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微囊化软骨细胞诱导间充质干细胞定向分化治疗兔椎间盘退变的实验研究
目的 探讨经微囊化软骨细胞诱导分化的间充质干细胞对兔椎间盘退变的治疗效果.方法 将微囊化软骨细胞与间充质干细胞进行共培养,干细胞诱导分化.观察分化后干细胞的免疫学特征、增殖曲线、蛋白多糖及Ⅱ型胶原蛋白合成能力.建立兔椎间盘退变模型,并观察分化后的间充质干细胞对兔椎间盘退变的修复能力.结果 经微囊化软骨细胞分化诱导7d后的间充质干细胞,增殖能力未受到明显影响,同时具备了软骨细胞的部分表面特征,能够合成蛋白多糖及Ⅱ型胶原蛋白,且能力优于Transwell对照组.将干细胞植入兔椎间盘退变模型中,在术后16周内,椎间盘的力学性能得到修复,形态及结构也得到了明显改善.结论 与传统的Transwell诱导体系相比,微囊诱导体系具有更高的诱导效率;经微囊化软骨细胞诱导的MSCs,植入椎间盘退变模型动物体内后,能更好地维持椎间盘的形态、结构及力学特征.
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3-HB协同bFGF诱导促进神经干细胞向神经元方向分化
目的 研究3-羟基丁酸(3-HB)与bFGF或EGF协同作用对神经干细胞(NSCs)活力及分化的影响.方法 分离培养孕14～15d大鼠胚胎脑皮质NSCs,以不加处理的实验组为对照,在bFGF(10ng/mL)或EGF(20ng/mL)处理条件下分别以不同浓度3-HB(0、0.02、0.2、2mmol/L)处理P3代NSCs.分别检测细胞活力,免疫细胞化学染色MAP2观察NSCs 向神经元方向的分化情况,RT-qPCR检测转录因子SOX2、PAX6和神经元核定位因子NeuN的mRNA表达水平.结果 3-HB协同bFGF处理NSCs能够提高NSCs的细胞活力.0.02mmol/L 3-HB处理组NSCs分化的MAP2阳性细胞比例增加,PAX6和NeuN的mRNA水平升高.外源添加bFGF的条件下,0.02mmol/L处理组3-HB促进NSCs向神经元方向分化的效果更明显.结论 低浓度3-HB能够促进NSCs向神经元方向的分化,0.02mmol/L的3-HB与bFGF协同作用对NSCs向神经元方向分化的促进作用更明显,其可能通过影响SOX2、PAX6及NeuN的表达而发挥此调控作用.
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人骨髓间充质干细胞定向血管内皮细胞诱导分化前后eNOS表达/活性及其代谢产物的差异
目的 探讨人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)定向血管内皮细胞诱导分化前后内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因表达、活性及其代谢产物的差异.方法 建立hBMSCs定向血管内皮细胞诱导分化系统.应用倒置显微镜观察细胞形态的改变,Transwell实验检测细胞的迁移能力,细胞免疫荧光及Western blot检测eNOS的蛋白表达,ELISA法检测eNOS的活性,硝酸还原法检测细胞培养上清液NO含量.结果 与未分化组相比,分化后的细胞形态发生明显改变;细胞的迁移能力增强238.10％ (73.000±7.002 vs.21.000±4.359,P＜0.05);eNOS蛋白的表达增加114.72％(0.423±0.011 vs.0.197±0.079,P＜0.05);eNOS的活性增强157.49％(4.967±0.073 vs.1.929±0.103,P＜0.05);NO合成与释放增加155.67％(184.909±1.853 vs.72.323±0.426,P＜0.05).结论 hBMSCs定向内皮细胞诱导分化后eNOS基因表达增加、活性增强,其代谢产物NO的合成与释放增加.本结果可能为干细胞在心血管疾病等防治提供依据.
