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脐血CD34+细胞巨核系定向诱导分化的研究
目的:研究TPO与SCF、IL-11协同在体外促进入脐血CD34+细胞向巨核系增殖分化的效应.方法:利用流式细胞仪分离纯化脐血CD34+细胞,在含血清液体培养体系中、细胞因子诱导下培养14 d.采用流式细胞术测定不同时间点培养体系中CD41+细胞的比例;同时采用甲基纤维素半固体集落培养测定CFU-MK的数量.结果:经14 d培养,TPO+SCF+IL-11组可使CD41+细胞和CFU-MK数量分别扩增40.83±12.41倍、7.86±2.63倍,明显高于TPO组的28.69±8.27倍、4.48±1.25倍.结论:在体外SCF和IL-11可以协同增强TPO诱导脐血CD34+细胞向巨核系增殖分化的作用.
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骨髓间充质干细胞的研究进展
骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是骨髓中的非造血干细胞,又称为"成纤维细胞集落形成单位(Colony-forming unit fibroblastic,CUF-F)"、"骨髓基质成纤维细胞(Marrow stromal fibroblasts,MSF)"或"骨髓基质细胞(Bonemarrow stromal cells,BMSCs)".
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三氧化二砷对人鼻咽癌小鼠移植瘤生长抑制和诱导分化的初步研究
目的:研究三氧化二砷(As2O3)对人鼻咽低分化鳞癌可移植瘤在SCID小鼠体内生长的抑制作用,并初步研究其对细胞分化的影响.方法:以人鼻咽低分化鳞癌细胞株CSNE-1为研究对象,观察腹腔注射As2O3(5mg/kg)对人鼻咽癌在SCID小鼠体内生长情况.用光学显微镜和电子显微镜观察形态结构变化、免疫组化方法检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达情况.结果:腹腔注射As2O3后,鼻咽癌SCID小鼠移植瘤生长抑制,抑瘤率75.4%.同时,瘤组织中癌细胞密度减少,细胞皱缩,胞浆红染,瘤组织分化渐成熟,出现角化细胞和角化珠;间质结缔组织增多.透射电镜下肿瘤细胞均出现成熟分化,核浆比例减少,胞浆中细胞器增多,出现大量张力原纤维并围绕核周,可见细胞明显角质化,细胞表面微小突起增多,桥粒增多,细胞之间以桥粒互相连接.癌细胞PCNA在阴性对照组呈高表达,阳性细胞指数(PI)达95%,As2O3组的细胞PCNA表达明显减少,PI 55%(P=0.001).结论:As2O3抑制SCID小鼠体内人鼻咽低分化鳞癌的生长,这种抑制作用可能与其能够诱导癌细胞向成熟方向分化有关.
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氧化型低密度脂蛋白对骨髓源性平滑肌样细胞粘附和迁移的影响
[目的]建立体外诱导骨髓间质干细胞分化的平滑肌细胞模型,探索骨髓间质干细胞分化的平滑肌细胞在动脉粥样硬化发生发展过程中的作用.[方法]采用贴壁法从SD大鼠骨髓中分离骨髓间质干细胞(BMSC),运用条件培养基诱导BMSC分化成平滑肌细胞(SMC),采用免疫荧光法分析骨髓间质干细胞及其分化后的细胞特异性标志物.羟脯氨酸测定法检测两种细胞合成细胞外基质能力,粘附和迁移实验检测两种细胞的粘附和迁移能力.[结果]①分离的BMSC呈长梭形.呈骨髓间质干细胞表型.经条件培养基诱导分化15 d后,诱导分化的细胞形态呈梭形平滑肌样.表达平滑肌细胞特异性蛋白标志物α-肌动蛋白(α-SMC)和平滑肌肌球蛋白重链1(SM-MHC1),呈平滑肌细胞表型,命名为骨髓间质干细胞分化的平滑肌细胞(BMSC-SMC).②羟脯氨酸测定结果显示,未处理BMSC-SMC合成较高量的胶原,其合成量低于VSMC的合成量,经80 mg/L ox-LDL处理72 h后,BMSC.SMC合成胶原的能力显著降低(P＜0.01).③细胞牯附实验结果发现,未处理BMSC-SMC有中等数量的细胞发生粘附,经80 mg/L ox-LDL处理1 h后,BMSC-SMC细胞粘附的数目少量增加,但两者比较差异无统计学意义(P＞0.05);经80 mg/L ox-LDL处理24 h后,BMSC-SMC细胞迁移的数目显著增多,与未处理BMSC-SMC比较,差异具有统计学意义(P＜0.01).[结论]①经条件培养基诱导培养后,骨髓干细胞表达平滑肌特异性标志物,SMα-SMC和SM-MHC1提示骨髓干细胞能成功分化成平滑肌细胞.②骨髓干细胞诱导成平滑肌细胞后,具有血管平滑肌细胞的一些生物学特征,如增殖能力和分泌胞外基质能力,同时保留了骨髓干细胞的一些生物学特征,如高迁移能力,为其在促动脉粥样硬化因素作用下.跨内皮细胞层和增殖的平滑肌细胞层迁移创造了有利的条件.
