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Na+/H+交换器1核酶对缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡的影响
我们的研究拟观察转染Na+/H+交换器1(NHE-1)核酶基因逆转录病毒载体后,缺氧培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的增殖和凋亡变化.
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缺氧诱导体外培养的心肌细胞凋亡及检测方法研究
为探讨缺氧诱导体外培养的心肌细胞凋亡情况,并用不同方法检测,将体外培养的新生大鼠心肌细胞置于95%氮气及5%二氧化碳孵箱中一定时间造成缺氧损伤的心肌细胞模型,分别用HE染色、电镜、TUNEL法、流式细胞仪技术检测凋亡发生的情况.结果:均观察到缺氧诱导的心肌细胞凋亡.认为缺氧一定时间可以诱导体外培养的心肌细胞凋亡;检测心肌细胞凋亡的方法,需结合形态学及定量方法全面分析.
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肝细胞生长因子基因转染缺氧培养骨髓间充质干细胞凋亡相关蛋白的影响
背景：研究已证实肝细胞生长因子基因转染可提高骨髓间充质干细胞移植效果，但其具体机制尚未完全明确。目的：探讨肝细胞生长因子基因转染对缺氧、无血清培养骨髓间充质干细胞c-Met、Bax、Bcl-2、Caspase-3表达及细胞迁移的影响。
方法：①贴壁法体外分离、扩增培养骨髓间充质干细胞。用x-gal染色法检测含肝细胞生长因子基因的重组腺病毒对骨髓间充质干细胞的感染率。②在缺氧、无血清条件下培养0，3，6，9，12 h，采用RT-PCR及Western blot测定骨髓间充质干细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3的表达。③骨髓间充质干细胞缺氧、无血清培养6 h，采用RT-PCR及Western blot测定HGF、c-Met、Bax、Bcl-2、Caspase-3的表达。④细胞迁移划痕法观察缺氧、无血清培养6h后肝细胞生长因子转染对骨髓间充质干细胞迁移的影响。
结果与结论：①重组腺病毒对骨髓间充质干细胞的转染率与病毒感染复数具有量效关系，病毒感染复数为150时细胞的感染率达96.4%。②随着缺氧时间的延长骨髓间充质干细胞Bax、Bcl-2表达逐渐升高(P <0.05)，缺氧6 h时Bax/Bcl-2比值、Caspase-3蛋白达到小(P<0.05)。③缺氧及无血清培养6 h后，与对照组及空载体组相比，Ad-HGF组HGF、c-Met、Bcl-2表达增高，而Bax、Caspase-3表达下降(P<0.05)，对照组与空载体组差异无显著性意义(P>0.05)。④Ad-HGF组骨髓间充质干细胞在缺氧培养6 h后，迁移率比对照组及空载体组高(P <0.05)。结果表明肝细胞生长因子基因转染上调缺氧、无血清培养骨髓间充质干细胞c-Met、Bcl-2表达，下调Bax、Caspase-3表达，增强骨髓间充质干细胞迁移能力。 -
肾上腺髓质素对缺氧培养骨髓间充质干细胞表达凋亡相关蛋白的影响
背景：肾上腺髓质素基因转染能增强骨髓间充质干细胞在缺血、缺氧环境下的抗凋亡能力，但其机制尚未完全明确。
目的：观察肾上腺髓质素对骨髓间充质干细胞缺血、缺氧时 Bax、Bcl-2和 Caspase-3等凋亡相关调节蛋白表达的影响。
方法：贴壁法分离、培养、纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞，缺氧、无血清培养0，3，6，9，12 h后用Western blot测定Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表达以确定佳缺氧时间。采用缺氧6 h为时间点，根据缺氧、无血清培养前是否进行肾上腺髓质素预处理分为对照组(未加入肾上腺髓质素)及肾上腺髓质素不同质量浓度组(1，10，100μg/L)，然后采用Western blot测定Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表达。
