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重组人白血病抑制因子对HL-60细胞的作用及机制研究
目的:观察rh-LIF对HL-60细胞生长与分化的影响及其可能的作用机制.方法:不同剂量的rh-LIF作用HL-60细胞3-6天,观察细胞生长,流式细胞术分析细胞周期,用免疫组化法检测P53,P21蛋白表达的变化,原位杂交法检测P53mRNA表达水平的改变.结果:rh-LIF可诱导HL-60细胞向单核/巨噬细胞分化,抑制HL-60细胞的增殖,使细胞停滞于G1期:P53,P21蛋白和P53mRNA表达明显增强.结论:rh-LIF对HL-60细胞具增殖抑制和诱导分化作用,其作用机制可能与G1期阻滞及P53,P21表达增高有关.
关键词： 重组人白血病抑制因子 诱导分化 生长抑制 -
人参多糖对人早幼粒白血病细胞株(HL-60)增殖的影响
目的:探讨人参多糖(GPS)对人粒单系造血祖细胞(CFU-GM)和人早幼粒白血病细胞株(HL-60)增殖分化的影响.方法:采用造血细胞体外培养,形态学观察,免疫细胞化学,流式细胞术等实验血液学技术.结果:GPS在体外能抑制HL-60细胞增殖,而同等剂量的GPS能明显促进正常粒单系造血祖细胞的增殖分化;在本实验条件下未见GPS对HL-60细胞有明显的诱导分化作用.结论:GPS可能通过阻止HL-60细胞从静止期(G0期)进入增殖周期(S/G2+M)期,抑制DNA的合成等途径进而抑制细胞的增殖;提示GPS有可能成为既能促进正常造血,又能抑制人白血病等肿瘤细胞增殖的天然诱导剂.
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大鼠骨髓间充质干细胞的培养鉴定以及向神经干细胞分化的实验研究
目的:体外培养并鉴定大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),研究其生物学特性,初步探索酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor,aFGF)诱导其向神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化的可行性.方法:全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠BMSCs,倒置相差显微镜观察其形态特征,MTF法绘制生长曲线,流式细胞仪(flow cytometry,FCM)测定细胞周期并鉴定细胞表面标志物.用80 ng/ml aFGF的无血清DMEM/F12培养液诱导大鼠BMSCs向NSCs 分化,镜下观察细胞形态特征,免疫荧光染色方法检测神经巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)的表达.结果:大鼠BMSCs贴壁生长,呈梭形,多角形.第1、3、5代BMSCs的生长曲线均呈S形,活性无明显差异.细胞周期显示94.34％ BMSCs处于G0/G1期,有较强的分裂增殖能力.FCM检测CD29、CD54、CD90表达阳性,CD45表达阴性.诱导6h后细胞的胞体收缩成椭圆形或球形并伸出细长突起,免疫荧光染色显示Nestin表达阳性,继续诱导发现双极和多极细胞增多,诱导6d后相互连接成网状,成典型的神经元样细胞,NSE表达阳性.结论:全骨髓贴壁培养法能培养出高纯度的BMSCs,细胞生长稳定、增殖快、可多次传代,具有干细胞特性.经aFGF诱导后具有向NSCs分化的潜能,NSCs能进一步分化为神经元样细胞.
关键词： 骨髓间充质干细胞 全骨髓贴壁培养法 诱导分化 神经干细胞 酸性成纤维细胞生长因子 -
全反式维甲酸诱导肝前体细胞向肝细胞分化的研究
目的:探讨全反式维甲酸(All-trans retinoic acid,ATRA)对肝前体细胞分化的影响.方法:取孕14.5 d胎鼠制备肝前体细胞,瞬时转染带白蛋白启动子(Albumin promoter)的荧光素酶报告质粒pALB-Luc,以便实时检测细胞的分化状态.优化ATRA诱导条件,分别于诱导后3、6、9d收集细胞总RNA,半定量RT-PCR检测分化相关指标的变化.并于诱导后11d用苏木精-伊红染色法观察细胞形态的改变,PAS染色观察细胞的分化成熟程度.结果:ATRA浓度为1μmol/L时对肝前体细胞分化诱导作用强.与对照组相比,随培养时间的延长,ATRA组分化早期指标膜蛋白(Delta like,DLK)、细胞角蛋白(Cytokeratin 19,CK19)表达降低更为明显,而甲胎蛋白(Alpha fetal protein,AFP)、白蛋白(Albumin,ALB)表达更为升高.形态学观察细胞体积增大,呈多边形,核浆比率降低,相嵌紧密排列,可见双核细胞.PAS染色阳性率上升.结论:浓度1μmol/L的ATRA对肝前体细胞分化诱导作用强,ATRA能诱导肝前体细胞分化为类肝细胞.