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犬骨髓基质干细胞分离培养与向软骨样细胞诱导分化的研究
[目的]探讨犬骨髓基质干细胞的提取、分离和体外扩增的佳条件,研究其在体外培养中定向诱导分化为软骨样细胞的可能.[方法]从幼年犬骨髓中分离基质干细胞进行培养扩增,观察其生长特性,体外应用碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和转化生长因子β1(TGF-β1)对第3代传代细胞诱导分化,并通过细胞的染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴定诱导分化细胞的类型.[结果]原代培养时形成由基质干细胞组成的细胞集落融合周期约6～9 d左右.第3代传代细胞经碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和转化生长因子(TGF-β1)诱导后,传代细胞在形态上呈软骨样改变;甲苯氨蓝异染性、阿新蓝染色阳性;Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性.[结论]犬骨髓基质干细胞在体外培养条件下生长良好和持续扩增,在碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和转化生长因子(TGF-β1)作用下可被诱导分化为软骨样细胞.
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兔结膜基质诱导人骨髓间质干细胞分化的初步研究
[目的]观察人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在保存人羊膜及兔眼表结膜基质上分化的情况.[方法]24只新西兰兔随机分为2组.实验组:培养有人MSCs的羊膜移植组,将人MSCs接种在保存人羊膜上培养4 d,用5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记后移植到兔眼表结膜缺损区;对照组,单纯羊膜移植组.分别于移植后1,2,3,4,6和8周,摘取各组实验眼行组织学和免疫组织化学检查,组织学检查移植到兔结膜基质的MSCs的存活、形态变化以及移植局部的反应等情况;免疫组织化学检测移植到结膜基质的带有BrdU标记的细胞角蛋白3/12(CK3/CK12)和角蛋白13(CK13)的表达.[结果]MSCs接种到羊膜后能在羊膜上生长,与羊膜共培养4 d后,MSCs贴附羊膜生长迅速,组织学特征无明显改变.用羊膜负载MSCs移植到兔结膜缺损区,术后免疫组织化学检测结膜上皮层CK13表达阳性,CK3/CK12表达阴性,在重建的结膜上皮层可检测到BrdU核阳性细胞,未见异常增殖细胞.[结论]人羊膜可作为MSCs的载体,采用人羊膜负载MSCs行兔结膜移植,MSCs能在兔结膜上皮层存活并增殖.
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小鼠骨髓干细胞有诱导分化为胰岛素分泌细胞的可能性
[目的] 探讨小鼠骨髓干细胞有无被诱导分化为胰岛素分泌细胞的可能性.[方法] 培养小鼠骨髓干细胞,采用含 GLP-1和 nicotinamide的无血清培养液诱导分化,在培养过程中,检测有关基因的表达.[结果]培养的小鼠骨髓干细胞具有与文献报道相似的生物学特性;在诱导分化第 7天,有 ngn3和 pdx-1基因表达;在诱导分化第 14天,有 nkx2.2、 pdx-1和 ins2基因表达.[结论] 小鼠骨髓干细胞有诱导分化为胰岛素分泌细胞的可能性,值得进一步研究.