结果与结论：①无血清培养条件下缺氧0，3，6，9，12 h后骨髓间充质干细胞 Bax、Bcl-2表达均增加(P <0.05)，缺氧6 h时Bax/Bcl-2比值、caspase-3蛋白达到小(P <0.05)。②缺氧6 h时，与1，10μg/L肾上腺髓质素组相比，100μg/L肾上腺髓质素组表达Bax蛋白、Caspase-3蛋白低，Bax/Bcl-2比值低，而表达Bcl-2蛋白高(P <0.05)。结果表明肾上腺髓质素能降低无血清、缺氧条件下骨髓间充质干细胞Bax/Bcl-2比值、Caspase-3蛋白表达，该效应存在剂量依赖性。 -
MSCs在缺氧状态下的基因差异性表达
目的：探讨MSCs在缺氧环境中细胞生物学特性及相关生长因子的变化，为修复组织损伤提供临床应用依据。方法体外进行MSCs缺氧处理，免疫荧光染色观察细胞特性，RT-PCR检测VEGF、bFGF、TGF-β和IL-1α基因，从细胞分化、生长因子和细胞信号通路等方面，来探讨MSCs在缺氧环境下发生的转变。结果 MSCs经1%O2缺氧培养24 h后，镜下观察示细胞成活良好，未见形态、生长方式等发生明显变化。免疫荧光及双荧光染色观察缺氧处理24 h的MSCs有向内皮细胞，特别是血管内皮转化的趋势。 VEGF、bFGF、TGF-β和IL-1α在缺氧处理后的MSCs中表达均增强，而未经缺氧处理的MSCs相关因子表达微弱。结论在缺氧的环境下，MSCs可向血管内皮细胞方向分化，并且与促进血管形成和生长相关的VEGF、bFGF、TGF-β和IL-1α基因表达均增强，可直接或间接促进损伤组织的血管化。
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乌拉地尔干预急性心肌缺血的细胞机制
目的新的α肾上腺素受体拮抗剂乌拉地尔(阻断α1受体为主),治疗高血压急症、急性心肌缺血和肺水肿有效.本研究试图阐述乌拉地尔对缺血心肌内能量代谢状态、SR钙泵活力和钙释放通道的作用,探讨其治疗急性心肌缺血的分子和细胞机制.方法制备急性心肌缺血家兔模型,给予乌拉地尔1.0mg@kg-1@d-1,3天后测定缺血和非缺血区心肌内ATP、ADP、AMP和乳酸量,计算能荷;测定SR Ca2+ATP酶活力和钙释放通道[3H]Ryanodine结合的Bmax的与Kd值.测定心肌细胞缺氧培养及药物干预时的SR钙泵活力.结果缺血和梗死区心肌内ATP、ADP、AMP含量比非缺血区下降31%、40%和33%,乳酸含量急剧升高65%,差异显著(P＜0.05和0.01);SR Ca2+ATP酶活力从(1.19±0.11)μmol/g降至0.94μmol/g(P＜0.05);钙释放通道数目下降,亲和力不变.治疗组缺血心肌内ATP、ADP、AMP含量明显回升、能荷升高,SR Ca2+ATP酶活力及释放通道数目均恢复正常(P＜0.05和0.01).缺氧培养乳鼠心肌细胞钙泵活力下降53%,乌拉地尔和拉西地平药物干预时钙泵活力无明显变化.结论乌拉地尔通过α受体改善缺血心肌内能量代谢、减少乳酸堆积、调节SR Ca2+泵和钙释放通道功能、减轻钙超载是治疗的分子和细胞机制之一.
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心肌细胞凋亡模型的建立及检测方法
目的:研究诱导体外培养心肌细胞凋亡的方法.方法:体外培养的新生大鼠心肌细胞置于95%N2,5%CO2孵箱中一定的时间,细胞模型形成缺氧损伤,分别用HE染色,电镜,TUNEL法,流式细胞仪技术检测凋亡发生的情况.结果:在缺氧培养一定时间后,用上述方法均观察到缺氧诱导的心肌细胞凋亡.结论:缺氧一定的时间可以诱导体外培养的心肌细胞凋亡;检测凋亡需结合形态学及定量测定作全面分析.
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肝细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞对急性心梗大鼠心肌胶原合成的影响
目的 探讨肝细胞生长因子(HGF)基因转染骨髓间充质干细胞(MSCs)对急性心梗大鼠心肌胶原合成的影响.方法 通过结扎大鼠冠状动脉前降支制作SD大鼠急性心梗模型.40只SD大鼠随机分为对照组、假手术组、心梗组、MSCs组和MSCs-HGF组.所有MSCs移植前进行无血清、无氧条件培养6 h;移植后4周HE染色与苦味酸天狼猩红染色观察大鼠心肌组织胶原分布、容积分数,ELISA法测心肌组织胶原Ⅰ、Ⅲ含量.结果 HE染色结果显示心梗组心肌细胞减少,结构紊乱,可见大量增生组织;MSCs-HGF组细胞形态结构较为完整,心肌组织间隙仅见少量增生组织.苦味酸天狼猩红染色显示:心梗组有大量红染纤维,呈束状或片状;MSCs-HGF组仅可见细束状红染纤维.ELISA结果可见:与心梗组相比较,MSCs-HGF组心肌组织胶原Ⅰ、Ⅲ含量均明显减少(P＜0.05).结论 HGF基因转染MSCs可抑制急性心梗大鼠心肌胶原的合成.
