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在单磷酰脂A预处理过程中心肌环氧化酶-2表达的作用
1材料与方法随机选取健康雄性Wistar大鼠,体重(250±30)g,由同济医科大学动物中心提供,以20%乌拉坦(1g/kg)麻醉,实验分4组:(1)对照(NC)组.(2)单纯缺血再灌注(I/R)组.(3)单磷酰脂(MLA)预处理(MLA-DP)组:于I/R前24h由舌静脉滴入MLA(450μg/kg).(4)NS-398组:先同MLA-DP组应用药物,再于第2天I/R前35min应用COX-2抑制剂NS-398(5mg/kg),在相同时点不用药物组,则用等量生理盐水作为平衡对照.各组6只动物于再灌注120 min后双重染色心肌,用IBAS全自动处理系统计算各部面积,并计算出心肌梗死面积.每组用药前及手术后分别取静脉血测定血浆乳酸脱氢酶(LDH)活性.将MLA-DP、NS-398组的另一批动物于预处理后24 h(I/R组前)处死,同时处死另一批正常动物.快速取各组处死动物的心脏左室前壁心肌,一部分液氮保存,用于提取所取心肌中的总蛋白,另一部分用于提取前列腺素类化合物.从每组标本蛋白质样品中取20μg,凝胶电泳分离-转膜-封闭-加入兔抗环氧化酶-2(COX-2)的单克隆抗体-再加入辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG抗体-后加入ECL试剂-曝光.将Westem blot条带进行密度扫描.每组COX-2表达量以NC组积分光密度的百分率表示.提取前列腺素类化合物,使用前列环素E2(PGE2)作为内参.使用PGE2,6酮-前列腺素F1α(6-K-PGF1α)相应的EIA试剂盒检测两者的量.实验数据以x±s表示,两组间比较用单因素方差分析.
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微波辅助的蛋白质酶解方法
近些年,蛋白质组学研究技术手段不断进步,研究策略不断更新,归纳起来主要分为2种策略:"top-down"策略和"bottom-up"策略."top-down"策略是先对蛋白质混合物进行分离,然后进行蛋白质酶解和质谱鉴定[1-2].将蛋白质混合物通过凝胶电泳分离,从凝胶上切点进行胶内酶解,再通过质谱鉴定蛋白质,这就是常见的 "top-down"策略[3]."bottom-up"策略是指将蛋白质混合物酶解后得到更为复杂的多肽混合物,经多维高效液相色谱分离后进行串联质谱鉴定获得肽段序列信息,再搜索蛋白质数据库确定后的鉴定结果[4].这2种蛋白质组学研究策略都包含了蛋白质酶解这个步骤,虽然目前针对蛋白质分离和鉴定都有一些快速自动化的方法,但是对于蛋白质酶解及质谱上样之前的准备工作仍然步骤繁杂,耗时费力,严重影响了蛋白质大规模鉴定的速度.本文介绍一种快速酶解的方法,通过微波的辅助大大简化了蛋白质酶解步骤,并缩短了酶解所需时间[5-8].
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限制性显示技术分离差异表达基因--Mac30
为了进一步从基因水平上阐明As2O3治疗白血病的作用机制,以更好地预防和治疗白血病,我们应用限制性显示PCR(RD-PCR)技术收集As2O3处理前后K562细胞的cDNA片段,用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,并进一步筛选、分析了细胞内基因表达的变化情况.
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尿蛋白和生物标志物的现代分析与鉴定技术对肾病诊断的意义
肾病,肾脏的各种病证.如何诊断肾病,并进行早期干预是临床上迫切需要解决的问题.本文将着重介绍尿液的蛋白质组分析及其前景、挑战和仍未实现的生物标记物的检测方法;这类方法可以实现肾病的早期诊断、患者的预后诊断评估和患者对治疗的反应.1蛋白组学应用于肾病诊断的意义早在17世纪,一些医生已经采用了一种类似于蛋白组学的方法来诊断病理性蛋白尿.这种方法主要是通过观察尿液及其发泡情况来间接地判断.1975年,O’Farrell[1]介绍了双向凝胶电泳分离大肠杆菌蛋白的实验,但他并未意识到自己正在从事蛋白组学方面的工作.