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桂皮酸诱导白血病肝癌肺癌细胞的分化和抗肺癌细胞侵袭作用
[目的] 探讨桂皮酸对人早幼粒白血病细胞(HL-60)、人肝癌细胞(BEL-7402)、人肺癌细胞(PGCL3)分化和抗PGCL3细胞侵袭的影响.[方法] 用组织学方法观察各种癌细胞分化的形态学表现;用硝基四氮唑蓝(NBT)还原试验定量测定HL-60细胞的机能分化;用放射免疫测定法(RIA)测定肝癌细胞AFP分泌量,用酶学方法测定该细胞的鸟氨酸氨基甲酰转移酶(OCT)、酪氨酸-α-酮戊二酸转氨酶(TAT)、碱性磷酸酶(ALP)和γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)的比活力;用层粘连蛋白粘附测定法、纤粘蛋白趋化迁移测定法和重建基底膜侵袭测定法测定肺癌细胞的粘附、运动和侵袭能力.[结果] 1 mmol/L和2.5 mmol/L桂皮酸处理使HL-60细胞形态向成熟方向分化,NBT反应显著增强(P<0.01和P<0.05).1 mmol/L和3 mmol/L桂皮酸处理使BEL-7402和PGCL3细胞出现分化改变,使BEL-7402细胞AFP分泌量和γ-GT比活力显著下降(P<0.05和P<0.01),反映肝癌细胞分化的OCT、TAT和ALP 3种酶的比活力则显著升高(P<0.01和P<0.05),使PGCL3细胞软琼脂集落形成率下降,细胞的粘附能力下降(3 mmol/L P<0.01),运动和侵袭能力均显著降低(P<0.001).[结论] 桂皮酸具有诱导HL-60、BEL-7402和PGCL3细胞分化并有抗PGCL3细胞侵袭的作用.
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BMP-Smad信号通路在小鼠胚胎干细胞诱导分化成骨细胞方案优化中的应用
目的 利用BMP-Smad信号通路在成骨分化中的作用,筛选出较稳定且成骨率较高的小鼠胚胎干细胞体外定向诱导分化成骨细胞的方案.方法 小鼠胚胎干细胞经悬浮培养形成拟胚体(embryoidbodies, EBs),用胰酶消化成单个细胞接种至6孔板中,在EBs单细胞贴壁生长的第14～21天,A组(方案1)添加50 μg/mL维生素C +50 mmol/L β - 磷酸甘油 + 10-8mol/L地塞米松;B组(方案2)添加50 μg/mL维生素C + 10 mmol/L β - 磷酸甘油+ 1 μmol/L地塞米松;C组(方案3)添加50 μg/mL维生素C + 50 mmol/L β - 磷酸甘油+1 μmol/L地塞米松;D组为正常对照组,不添加诱导剂.各组均在在贴壁第7、14、21、28天检测碱性磷酸酶(ALP)活性,第22天用1％茜素红染色鉴定成骨细胞.采用荧光定量PCR(q-PCR)和Western blot检测BMP-Smad信号通路中的BMP2、BMPR2、Smadl和Smad5等关键mRNA和蛋白的表达组平.结果 与正常对照组相比,各组均在EBs贴壁第7天后ALP活力逐渐增强,且均在第21天增至强.茜素红染色结果 显示,阳性细胞被染成橘红色、呈大小不等的结节状.计算成骨细胞诱导形成率,A组、B组、C组和D组成骨细胞形成率分别为15.34％、23.71％、29.12％和0.66％.Q - PCR和Western blot检测结果 显示,与正常对照组相比,各组BMP2、BMPR2、Smad1和Smad5的mRNA和蛋白表达水平有不同程度的升高和降低,其中C组(方案3)的BMP2、BMPR2、Smad1和Smad5的相对表达量均升高,且差异有统计学意义(P＜0.05).结论 添加50 |xg/mL维生素C +50 mmol/Lβ-磷酸甘油+ 1 μmol/L地塞米松的方案成骨细胞诱导形成率多,可大量诱导骨结节的形成.
关键词： 小鼠胚胎干细胞 BMP-Smad信号通路 诱导分化 成骨细胞 -
骨髓间充质干细胞分化的类施万细胞对大鼠脊髓损伤的作用
目的 探讨在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为类施万细胞的方法 及其对脊髓损伤的修复作用机制.方法 分离纯化、传代大鼠BMSCs并诱导分化为类施万细胞,倒置显微镜及荧光显微镜下观察细胞形态变化、鉴定,将生理盐水、类施万细胞分别移植于急性脊髓损伤模型分为生理盐水组和类施万细胞移植组(n=20),应用辣根过氧化物酶(HRP)逆行追踪观察两组脊髓损伤神经元细胞的凋亡情况.结果 BMSCs传代后细胞生长迅速、细胞形态无改变,诱导分化为具有典型的施万细胞形态;施万细胞移植后2、4周在损伤脊髓内可以持续稳定地表达,减缓神经元细胞凋亡,两组比较均差异有统计学意义(P<0.01).结论 大鼠BMSCs 在体外可定向诱导分化为类施万细胞,移植作用于急性损伤脊髓具有减缓神经元细胞凋亡,促进神经纤维再生,修复损伤脊髓中枢.