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兔动员外周血间充质干细胞集落形成能力与神经元诱导分化研究
目的 研究动员后兔外周血间充质干细胞(PBMSCs)的存在频率,并对PBMSCs进行神经元诱导分化鉴定.方法 采用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)皮下注射动员,结合密度梯度离心和贴壁培养法分离、培养兔外周血样品中的PBMSCs,利用集落形成率分析动员兔PBMSCs的存在频率,并对PBMSCs的神经元分化能力进行体外诱导鉴定.结果 动员后的PBMSCs原代培养24h后,可见较多短梭形及多角形贴壁细胞,3～4d后出现集落样生长,传代培养的PBMSCs形态均一、呈长梭形漩涡状生长;未动员的外周血样品中的贴壁细胞少,集落形成少,且易老化,无法传代.集落形成率实验显示,动员后的PBMSCs在每百万外周血单个核细胞中有2.8～10.8个;而未动员组PBMSCs仅有0～3个.免疫细胞化学染色显示,PBMSCs经神经诱导7d后其神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经元特性核蛋白(NeuN)染色阳性.结论 动员剂可提高兔外周血中的PBMSCs含量,所获取的PBMSCs具备神经元分化能力.
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胰岛素产生细胞的诱导分化及微囊对其分泌能力的影响
目的 探讨微囊对胰岛素产生细胞(insulin-producing cells,IPCs)分泌能力的影响.方法 分离培养小鼠骨髓间充质于细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)并传代纯化,应用大鼠胰腺提取物(rat pancreatic extract,RPE)对其进行诱导分化,诱导后的细胞随机分为微囊化组和未微囊化组.分别在1、2、3、4、5周等不同时间点,通过葡萄糖刺激实验,检测细胞的胰岛素与C肽释放情况.结果 葡萄糖刺激实验结果显示,1周时微囊化IPCs与未微囊化的IPCs均能释放胰岛素,其量没有显著的差别；培养2周后未微囊化的IPCs胰岛素和C肽释放量开始下降,而微囊化IPCs胰岛素与C肽释放量在培养4周后才开始逐渐下降.结论 微囊可延长IPCs的作用时间,有利于IPCs作用的发挥.
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有限稀释法分离纯化人牙周膜干细胞的实验研究
目的 体外分离培养人牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)并进行鉴定.方法 采用有限稀释法分离和纯化PDLSCs并通过克隆形成及多向分化实验,鉴定所得细胞的增殖和分化能力.结果 分离纯化所得细胞均为长梭形或者不规则形,克隆细胞呈旋涡状集落生长趋势,体外诱导条件下可向成骨细胞、脂肪细胞分化,具有干细胞增殖和多向分化的特性.结论 有限稀释法分离纯化的PDLSCs具有间充质干细胞的表型及增殖和多向分化的生物学特性.
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中药诱导骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的研究进展
骨髓间充质干细胞具有较强的自我复制和多向分化能力,近几年发现在一定的条件下,能够诱导分化为神经细胞.由于其具有取材方便,回植后不会发生免疫排斥反应,体外基因转染率高并能稳定高效表达外源基因等优点,将为神经系统疾病的治疗提供新的思路.通过分析相关文献着重对中药诱导骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化方面的研究进行综述.