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尿蛋白和生物标志物的现代分析与鉴定技术对肾病诊断的意义
肾病,肾脏的各种病证.如何诊断肾病,并进行早期干预是临床上迫切需要解决的问题.本文将着重介绍尿液的蛋白质组分析及其前景、挑战和仍未实现的生物标记物的检测方法;这类方法可以实现肾病的早期诊断、患者的预后诊断评估和患者对治疗的反应.1蛋白组学应用于肾病诊断的意义早在17世纪,一些医生已经采用了一种类似于蛋白组学的方法来诊断病理性蛋白尿.这种方法主要是通过观察尿液及其发泡情况来间接地判断.1975年,O’Farrell[1]介绍了双向凝胶电泳分离大肠杆菌蛋白的实验,但他并未意识到自己正在从事蛋白组学方面的工作.
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双波长飞点扫描仪测定不同膳食大鼠肥胖基因
在对肥胖的研究历程中,常需要检测肥胖基因表达水平,即检测肥胖基因(ob mRNA)和其表达产物瘦素(Leptin).传统的方法常用Northern bloting和Westem bloting,这两种方法后常在X光片上进行放射自显影或化学发光,然后目测比较暴光斑点大小和密度,从而进行表达水平的高低比较.目测斑点密度的大小带有很强的主观性,误差较大,很不准确.因此为得到准确的结果,目前采用了数字成像系统或凝胶成像系统进行定量分析,但这种仪器非常昂贵,很难在实验室中普及应用.本文利用双波长飞点扫描仪对薄层斑点扫描定量的原理,将甲醛凝胶电泳分离后的ob mRNA和Leptin化学发光物质,在X光胶片上曝光自显影,对其斑点密度的大小进行双波长锯齿式扫描检测,克服了上述之不足,取得了满意的结果.
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Menin在胃癌细胞中的表达
我们选取5株不同分化程度的人胃癌细胞,检测Menin的表达,现报道如下.一、材料与方法1.材料和细胞培养:Trizol、逆转录(RT)试剂盒、聚合酶链反应(PCR)试剂盒、荧光二抗、辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗、Menin和甘油醛-3-磷酸脱氢酶( GAPDH)抗体购自美国Santa公司.人胃癌细胞AGS、BGC-823、SGC-7901、MKN-28和人胃黏膜上皮细胞GES-1均为本实验室保存,细胞常规培养并进行后续实验.2.RT-PCR检测:采用Trizol试剂,按说明书提取细胞总RNA,应用鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶将总RNA逆转录成cDNA并进行扩增和琼脂糖凝胶电泳分离,用Tanon-2500凝胶成像进行检测.
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一种可用于治疗苯丙酮尿症的工程菌株的建立
目的:通过基因重组建立高效表达有活性的PAL菌株,为开创苯丙酮尿症的新疗法奠定基础.方法:对已克隆于pUC19质粒中的水稻苯丙氨酸氨解酶的cDNA进行反向测序,根据测序结果,与pET28系列质粒中的阅读框架结构进行比较,选择相匹配的pET28c质粒作为表达载体,用EcoRⅠ分别切开质粒pUC19-rPAL-1-cDNA和pET28c,切下的2.5 kb rPAL-1-cDNA通过1.5%琼脂糖凝胶电泳分离,透析袋回收,酚、氯仿抽提,乙醇沉淀,纯化后溶于双蒸水备用.
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抗ENA多肽抗体对自身免疫病诊断价值探讨
自身免疫病又称结缔组织病,也称作风湿病[1].这类疾病有很高的发病率.我们采用万孚生物技术有限公司研制的具有国际先进生物技术--免疫印迹技术,将具有多种抗原性的细胞核盐水可提取性抗原(ENA)经凝胶电泳分离后,转印于硝酸纤维膜上.可一次检测10种自身多肽抗体.
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一种使DNA条带细窄的电泳方法
STR已经成为法医学进行个体识别和亲子鉴定的重要遗传标记.目前STR常通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR产物达到分型的目的.因此,电泳结果的条带是否清晰,重复性是否良好直接影响到STR分型的准确性.