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骨形态生成蛋白-4与17β-雌二醇诱导MBA-1细胞分化的研究
目的 探讨BMP-4与17β-雌二醇诱导MBA-1细胞分化的作用.方法 用骨形态生成蛋白-4(BMP-4)诱导MBA-1细胞15～22 d后进行HE染色观察细胞形态,用1型胶原染色、矿化结节染色鉴定成骨细胞功能;用BMP-4及17β-雌二醇干预MBA-1细胞后,用RT-PCR检测骨钙素的变化.结果 ①MBA-1细胞可向成骨细胞或脂肪细胞分化;②在无BMP-4或17β-雌二醇干预的情况下,MBA-1细胞在自身分化成熟过程中伴有骨钙素的表达增加;③经BMP-4与17β-雌二醇干预后,MBA-1细胞骨钙素的表达明显增加.结论 MBA-1细胞可能具有多系分化潜能,BMP-4与17β-雌二醇可上调其骨钙素表述,诱导MBA-1细胞向成骨细胞方向分化.
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不同来源树突状细胞体外诱导比较
目的对脐血和外周血源性树突状细胞(DC)体外诱导进行比较,探索技术更好的DC来源.方法脐血和外周血分离取白细胞后,分别加入GM-CSF,TNF-α和GM-CSF,IL-4培养基中,培养12 d,于4,8,10 d进行CD10,CD83及HLA-DR表型分析,并在第12天与淋巴细胞混合培养,对比两种源性DC激发淋巴细胞增殖的能力.结果脐血诱导的DC细胞数明显多于外周血诱导的细胞数(P＜0.01).结论脐血和外周血均可成功诱导成熟DC,脐血诱导的DC细胞数高于外周血.
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脂肪来源干细胞治疗心肌梗死的研究进展
心肌梗死(myocardial infarction)是冠心病的严重类型[1],其所致的细胞坏死和瘢痕形成是影响心功能的主要因素,也是导致顽固性心力衰竭乃至死亡的病理基础.目前,临床用于治疗心肌梗死的方法均只能达到改善梗死区心肌血供,而无法逆转已经坏死的心肌细胞.近年来,心肌梗死的干细胞治疗受到了广泛关注,找到理想的干细胞成为现代医学研究的重要课题.脂肪组织来源干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs)不仅能诱导分化为心肌细胞,而且具有取材简便、一次获得量大、增殖能力强、培养周期短以及对患者影响小等特点,是心肌梗死干细胞治疗较为理想的选择.现就ASCs的来源、作用机制及其用于治疗心肌梗死近几年的研究进展作一综述.
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基因修饰骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死的研究进展
骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一类从成体骨髓组织分离、培养扩增、并且在体内或体外能保持其生长特性的干细胞.且在适当条件下可诱导分化为软骨细胞、脂肪细胞、骨细胞及心肌细胞等.充分利用BMSCs多种独特的细胞特性,并联合外源基因,可增强其治疗效应,适合应用于多种组织的治疗,特别是心血管系统.将BMSCs移植到梗死心肌组织后,能够防止病理性心室重构,增强心脏收缩功能,促进心功能恢复等作用.本文就目前实验室及临床研究关于BMSCs由供体分离扩增及其细胞特性、移植前的加工改造和如何移植到心肌损伤部位等进展,进行详细的阐述.
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毫米波联合无环鸟苷对K562细胞抑制增殖和诱导分化的研究
目的探讨毫米波联合无环鸟苷(ACV)对人白血病细胞的抗增殖和诱导分化作用,用于白血病细胞的体外净化.方法将毫米波和无环鸟苷分别单独以及联合作用于K562细胞,测定细胞比活力和联苯胺染色情况,组织化学染色及光镜观察形态.结果在ACV或联合毫米波的作用下,抑制了K562细胞的增殖和诱导其向红系分化,且毫米波对ACV有协同效应.结论可为自体干细胞移植探索新的途径.
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组织工程骨修复髂骨巨大骨囊肿1例
骨囊肿好发于儿童和青少年,常见部位是肱骨上段、股骨上段、胫骨上段和桡骨下段,囊肿呈膨胀性生长,囊腔内含浆液或浆液纤维素性液体.较小的囊肿可以用甲基强的松龙分次注射的方法治疗,有一定的疗效.而对较大的囊肿或者合并骨折时就需用手术的方法刮除囊内容物,清除囊壁,植入自体骨的方式来修复缺损.2001年1月我院收治了1例42岁男性患者,其右侧髂骨有一10 cm×7 cm×2 cm巨大囊肿,考虑到病变在左侧髂骨,取自体髂骨只能在右侧,而且囊肿刮除后骨缺损体积较大,取自体骨骨量不足,因此我们采用组织工程的方法,抽取自体骨髓,在体外分离,培养,扩增,再诱导分化为成骨细胞,与β-TCP人工骨颗粒复合植入囊肿刮除后的骨缺损处,随访9个月后,患者的髂骨缺损被成功修复.
