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定量聚合酶链反应测定技术
聚合酶链反应(PCR)现已广泛用于涉及到核酸的科学研究以及临床疾病的诊断和治疗监测.由于PCR是对原始待测模板核酸的一个扩增过程,任何干扰PCR指数扩增的因素都会影响扩增产物的量,使得PCR扩增终产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系,通过检测扩增终产物很难对原始模板进行准确定量.近年来,研究人员为克服上述影响因素,研究了各种相对准确的定量PCR方法[1-3].
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尿嘧啶DNA糖基化酶在PCR防污染中的应用
1.PCR"残留污染"在PCR操作过程中,容易出现"污染"问题,原因主要有如下几种情况:①模板的交叉污染:在样品采集或处理中,气溶胶、加样器取样时的泡沫或其他原因引起样品或模板的交叉污染,造成假阳性,属于正常DNA(由A、T、G、C四种碱基组成)引起的污染;②扩增产物的污染:在扩增过程中,将碱基T置换成U,使得扩增产物为U-DNA(由A、U、G、C四种碱基组成),由于产物量特别大,容易溢漏引起污染,造成假阳性;③核酸酶、蛋白酶的污染造成假阴性;在这三种情况中为严重是第二种,即称之为"残留污染",因为PCR扩增的放大倍数高达千万倍,而且在实际应用中扩增一直在反复进行,造成扩增产物的大量堆积,难于将其控制降解,即使是荧光PCR也很难避免扩增产物的污染,为了使得PCR结果更加可靠、准确,有必要在反应管完全封闭后于管内通过酶或其他方法,将操作过程中可能带入的残留污染物破坏,使其不能成为新一轮扩增的模板,从UDG的生物学性质可知,它是完成这一任务的佳选择.
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LCR技术在检测淋球菌和泌尿生殖道沙眼衣原体感染中的应用
连接酶链反应技术(Ligase Chain Reaction,LCR)与PCR技术相似,是近年来发展的一门新的分子生物学技术,LCR技术与PCR相比所不同的是,其使用了两对引物对靶序列作扩增,同时在扩增过程后,还应用微粒子酶免疫技术(MEIA)对扩增产物进行测定,进一步提高了检测的敏感性和特异件.
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体外长期培养对脐血造血干/祖细胞细胞周期及凋亡的影响
目前造血干细胞移植(HSCT)已成为难治性血液病、免疫缺陷病及恶性肿瘤等的主要治疗手段.脐血是造血干/祖细胞(HSPC)的一种重要来源,由于单份脐血中细胞数量有限而限制了其临床应用,故脐血造血干/祖细胞的体外扩增越来越引起人们的关注.我们观察了体外长期培养对脐血HSPC细胞周期及凋亡的影响,以了解脐血HSPC在体外扩增过程中某些生物学特性的变化.
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实时荧光定量RT-PCR检测TGF-β1 mRNA表达
利用荧光TaqMan技术(5′核酸外切酶活性)和一种可以实时检测荧光信号的仪器(ABI Prism 7700序列检测系统),在PCR反应完全封闭的情况下可实时检测PCR扩增的动力学变化,能够对标本扩增过程中的起始拷贝数快速、准确地定量,极大地克服了原有PCR技术存在的不足,已逐步成为PCR更新换代的新技术[1,2].目前常规检测β1转化生长因子(TGF-β1)表达多采用竞争RT-PCR及内源性参比基因RT-PCR,它们都属于PCR终点法检测,很难对起始模板数准确定量.我们利用实时荧光定量RT-PCR技术建立了检测TGF-β1 mRNA表达的方法.
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实时扩增技术在临床病毒学研究中的应用:优势与制约
众所周知,基因扩增技术包括聚合酶链反应(po1ymerase chain reaction,PCR)和核酸序列依赖的扩增(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA).PCR技术可以RNA或DNA为模板,以RNA为模板时先进行逆转录反应;而NASBA技术则是专一的以RNA为模板的基因扩增技术,其扩增过程需3种酶的参与,其分别是鸟髓母细胞增多症病毒逆转录酶(avian myeloblastosis virus reverse transcriptase,AMV-RT)、核糖核酸酶H和T7RNA聚合酶.
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红细胞生成素对骨髓间充质干细胞干性的影响
有研究表明,当体外培养的骨髓间充质干细胞(MSC)形成集落时,其多向分化潜能具有逐渐丧失的倾向,且在体外扩增过程中MSC出现了自发分化的倾向,限制了其在临床上的应用.我们前期实验发现,在体外促红细胞生成素(EPO)能促进MSC的增殖和迁移能力.本实验拟用EPO作用于MSC,观察其未分化相关转录因子端粒酶逆转录酶(TERT)、POU5fl转录因子-4(OCT4)、性别决定基因相关转录因子-2(SOX2)和多潜能维持因子(Nanog)mRNA的表达情况,探讨EPO对MSC干性的影响.
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造血干祖细胞体外扩增与其再植入能力的研究进展
造血干祖细胞移植(hematopoietic stem/progenitor cells transplantation)用于治疗恶性血液病、某些遗传性疾病、先天性免疫缺陷和各类自身免疫病等,也用于实体瘤的治疗.而造血干祖细胞体外扩增是提高移植成功率和拓展造血干祖细胞移植应用领域的有效途径,有助于解决移植时所面临的细胞数量不足、移植后造血恢复等问题,也是移植物净化,提高外源基因导入造血干祖细胞进行基因治疗的有效方法.而在造血干祖细胞体外扩增过程中扩增早期和早期祖细胞以及保留干细胞长期重建造血的能力是造血干祖细胞体外圹增的关键,是目前的研究热点,本文就有关这方面的一些研究作一综述.