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曲古抑菌素干预骨髓间充质干细胞向心肌细胞特化体外实验
目的:在体外以新生大鼠心肌细胞(Cardiomyocytes,CM)与骨髓间充质干细胞((Mesenchymal stem cells,MSCs)共同培养的方式模拟体外心肌微环境,研究间质干细胞在HDAC酶抑制剂曲古抑菌素(Trichostatin A,TSA)干预后乙酰化酶活性与MSCs向心肌细胞特化之间的联系.方法:分离大鼠MSCs将已标记的MSCs与心肌细胞、分别加入不同浓度TSA干预后的MSCs与心肌细胞混合培养.贴壁法分离大鼠MSCs在体外培养纯化后进行细胞标记.培养至第4代.根据实验需要分为3组:阳性对照组,实验组,阴性对照组.用4.6-二乙酰基-2-苯基吲哚(DAPI)和5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)对核进行双标.分别在共培养1周后用免疫荧光染色检测MSCs细胞中的心肌结构功能蛋白:肌球蛋白重链(Myosin heavy chain,MHC)、心肌组织缝隙连接的特异性组成蛋白质Connexin43(Cx43)的表达情况.结果:①MSCs与搏动的心肌细胞共培养1周,MSCs开始出现心肌样分化说明建立了心肌微环境;②阳性对照组中,MSCs经TSA干预48 h后与心肌细胞混合培养.出现心肌样分化并表达心肌结构功能蛋白表达.③阴性对照组中的部分MSCs可少量表达心肌结构功能蛋白.在共培养的7 d,经TSA诱导后经Brdu-DAPI双标MSCs的核,MHC和Cx43荧光显示分化率与阳性对照组的分化率有显著差别.结论:MSCs与经HDAC酶抑制剂干预后的MSCs在心肌微环境中,HDAC酶抑制剂对MSCs向心肌样细胞的特化有促进作用,提示乙酰化酶活性与细胞特化之间的存在联系.
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人参皂苷Rg1抑制白血病细胞K562增殖并诱导分化的分子机制
目的 研究人参皂苷的重要单体Rg1对人白血病细胞K562的增殖抑制作用并诱导其向成熟分化的分子机制.方法 取对数生长期K562细胞,分设人参皂苷Rg1组和常规培养组,以流式细胞仪检测24、48、72 h Rg1对K562细胞增殖的影响;Wright's染色测定细胞形态和酶标仪测定血红蛋白合成来观察Rg1作用24、48、72 h后K562细胞向成熟细胞分化的特征;激光共聚焦显微镜检测Rg1作用48 h对K562细胞STAT5蛋白分布的影响;Western blot法检测Rg1作用24、48、72 h对K562细胞STAT5蛋白表达的影响.结果 流式细胞仪检测提示Rg1作用后K562细胞S期比例增加,48 h达高峰(P＜0.05);酶标仪测定显示Rg1作用后,K562细胞合成血红蛋白(Hb)的量与对照组相比具有显著性提高(P＜0.05);Wright's染色显示经Rg1诱导后,K562细胞体积缩小,细胞核直径减小,细胞核和细胞质的比例降低,细胞向成熟方向分化;激光共聚焦显微镜观察显示经Rg1诱导后,K562细胞细胞质内的STAT5荧光强度增加,而细胞核内STAT5荧光强度减弱;Western blot法检测显示Rg1作用K562细胞后,细胞质内STAT5的表达水平增加,细胞核内STAT5的表达水平减少,作用48 h变化明显.结论 人参皂苷单体Rg1可抑制人白血病细胞K562增殖并诱导其向成熟方向分化;Rg1改变K562细胞内STAT5的分布和减少K562胞核中STAT5的表达,这可能是Rg1抑制K562细胞增殖并诱导其分化的作用机制之一.
