素组和雨蛙素+脂多糖组各时间点淀粉酶、脂肪酶、TNF-α、IL-6较对照组均增高,且在大多数时间点,雨蛙素+脂多糖组组比雨蛙素组水平更高,开始上调时间相同或更早(P＜0.05).刺激24 h后,雨蛙素组凋亡率[(19.2±0.9)％]显著高于雨蛙素+脂多糖组[(10.2±0.5)％,P ＜0.05].雨蛙素组坏死率[(5.8±0.3)％]显著低于雨蛙素+脂多糖组[(13.6±0.7)％,P＜0.05].SAP组的坏死/凋亡比值是MAP组的5倍.GSK3β的mRNA水平在雨蛙素组中是2h短暂下调[相对表达量为(0.5±0.1)倍]后于8h显著上升[相对表达量为(3.0±1.1)倍,P ＜0.05],然后又逐步下降;而在雨蛙素+脂多糖组中则是是8h才缓慢上调[相对表达量为(1.8±0.6)倍,P＜0.05],至24 h达到高峰[相对表达量为(3.6±0.3)倍,P＜0.05].GSK3β和Caspase-3 mRNA水平均有升高,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论 采用单独雨蛙素、雨蛙素联合脂多糖刺激分别建立MAP和SAP细胞模型可行;GSK3β在MAP和SAP中可能通过促进腺泡细胞凋亡来起作用.
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丹参酮ⅡA对β淀粉样蛋白25-35片段的作用及机制研究
目的 探讨丹参酮ⅡA对β淀粉样蛋白25-35片段(Aβ25-35)诱导的褐家鼠肾上腺嗜铬瘤细胞PC12细胞系抑制中的作用及机制.方法 MTT检测丹参酮ⅡA(2 μmol/ L)对Aβ25-35(20 mmol/ L)处理过的细胞活性, 应用公式 (1-实验组平均OD值/对照组OD值) ×100%计算细胞抑制率.RT-PCR、western blot检测细胞内GSK3β及piGSK3β的表达量.结果 丹参酮ⅡA有效的拮抗了Aβ25-35引起的细胞抑制及GSK3β的高表达和低磷酸化.结论 Aβ25-35可以引起PC12细胞抑制,而丹参酮可以拮抗Aβ25-35的作用,并且可能是通过GSK3β通路而发挥作用.
关键词： β淀粉样蛋白25-35片段 阿尔茨海默病 糖原合酶激酶3β 丹参酮ⅡA -
氯化锂通过激活Wnt信号通路促进内皮祖细胞的增殖能力
目的 探讨糖原合酶激酶3β(GSK-3β)抑制剂氯化锂对内皮祖细胞增殖的作用机制.方法 密度梯度离心法分离大鼠骨髓源性内皮祖细胞,体外培养7天后分别给予不同浓度氯化锂(5、10、20、40 mmol/L)以抑制内皮祖细胞的GSK-3β活性.分别采用镜下计数法及四氮唑溴盐比色法测定内皮祖细胞增殖能力,荧光激活细胞分离仪分析各组内皮祖细胞的细胞周期变化.采用蛋白印迹法测定Wnt信号通路中磷酸化GSK-3β、β-连环蛋白及细胞周期蛋白D1的蛋白表达.结果 氯化锂在一定浓度范围内可剂量依赖性地增加内皮祖细胞数量.与对照组比较,不同浓度氯化锂组(5、10、20 mmol/L)内皮祖细胞数量显著增加(P＜0.05,n=5).四氮唑溴盐比色法检测氯化锂各浓度组内皮祖细胞在490 nm处吸光度值与对照组比较差异有显著性(P＜0.05,n=5).荧光激活细胞分离仪分析显示氯化锂组细胞周期S期较对照组显著增加(P＜0.05,n=3).蛋白印迹法测定表明,与对照组比较氯化锂可显著增加磷酸化GSK-3β、β-连环蛋白及细胞周期蛋白D1的蛋白表达(P＜0.05,n=3).结论 GSK-3β抑制剂氯化锂可通过激活Wnt信号通路显著促进内皮祖细胞的增殖能力.
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NO-1886对糖尿病小型猪肾组织糖原合酶激酶3β表达的影响
目的 观察脂蛋白脂酶活化剂NO-1886对饮食诱导的糖尿病小型猪肾组织糖原合酶激酶3β(GSK-3β)mRNA和蛋白表达的影响.方法 分别给小型猪喂正常饲料(C组,n=5)、高脂高糖饲料(DM组,n=5)和高脂高糖饲料加1.0%NO-1886(NO-1886组,n=5),测空腹血糖、胰岛素、三酰甘油(TG)、肌酐、尿素氮和晨尿微量白蛋白浓度,进行口服葡萄糖耐量试验.5个月后实时荧光定量PCR和Westem印迹法检测肾GSK-3β mRNA和蛋白表达.结果 与C组比较,DM组出现高糖、高TG血症和胰岛素抵抗,尿微量自蛋白增加(P<0.05或P<0.01).DM组GSK-3β mRNA相对表达量为0.0272±0.0052,蛋白相对表达量为1.1600±0.0463,均显著高于C组mRNA(0.0125±0.0045,P<0.01)和蛋白(0.1385±0.0664,P<0.01)表达.而与DM组相比,NO-1886组血糖、胰岛素和TG下降,胰岛素抵抗改善,尿微量白蛋白减少(P<0.05或P<0.01),GSK-3β mRNA(0.0162±0.0019,P<0.05)和蛋白(0.8429±0.0408,P<0.05)表达均减少.结论 NO-1886可改善高脂高糖饮食诱导的糖、三酰甘油代谢异常和胰岛素抵抗,下调肾GSK-3β mRNA和蛋白表达,保护肾组织结构和功能.