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bFGF对缺氧条件下培养的人脐静脉内皮细胞增殖影响
目的:观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对缺氧条件下培养内皮细胞增殖的影响,探讨其在缺氧条件下促血管再生的作用机理.方法:在细胞生长至70%～80%融合后,在细胞中加入bFGF后缺氧培养,通过流式细胞仪检测bFGF对细胞周期的影响.结果:流式细胞仪检测发现bFGF可使缺氧培养的内皮细胞的PI值和SPF值增加.结论:结果表明bFGF可逆转缺氧所致的内皮细胞增殖能力下降,使SPF和PI值上升.
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常氧及慢性缺氧的肺动脉内皮细胞急性缺氧后血栓素合酶(TXS)基因及PGI2、TXA2代谢产物的变化
目的:前列环素(PGI2)和血栓素A2(TXA2)均是花生四烯酸经环氧合酶(COX)途径生成的代谢产物,分别由前列环素合酶和血栓素合酶催化产生.本实验动态观察了常氧及慢性缺氧的肺动脉内皮细胞血栓素合酶(TXS)基因表达的变化及培养基上清中PGI2及TXA2的代谢产物6-Keto-PGF1α、TXB2随急性缺氧的变化.方法:采用连代常氧和缺氧培养的肺动脉内皮细胞,分别在2、4、6代给予急性缺氧刺激6 h,分为四组:常氧组(N)、急性缺氧6 h组(NH)、慢性缺氧后复氧12 h组(H)、慢性缺氧后复氧12 h再急性缺氧6 h组(HH).提取各组总RNA.将载有大鼠血栓素合酶基因片段的PBR322质粒,转化大肠杆菌HB101,扩增后提取质粒,经酶切、电泳后回收TXS 0.5 kb的cDNA片段作为探针,地高辛随机引物法标记探针作斑点杂交.以β-actin为对照,目的基因与对照的积分光密度比值作半定量分析.用放免法测定培养基上清中PGI2、TXA2代谢产物6-Keto-PGF1α、TXB2的变化.结果:常氧培养的PAEC急性缺氧后TXS mRNA、6-Keto-PGF1α、TXB2均增加,TXA2/PGI2在2、4代减少,第6代基本不变;慢性缺氧培养的PAEC急性缺氧后,6-Keto-PGF1α在2、4代减少,第6代不变;TXS mRNA、TXB2第4代增加,第6代减少,TXA2/PGI2在2、4代增加,第6代减少.结论:慢性缺氧改变了急性缺氧时肺动脉内皮细胞血栓素合酶(TXS)基因表达及TXA2与PGI2的比例,可能影响了肺动脉高压的发展及机体对慢性缺氧的习服过程.
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慢性缺氧对肺动脉内皮细胞Ⅲ型一氧化氮合酶mRNA表达的影响
目的:世居高原的人、动物或肺动脉高压的大鼠,常出现HPV钝化现象,即急性缺氧时肺血管收缩反应下降.这有助于防止肺动脉高压进一步升高及高原性心脏病的发生,有一定的代偿意义.由于NO是一种重要的血管舒张因子,那么慢性缺氧后肺血管对急性缺氧的收缩反应减弱是否与NO的调节作用增强有关呢?为验证这个推测,本实验动态观察了连代缺氧培养的肺动脉内皮细胞在急性缺氧时NOS Ⅲ mRNA表达的变化.方法:采用胰蛋白酶消化法培养猪肺动脉内皮细胞,分别在常氧(PO2 21.3 kPa)和缺氧(PO2 5.3±0.7 kPa)条件下培养并传代,在2、4、6代给予急性缺氧刺激12 h,分为常氧组(N)、急性缺氧12 h组(NH)、慢性缺氧后复氧12 h组(H)、慢性缺氧后复氧12 h再急性缺氧12 h组(HH).4%多聚甲醛固定后,用针对人或鼠NOS Ⅲ cDNA的多相寡核苷酸探针进行原位杂交.结合图像分析,半定量检测NOS Ⅲ mRNA的表达.结果:在2、4、6代,常氧培养的肺动脉内皮细胞急性缺氧12 h,NOS Ⅲ mRNA表达明显增加(分别比缺氧前增加48%、125%、119%, P＜0.05);从第4代起,慢性缺氧组eNOS mRNA在复氧12 h后仍高于常氧组(P＜0.01);慢性缺氧培养的肺动脉内皮细胞复氧后再急性缺氧12 h,eNOS mRNA表达亦明显增加(分别比缺氧前增加92%、245%、565%,P＜0.01),其增加的幅度,在HH组均大于同代NH组,随缺氧时间的延长更为显著.结论:慢性缺氧增强了急性缺氧时肺动脉内皮细胞Ⅲ型一氧化氮合酶mRNA的表达,NO调节作用增强,可能是慢性缺氧所致HPV钝化的一个因素.