关键词： 人参总皂苷单体Rg1 K562细胞 增殖抑制 诱导分化 STAT5 -
血管紧张素Ⅱ诱导成人脂肪间充质干细胞分化为心肌样细胞的实验研究
目的 采用血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)作为诱导剂,体外诱导成人脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADMSCs)向心肌细胞方向分化.方法 自成人脂肪组织中分离培养ADMSCs,分别用0.05、0.10和0.20 μmol/L 3种不同浓度的AngⅡ诱导ADMSCs,同时设立对照组,倒置相差显微镜及透射电子显微镜下观察细胞的形态学特征,免疫细胞化学染色方法检测心肌特异性肌钙蛋白-I(cardiac troponin-I, cTn-I),计算转化率.结果 诱导后第3周时,0.20 μmol/L组可见cTn-I阳性细胞表达,第4周时0.10 μmol/L组和0.20 μmol/L组均有cTn-I阳性细胞表达,但0.20 μmol/L组的阳性细胞数明显多于前组,且细胞形态变化显著.结论 AngⅡ在体外可以诱导ADMSCs分化为心肌样细胞,其诱导分化的佳浓度为0.20 μmol/L.
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去甲二氢愈创木酸对SHG-44胶质瘤细胞GFAP基因表达的影响
目的 探讨去甲二氢愈创木酸（NDGA）诱导恶性胶质瘤细胞分化过程中对GFAP基因表达的影响及其意义。方法 用免疫组织化学和原位杂交方法定性、定量检测人恶性胶质瘤细胞系SHG-44细胞GFAP基因的表达水平。结果 NDGA处理后，瘤细胞GFAP蛋白及mRNA表达水平明显增高（P<0.01）。结论 NDGA具有诱导恶性胶质瘤细胞GFAP基因表达的作用，推测GFAP基因表达上调可能是NDGA诱导胶质瘤细胞分化的作用机制之一。
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去甲二氢愈创木酸对恶性胶质瘤细胞增殖和分化的影响
目的观察去甲二氢愈创木酸(NDGA)对人恶性胶质瘤细胞系SHG-44细胞增殖和分化的影响.方法:细胞培养、免疫组化、光镜和电镜观察及流式细胞仪检测.结果:①在200 μmol/L浓度范围内,NDGA对SHG-44细胞有增殖抑制和诱导分化作用,且这种作用与浓度呈正相关;②在NDGA处理96 h内,NDGA对SHG-44细胞的增殖抑制作用以处理后24 h明显;③NDGA处理后,SHG-44细胞增殖受阻于G1→S期.结论:NDGA对SHG-44细胞有明显的增殖抑制和诱导分化作用,且这种作用有周期特异性.
关键词： 去甲二氢愈创木酸(NDGA) 胶质瘤 诱导分化 -
诺帝对HPV16型亚基因永生化人宫颈上皮细胞的诱导分化作用
目的 研究诺帝(Nordy)对HPV16型亚基因(E6、E7)永生化人宫颈上皮细胞(H8细胞)的诱导分化作用.方法 MTT法检测诺帝对H8细胞增殖的抑制作用,流式细胞术(FCM)分析细胞周期,免疫细胞化学S-P法检测增殖细胞核抗原Ki67的表达,TRAP-ELISA法检测端粒酶活性变化.结果 诺帝能够明显抑制H8细胞增殖;可阻滞细胞周期于G0/G1期,S期细胞减少;细胞核内Ki67蛋白的表达水平明显下降;端粒酶活性明显降低.结论 诺帝对H8细胞有诱导分化作用,这种作用可能是通过抑制增殖,阻滞细胞周期,降低端粒酶活性来实现的.