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薯蓣皂苷元抗肿瘤作用及其机制研究
从薯蓣皂苷元（Diosgenin，Dio）抗肿瘤作用、抗肿瘤作用机制方面综述近十年来国内外薯蓣皂苷元抗肿瘤作用及其机制研究进展，指出薯蓣皂苷元是一种天然的甾体皂苷，其来源广泛，具有调节免疫、抗肿瘤、抗炎等多种药理活性，其抗肿瘤活性引起了广大学者的关注，作用机制具有多靶点、多环节、多效应的特点，同时指出Dio对不同类型的肿瘤作用机制各有不同，研究深度各有差异，因此有必要利用现代分子生物技术对Dio在不同肿瘤中的作用及机制进行更全面更深入的研究；同时，针对Dio的抗肿瘤作用特点，联合其他抗肿瘤药物进行研究，将能更充分发挥传统中药在抗肿瘤方面的独特效用。
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参附注射液联合细胞因子对人慢性髓性白血病细胞来源树突状细胞诱导生成的影响
目的：观察不同浓度参附注射液（SFI）联合细胞因子（GM-CSF/IL-4）对慢性髓性白血病(CML)来源树突状细胞(DC)成熟与功能的影响。方法：采用CML患者的单个核细胞(MNC)，体外诱导扩增DC，在培养体系中分别添加不同浓度的SFI（终浓度分别为：低浓度9.38 mg/mL；中浓度37.50、75 mg/mL；高浓度150、300 mg/mL生药浓度）、GM-CSF/IL-4及不同浓度SFI联合细胞因子，通过观察细胞形态、细胞表面分子表达水平、细胞功能的变化，对所获得的细胞进行鉴定。结果：体外单用SFI不能诱导CML细胞分化为DC；细胞因子诱导的CML-DC存在表型及功能障碍；而在含有细胞因子的培养体系中添加SFI，对CML-DC有促进成熟和抑制增殖的双向调节作用，添加高浓度SFI可抑制DC的生长甚至导致细胞死亡，添加中浓度SFI能获得较多成熟CML-DC，可提高其细胞表面共刺激分子的表达水平，并可改善其刺激淋巴细胞增殖的能力及IL-12的含量。结论：适当浓度的SFI可影响CML-DC的分化和成熟，并可改变DC细胞表面免疫分子的表达，增强其功能；SFI佳诱导浓度为75 mg/mL，且75 mg/mL SFI与GM-CSF/IL-4联合应用有协同作用。
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鼠间充质干细胞向成骨细胞定向诱导分化的研究
目的:探讨干细胞向成骨细胞诱导分化的特征.方法:利用成骨细胞诱导体系诱导小鼠骨髓间充质干细胞系(D1细胞)向成骨细胞定向分化,D1细胞诱导不同时间后,运用免疫组化方法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP),Ⅰ型胶原(typeⅠcollagen ,COL1)的表达; RT-PCR检测Osterx和OCN mRNA的表达.结果:细胞诱导培养3、7、14和21 d后结果显示: 3 d时ALP、COL1呈阴性表达,7 d ALP呈阳性表达,14 d ALP表达高,21 d ALP表达明显减少;7 d COL1呈阳性表达,14 d和21 d表达显著增强;14 d有矿化结节形成,21 d形成典型的矿化结节.7 d时OSX和OCN基因表达上调,14 d时OSX基因表达下调,21 d其表达上调;14 d时OCN表达上调,21 d后表达下调.结论:间充质干细胞能定向诱导为成骨细胞,OSX基因的表达是其分化的关键.
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骨髓间充质干细胞体外培养和成骨诱导
目的:观察骨髓间充质干细胞(MSC)体外培养及诱导成骨分化的特征.方法:采用密度梯度离心和体外扩增培养人骨髓MSC,并进行成骨诱导.应用茜素红染色法和钙钴法分别进行成骨诱导的MSC钙化结节检测和碱性磷酸酶(ALP)检测.结果:MSC成骨细胞诱导培养第1～3天的细胞增殖旺盛,3～5 d即融合成单层.随着诱导培养时间的延长,细胞逐渐堆积并矿盐沉积,形成矿化结节.培养14 d和21d后,矿化结节形成率分别为(70.5±3.5)％和(87.5±3.5)％,ALP染色阳性率分别为(41.5±1.5)％和(85.2±1.7)％.结论:在体外培养条件下,骨髓MSC可诱导分化为具有含矿化结节及ALP阳性特征的骨样细胞.
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毛囊隆突细胞体外诱导分化的形态学观察
目的:探讨体外诱导毛囊隆突细胞向毛囊和皮脂腺上皮细胞分化潜能.方法:体外分离培养人胎儿毛囊隆突细胞,分别利用与毛乳头细胞共培养,雄激素、胰岛素和地塞米松等为诱导剂诱导,观察毛囊隆突细胞的生长特性及形态变化.结果:毛囊隆突细胞与毛乳头细胞共培养后成克隆性生长,并被毛乳头细胞围绕,随着培养时间延长,细胞出现堆积和分层,中心形成毛囊样结构;在成脂诱导剂作用下,毛囊隆突细胞体积变大,出现特异的"扇贝"形细胞,胞浆内出现大小不等脂滴,随着培养时间延长,细胞形态变为椭圆、纺锤或不规则形,部分伸展的细胞相互融合,包裹形成不规则的网格状.结论:在不同诱导条件下,毛囊隆突细胞在形态上具有向毛囊和皮脂腺上皮细胞分化的潜能.