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骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的实验研究
目的:采用地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C3种物质作为诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSCs)向成骨细胞分化的基本辅剂,定向诱导犬第2代BMSCs,探讨BMSCs向成骨细胞分化的潜能和成骨细胞的特征性鉴定方法.方法:无菌条件下行犬髂骨穿刺,采集骨髓15～ 20 mL,全骨髓10％ FBS DMEM培养液进行原代培养.将第2代纯化的BMSCs细胞悬液(调整细胞密度为1×105/mL)接种于含地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C的DMEM/FI2培养液的培养瓶(皿)中,体外扩增培养、传代.对细胞形态特征进行观察；行碱性磷酸酶(ALP)染色,骨桥素以及Ⅰ型胶原相关蛋白免疫荧光化学检测鉴定细胞性质.结果:原代培养的BMSCs形态呈长梭形或不规则形,呈均匀分布生长.诱导分化后的细胞形态呈长梭形或不规则形,呈均匀分布生长,传代后细胞体积略变大;BMSCs成骨诱导增殖后电镜下细胞呈多边形,可见ALP染色阳性；经成骨细胞诱导培养14 d后,细胞骨桥素以及Ⅰ型胶原相关蛋白表达阳性.结论:BMSCs易于体外分离培养及扩增,地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C体外定向诱导能够在短时间内获得大量成骨细胞,且所培养的细胞具有典型的成骨细胞形态和功能.
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国内首对同一父母来源HLA相同的人胚胎干细胞系的建立
目的:建立国内首对同父母来源的人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)系,为干细胞的定向诱导分化提供内参对照模型.方法:利用体外受精后第3天不适宜进行胚胎移植的低质量胚胎,采用机械切割法分离囊胚内细胞团(ICM),接种到丝裂霉素C处理的小鼠饲养层上,对建立的hESC进行多能性潜能检测.结果:成功建立一对具有多能特性的hESC系,体外长期培养维持正常核型,STR显示较高的亲缘性,HLA配型完全相同.结论:本研究建立了国内首对同一父母来源的HLA完全相同的hESC,其遗传背景一致,这为细胞的定向诱导分化体系筛选提供一个很好的内参对照,同时也为干细胞的移植排斥反应、培养扩增等研究提供很好的对比参照模型.
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人羊膜上皮细胞体外诱导分化为神经样细胞的研究
目的:探讨人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells,hAECs)体外向神经样细胞诱导分化的条件及可能性.方法:利用碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、化学诱导剂(alltransretinoic acid,RA)诱导人羊膜上皮细胞(WISH)向神经元转化,并以不含诱导剂的无血清的MEM培养基作为对照,观察分化过程中细胞形态的变化,利用免疫细胞化学方法检测神经元特异性标志物的表达情况.结果:诱导分化12 h后的细胞呈现双极、多极和锥形的典型神经元细胞的形态,免疫细胞化学显示诱导后的hAECs表现为NSE染色阳性,不表达神经胶质细胞标记物GFAP.结论:hAECs可以在体外诱导分化为神经元样细胞,这种潜能使其有可能成为神经系统疾病细胞移植治疗的种子细胞.
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骨髓干细胞体外培养诱导为心肌样细胞的研究
目的:探讨应用5-氮胞苷(5-aza)诱导体外培养人骨髓干细胞向心肌细胞分化的作用.方法:采用正常志愿者髂后上棘为穿刺点获得骨髓干细胞,体外培养传3代后应用5×10-6 mmol/L 5-aza(Sigma公司)诱导20 h后继续原条件培养,相差显微镜下观察细胞形态并照相记录.诱导后细胞行a-action Trophonin T免疫组化染色.行透射电镜观察,进一步行RT-PCR分析诱导后细胞表达a-cardiac action,Cardiac tropponin T等mRNA.结果:诱导组人a-action Trophonin T免疫组化染色阳性,电镜下观察到细胞与细胞间见类心肌闰盘样结构,见线粒体空泡及微丝样结构,PCR结果发现有a-cardiac action、Cardiac tropponin T mRNA的高表达.结论:初步证实人骨髓干细胞在体外被5-aza诱导时,能够向心肌细胞分化.