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大鼠成体肝卵圆细胞分离培养及诱导分化的初步研究
目的 通过成体大鼠肝卵圆细胞分离培养获取纯净的干细胞并观察诱导分化前后从肝卵圆细胞到肝细胞的形态变化.方法 采用AAF/PH肝干细胞刺激模型,胶原酶Ⅳ消化分离和Percoll梯度离心纯化肝卵圆细胞的方法,用地塞米松、DMSO和EGF、HGF、SCF、LIF等生长因子联合应用诱导肝卵圆细胞增殖和分化为肝实质细胞.观察肝卵圆细胞到肝细胞形态变化过程,用免疫荧光技术,Western blotting分析检测了干细胞标志c-kit和RT-PCR分析法检测肝干细胞白蛋白和CK19 mRNA表达鉴定卵圆细胞.结果 分离得到的肝卵圆细胞活度达到90%,细胞形态包括大小和颜色呈不均质,卵圆细胞直径是肝细胞直径的1/4～1/6.诱导后出现大而圆的肝细胞,可见卵圆细胞到肝细胞的中间变化过程,新分离的肝卵圆细胞在生长因子诱导下有向肝细胞分化的特性.经c-kit免疫荧光染色显黄绿色荧光,Western blotting检测肝卵圆细胞有c-kit蛋白条带,而大鼠肝细胞及胆管细胞则未出现条带.PCR分析显示卵圆细胞有CK19和白蛋白mRNA表达.结论 新分离的肝卵圆细胞同时表达c-kit,CK19和白蛋白3种抗原,诱导分化出现一系列从卵圆细胞到肝细胞的形态学变化,这种现象证明分离的肝卵圆细胞就是肝干细胞,经诱导分化可以产生成熟的肝细胞,成为进一步研究肝干细胞生物学特性的基础.
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人参多糖对K562细胞增殖抑制及诱导分化的实验研究
目的研究人参多糖(GPS)对人白血病细胞株(K562)增殖抑制及诱导分化的影响.方法采用细胞体外培养技术,MTT法检测细胞增殖抑制,光镜和电镜观察细胞形态变化;联苯胺(Benzidine)、糖原染色(PAS)、过氧化物酶(POX)、非特异性脂酶(α-NAE)细胞化学染色分别检测K562细胞向红系、粒系、巨核系分化的特征;免疫细胞化学检测细胞表面分化抗原及因子表达(CD14、CD15、HIR2、EPO、GM-CSF);FAS及FAS-L等检测细胞凋亡情况.结果 GPS对K562细胞的增殖有明显抑制作用并能诱导K562细胞向红系或粒系细胞分化,表现为:①K562细胞的增殖受到抑制;②K562细胞形态学上可见细胞体积缩小,核直径减小,核仁减少或消失,核染色质浓缩,胞浆丰富,核浆比例降低,可见中晚期粒、红系细胞;③K562 细胞血红蛋白(Hb)、糖原、α-NAE的表达明显增加, 而过氧化物酶(POX)的表达与对照无显著性差异;④细胞表面分化抗原CD15、HIR2、EPO、GM-CSF的表达明显增强,CD14的表达与对照无显著性差异;⑤细胞凋亡明显增加.结论人参多糖(GPS)能明显抑制K562细胞增殖并能诱导其凋亡并使K562细胞向成熟方向分化.