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脂肪干细胞的分离培养及成心肌诱导
目的 探讨脂肪干细胞的分离培养以及成心肌细胞分化的可能性,为脂肪干细胞治疗缺血性心脏病的应用提供理论依据.方法 自SD大鼠提取脂肪组织,用酶消化法分离脂肪干细胞,培养于a-MEM培养基中.显微镜下观察细胞生长情况及形态特征,流式细胞仪检测脂肪干细胞表面分子的表达情况.用5-氮胞苷对脂肪干细胞进行诱导,显微镜下观察细胞生长情况及形态变化,免疫组织化学方法检测心肌特异性抗体α-Actin的表达.结果 分离培养的脂肪干细胞形态近似梭形,流式细胞仪检测结果显示CD90及CD105高表达,而CD34及CD45极低表达.经5-氮胞苷诱导后的脂肪干细胞呈类似心肌细胞的形态学特征,免疫组织化学检测结果见心肌特异性标志物α-Actin表达阳性.结论 脂肪干细胞具有较强的分化为心肌样细胞的能力,可以应用于缺血性心脏病细胞治疗的研究.
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骨髓间充质干细胞在股骨头坏死治疗中的应用进展
股骨头坏死是由于不同病因破坏股骨头的血液循环,终导致股骨头塌陷、髋关节功能障碍的一种慢性、致残性疾病,严重影响了患者的生活质量.骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有强大的自我增殖和多向分化潜能,可通过诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞及肌细胞等多种细胞谱系.
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人胎儿毛囊隆突细胞的培养方法及其向皮脂腺细胞诱导分化的初步研究
目的探讨简单快捷地获得大量人毛囊隆突细胞并保持其干细胞特性的方法,观察其向皮脂腺细胞分化的可行性.方法用传统的器械分离法(简称传统法)和改进的消化分离法(简称改良法)对人胎儿毛囊隆突细胞进行分离培养,比较两种方法的细胞获得效率和细胞生长特性.在对毛囊隆突细胞进行诱导培养后,行抗上皮膜抗原(EMA)抗体免疫组织化学染色,以检测细胞EMA的表达情况.噻唑蓝(MTT)法检测细胞克隆形成率.用亲和素-生物素复合物(ABC)标记法行毛囊隆突细胞角蛋白19(K19)染色.结果传统法每小时可获得8～10个毛囊隆突,贴壁48 h后有细胞长出,贴壁率为40%～50%,培养14 d左右传代;改良法每小时可获得毛囊隆突100个左右,接种后12 h即可贴壁并有细胞长出,贴壁率30%,细胞生长迅速,7 d左右即可传代.毛囊隆突细胞诱导培养7 d后,细胞体积变大,随着时间延长,细胞进一步变大,细胞质中有脂滴样颗粒围绕在核的周围,细胞形状不规则.诱导培养14 d后,抗EMA抗体免疫组织化学染色呈阳性表达.改良法的细胞克隆形成率为(18.2±2.1)%,明显高于传统法[(12.7±3.4)%,P＜0.05].毛囊隆突细胞K19免疫组织化学染色呈阳性,其细胞分布满视野,细胞质内含有大量棕色颗粒.结论改良法可以获得大量毛囊隆突细胞并保持其干细胞特性,在体外诱导条件下,具有向皮脂腺细胞分化的潜能.