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心肌细胞介导骨髓间充质干细胞的心肌样分化
目的探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在不同培养条件下定向分化过程中的生物学特性变化及其机制.方法贴壁法分离大鼠MSCs,培养至第6代.实验分3组:条件培养基组,用新生鼠心肌细胞培养上清液制成的条件培养基处理MSCs48 h 2次,其间间隔48 h;混合培养组,新生鼠心肌细胞和MSCs按1:1的比例混合培养1周;对照组,MSCs常规培养.检测各组MSCs中心肌细胞结构功能蛋白:心肌肌联蛋白(titin)、肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)、心肌组织缝隙连接的特异性组成蛋白质Connexin43(Cx43)的表达情况.结果①条件培养基可诱导MSCs心肌样分化,表达心肌细胞骨架蛋白titin的Z带及A带部分,Cx43大量表达,但在检测期内未观察到MHC的表达;②MSCs在混合培养中与心肌细胞形成连接,表达titin,部分细胞内可检测到类似肌小节的结构,Cx43集中分布于细胞相邻的界面;③对照组中的部分MSCs可少量表达Cx43及titin.结论源于心肌细胞的各种因素可促使MSCs心肌样分化,分化的程度取决于作用信号的性质.
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体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究
目的探讨用5-氮胞苷(5-aza)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的佳条件.方法用Percoll密度梯度离心法分离培养、纯化大鼠MSCs,取第3代MSCs随机分为A、B、C 3组,分别加入5、10、20 μmol/L5-aza;每组分别孵育12、24、48 h,继续培养28 d.相差显微镜观察细胞形态变化,免疫组化法检测细胞肌动蛋白(α-actin)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)表达,并通过Western印迹法对细胞cTnT进行定量分析.结果MSCs经5-aza诱导培养28 d后,电镜下见细胞胞浆有散在肌丝样结构,免疫组化检测α-actin和cTnT表达均呈阳性;5 μmol/L的5-aza孵育48 h、10 μmoL/L孵育24 h培养28 d的细胞cTnT表达量与10 μmol/L的5-aza孵育48 h、20 μmol/L 3种孵育时间各组比较无显著性差异,且细胞生物学特性未受到明显影响.结论MSCs在体外经5-aza诱导后可分化为心肌样细胞;5 μmol/L的5-aza孵育48 h和10 μmol/L的5-aza诱导24 h是MSCs体外诱导分化心肌样细胞的理想条件.
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人参皂甙协同EPO和GM-CSF对K562细胞诱导分化的实验研究
目的研究人参总皂甙(Total saponins of panax ginseng, TSPG)协同细胞因子(EPO、GM-CSF)对人红白血病细胞株(K562)诱导分化的影响.方法采用细胞体外培养技术,光镜和电镜观察细胞形态变化;联苯胺染色、POX染色、α-NAE细胞化学染色分别检测细胞血红蛋白、过氧化物酶、非特异性脂酶α-NAE;免疫细胞化学检测细胞表面分化抗原CD15、HIR2、EPO-R、GM-CSF-R.结果 TSPG协同细胞因子对K562细胞的诱导作用与TSPG单独作用相比,①K562细胞形态学更趋向于成熟;②K562细胞血红蛋白(Hb)、过氧化物酶(POX)的表达明显增加;③细胞表面分化抗原CD15、HIR2、EPO-R、GM-CSF-R的表达明显增强.结论 TSPG协同细胞因子作用能明显诱导K562细胞向成熟方向分化.
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丁酸钠对人脑胶质瘤细胞系SHG-44增殖分化的影响
目的研究丁酸钠对培养人脑胶质瘤SHG-44细胞的增殖抑制和分化诱导.方法以2 mmol/L丁酸钠处理SHG-44细胞,用MTT比色、核仁组成区银染观察细胞增殖抑制,用流式细胞术、电镜观察超微结构、免疫组织化学染色、凝集试验鉴定细胞分化.结果 SHG-44细胞经丁酸钠处理后:①细胞增殖受到明显抑制,并具有时间、剂量依赖性;②细胞周期受阻,S期细胞比例减少;③电镜观察发现细胞核变规则,异染色质增多,胞浆中线粒体、粗面内质网等细胞器增多并趋于正常;④胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein, GFAP)表达增强,改型蛋白(Vimentin)表达减弱;⑤细胞凝集度明显变低.结论丁酸钠能抑制人脑胶质瘤SHG-44细胞的增殖,2 mmol/L丁酸钠能诱导SHG-44细胞发生明显分化.
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体外诱导脐血造血细胞定向分化的研究
目的探讨造血生长因子体外诱导脐血造血细胞向粒系细胞分化的能力.方法从新鲜的脐血标本中分离的单个核细胞接种于含脐血血清和造血生长因子的IMDM培养液中悬浮培养5周,采用有核细胞计数、免疫荧光染色计数和祖细胞集落测定对有核细胞总数、CD34+细胞和粒单系祖细胞进行动态检测.结果用粒系集落刺激因子、粒单系集落刺激因子、干细胞因子、白介素-3和白介素-6培养脐血单个核细胞3周,可以显著扩增有核细胞总数和CFU-GM,扩增倍数分别为培养前的58.3倍和12.2倍,且培养后的细胞以中性粒细胞为主.而CD34+细胞占细胞总数的比例则从0.97%下降到0.05%.按照此培养条件,可以使单份新鲜脐血样本中有核细胞总数增加(5.1±2.3)倍,CFU-GM增加(2.2±0.95)倍.结论本培养体系在体外可以诱导脐血造血细胞向粒系定向诱导分化,从而增加单份脐血中粒单系祖细胞和粒细胞数量.
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双向电泳分析比较维甲酸诱导HL60细胞分化的蛋白表达差异
目的以维甲酸诱导急性早幼粒白血病细胞HL60分化为模型,用双向电泳技术分析比较维甲酸诱导HL60细胞分化的蛋白表达差异.方法用细胞生物学的方法分析分化细胞形态上的差异,NBT实验检测细胞NBT阳性率.用双向电泳技术分析分化肿瘤细胞蛋白表达差异.结果分化后细胞形态发生明显变化,细胞表面出现突起,细胞核变小.分化后细胞NBT阳性率达90%以上,而未分化细胞NBT阳性率低于5%.双向电泳技术分析发现有7个蛋白点只未分化细胞检测到表达,而分化细胞未检测到;有14个蛋白点只在分化细胞检测到.结论双向电泳技术可直接反映细胞蛋白表达变化.
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人真皮成纤维细胞诱导分化研究
目的：体外分离培养人包皮成纤维细胞（HFF），探讨其成骨、成脂、成软骨分化潜能，为骨创伤或其他修复治疗提供新的种子细胞来源。方法采用机械法结合酶消化法分离、培养 HFF。取第3代细胞用免疫细胞化学法检测其波形蛋白（Vim-entin）和角蛋白19（CK19）的表达。通过向成骨、成脂、成软骨细胞诱导分化（诱导培养基根据说明书配制），鉴定其多向分化潜能。结果原代细胞24 h内完全贴壁，细胞形态不规则，多为圆形或多角形，传代后细胞形态均一，基本为长梭形，鱼群样、漩涡样生长。免疫细胞化学结果显示该细胞表达Vimentin ，不表达CK19，经诱导可以向成骨、成脂、软骨细胞方向分化。结论 HFF在特定条件能多向分化，其本身也参与骨折愈合的全过程，加之来源方便，增殖能力强，有望为骨折或较大骨缺损患者修复治疗及组织工程学提供理想种子细胞。
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脐带血间充质干细胞向神经细胞诱导分化及应用
自2000年Erices等［1］报道脐带血中含有丰富的造血干细胞和间充质干细胞以来，因脐带血间充质干细胞的多向分化潜能，免疫调节作用和无伦理问题等优点，备受研究者的关注。随后，有学者分别报道了脐带血间充质干细胞在体外可诱导表达神经元标志物和神经胶质细胞标志物［2-3］。目前人们已经可以成功地体外分离培养脐带血间充质干细胞，并且对其生物学特性、表面标志和免疫原性有了进一步的了解。近年来成功地诱导脐带血间充质干细胞分化为骨、脂肪、软骨、肝脏及神经等成体细胞，展示了脐带血间充质干细胞的无限分化潜能和广阔的应用前景。从而为体外诱导脐带血间充质干细胞分化各种成体细胞和各种疾病的治疗提供了新的思路。