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脂肪间充质干细胞向成骨细胞分化的研究进展
脂肪间充质干细胞因其具有良好的成骨分化潜能，且较骨髓间充质干细胞有提取技术简单、来源广泛等优点。然而随着应用增多，其存在的问题日益突出，如佳成骨分化浓度、分离纯化、致瘤性及安全性等问题还有待进一步解决。脂肪间充质干细胞的应用与研究逐渐受到重视，但同时存在诸多问题。本文就脂肪间充质干细胞的分离培养、生物学特性和临床应用进行综述。
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小鼠胚胎干细胞体外诱导分化为精原干细胞的研究
目的:初步探讨在体外条件下诱导小鼠胚胎干细胞(EGFP-mESC)分化为精原干细胞(SSC)的条件,建立有效的技术平台.方法:采用部分模拟胚胎早期发育的方法,将EGFP-mESC(XV)经体外悬滴培养,制备拟胚体(EB);使用免疫磁珠分选法从EB中分离出表达原始生殖细胞(PGC)表面标志SSEA-1的细胞;获得的细胞经2 μmol/L维甲酸(RA)诱导增殖,使之向雄性生殖细胞分化.对诱导的细胞采用RT-PCR及免疫荧光检测特异性基因及蛋白的碱性磷酸酶.结果:在诱导EGFP-mESC向雄性生殖细胞分化的过程中,采用RT-PCR方法检测到了雄性生殖细胞特异表达基因Sry、fragilis、stella、Tex14等mRNA的表达:利用激光共聚焦方法检测到SSC表面标志蛋白Stra8、integrin-α6及Hsp90a的表达.结论:采用RA体外诱导EGFP-mESC定向分化为SSC是可行的.
关键词： 胚胎干细胞(ESC) 拟胚体(EB) 精原干细胞(SSC) 体外培养 诱导分化 -
人脐血间充质干细胞的体外分离纯化及成骨能力
目的 在体外诱导脐血(umbilical cord blood)间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)向成骨细胞分化,研究在特定微环境下诱导脐血MSCs分化为成骨细胞的方法.方法 由人脐静脉获得MSCs,采用密度梯度法分离培养MSCs,应用地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C诱导,观察MSCs的形态变化,未诱导组作为平行对照.利用倒置光学显微镜、透射电镜、碱性磷酸酶染色等方法研究脐血MSC增殖和分化情况.RT-PCR检测脐血MSCs胞成骨诱导后骨形态发生蛋白2 mRNA的表达情况.结果 在诱导培养微环境中的脐血MSCs向成骨细胞诱导分化后,长梭形细胞变成多角形、不规则形,局部细胞重叠生长,10 d后细胞外渐可见方形,高折光性的结晶颗粒,开始呈现成骨细胞的特点,茜素红及碱性磷酸酶染色阳性,骨形态发生蛋白-2 mRNA表达阳性.结论 人脐带血MSCs可在体外诱导为成骨细胞,是研究骨组织工程的理想种子细胞.
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骨髓经羟乙基淀粉(HES)处理后分离和培养MSCs的初步探讨
种子细胞、支架材料和生长因子是组织工程的三大要素,而寻找合适的种子细胞是成功的重要因素[1].骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs),因其具有多向分化潜能,如形成骨、软骨、肌组织、皮肤等,成为具代表性的种子细胞[2,3].目前,国内外已分离培养出人,小鼠,大鼠,兔等的骨髓MSCs,并诱导分化出多种组织[4],但由于它在骨髓内含量极少,只占0.01%～0.001%,而组织工程需要短期内有大量的种子细胞再生组织,故需进行体外培养、分化和扩增[5].本实验对骨髓MSCs的两种分离方法进行比较,以期获得更好的方法.
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人参皂苷Rh2和Rg3抗肿瘤作用研究进展
人参皂苷是人参抗肿瘤的有效成分，其中人参皂苷Rh2（ ginsenoside Rh2，GRh2）和人参皂苷Rg3（ ginsenoside Rg3，GRg3）是人参抗肿瘤的主要活性成分。研究表明，二者可阻滞细胞周期，诱导分化，抑制转移，调节免疫功能，逆转多药耐药性，诱导凋亡等［1］，综术如下。
