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铁调素干预成骨细胞（hFOB1.19）后细胞膜转铁蛋白
目的：探讨铁调素对成骨细胞铁代谢指标、骨代谢指标的影响和相互关系。方法成骨细胞（ hFOB1.19）培养3 d后，使用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测成骨细胞（hFOB1.19）的膜转铁蛋白1（ferroportin1，Fpn1）的表达；再用不同浓度的铁调素（25 noml/L，50 noml/L，100 noml/L）干预培养环境，对照组加相同体积双蒸水，干预20 h，MTT法检测细胞增殖情况；激光共聚焦扫描显微镜（ CLSM）检测成骨细胞内铁离子荧光染色后荧光强度变化情况；Von Kossa染色检测成骨细胞矿化情况；RT-PCR检测骨钙素（BGP）、I型胶原（COL1）、骨保护素（OPG）基因表达。结果1、成骨细胞存在Fpn1表达；2、铁调素对成骨细胞增殖无显著影响（ P＞0.05）；3、铁调素干预后，成骨细胞内铁离子含量增多，且与铁调素干预存剂量依赖性关系（ P＜0.05）；4、铁调素干预后，成骨细胞矿化功能增强，且与铁调素干预存剂量依赖性关系（ P＜0.05）；5、RT-PCR检测显示不同浓度铁调素干预后，各组COL1、OPG、BGP mRNA均有表达；不同浓度组的COL1、OPG、BGP mRNA表达光密度比值不同，组间密度比值比较存在统计学意义（P＜0.05），但铁调素在400 nmol/L时抑制OPG的表达（P＜0.05）。结论成骨细胞存在铁调素作用的膜转铁蛋白-1，所以铁调素干预成骨细胞培养环境后细胞内铁离子发生特异性变化，同时细胞矿化指标显著增加、细胞COL1、OPG、BGP mRNA表达含量增加；研究提示：铁调素可能通过膜转铁蛋白影响成骨细胞铁离子变化，细胞铁代谢变化可能引起细胞成骨指标上调改变。
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铁过载对斑马鱼成骨影响的机制
目的 通过高通量转录组的方法测序高铁环境生存的斑马鱼与和野生型的斑马鱼,通过比较筛选出铁过载对于成骨影响的通道,通过在体以及离体的一系列实验证实铁过载对这些通道的作用.方法 通过在斑马鱼高铁环境下生存,造成斑马鱼铁过载,在4天后提取其RNA和野生型斑马鱼提取的RNA进行高通量转录组测序比较,筛选出成骨Bmp2通道,并用定量QPCR验证.在体实验中将Runx2a标记的转基因斑马鱼在高铁环境下与正常环境在第九天进行比较,观察其荧光的变化;离体实验中,用Bmp2a带标签的cDNA和Runx2a带标签的cDNA的细胞进行转染,进行荧光素酶报告基因实验,然后用铁干预,观察其变化.结果 通过高通量转录组测序发现高铁对于Bmp2抑制,并用定量验证发现铁过载后Runx2a,Runx2b,sp7等成骨基因均下调,观察发现Runx2a标记的转基因斑马鱼高铁环境下与正常环境相比基因表达明显下调,在细胞转染实验中,荧光素酶报告基因Runx2a在Bmp2a转染下大幅升高,转染铁后Runx2a下降.结论 通过高通量转录组测序,我们发现铁过载对于BMP2的抑制影响,运用在体以及离体的一系列实验证实铁过载对Bmp2的抑制作用从而导致成骨代谢的异常.
关键词： 高通量转录组测序 成骨基因 转基因鱼 骨形态发生蛋白2通道 -
辛伐他汀对成骨细胞分化和成骨基因的影响
目的 探讨辛伐他汀对成骨细胞分化及成骨基因表达的影响.方法 选取成骨肉瘤细胞株 MG-63,采用不同浓度辛伐他汀(0.0625、0.125、0.25、0.5和 1.0 μmol/L)处理成骨细胞,ALP活性检测辛伐他汀对成骨细胞分化作用的影响;实时定量 RT-PCR和免疫印迹检测细胞成骨基因 mRNA的表达.结果 通过不同浓度辛伐他汀处理成骨细胞后,不同浓度辛伐他汀组与对照组比较,成骨细胞ALP 活性差异均有统计学意义 ( P<0.05),其中 0.25 μmol/L 浓度组作用对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响为显著.采用 0.25 μmol/L辛伐他汀处理成骨细胞后,辛伐他汀组与对照组比较,成骨细胞骨钙蛋白、ALP、I型胶原 mRNA表达差异均有统计学意义 ( P<0.05).结论 辛伐他汀可能通过上调成骨基因mRNA的表达水平来促进其分化,这为他汀类药物治疗骨质疏松症提供新的干预靶点.
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携带低氧诱导因子1α慢病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞后成骨基因的表达
背景：人低氧诱导因子1α可调控其下游成骨及成血管基因的表达，具有提高成骨活性的作用。目的：观察携带人低氧诱导因子1α慢病毒感染的大鼠骨髓间充质干细胞中成骨基因表达情况。方法：通过RT-PCR方法从Hela细胞中获得低氧诱导因子1α，构建携带低氧诱导因子1α的慢病毒表达质粒Lenti-HIF-1α-eGFP，与LentiPac HIV混合包装质粒共包装293Ta细胞，获得病毒；采用全骨髓直接贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，使用流式细胞仪对骨髓间充质干细胞进行鉴定。分别在慢病毒感染骨髓间充质干细胞1，4，7，14 d后，用实时荧光定量PCR检测骨髓间充质干细胞中成骨基因骨形态发生蛋白2、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶的表达水平。结果与结论：Lenti-HIF-1α-eGFP有效地感染骨髓间充质干细胞，实时荧光定量PCR检测结果显示成骨基因骨形态发生蛋白2、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶在Lenti-HIF-1α-eGFP感染后第4天开始明显过表达，且持续至14 d。结果表明低氧诱导因子1α可以提高骨髓间充质干细胞的成骨活性。
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熊果酸干预骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化
背景:熊果酸可通过Wnt信号通路抑制破骨细胞增殖分化,对胶原诱导性关节炎模型大鼠有抗炎和骨保护作用,但是熊果酸对大鼠骨髓间充质干细胞增殖、分化以及Wnt/β-catenin信号通路相关基因和蛋白表达的影响尚不明确.目的:探讨熊果酸对骨髓间充质干细胞增殖、分化及Wnt信号通路的影响.方法:采用全骨髓贴壁法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,不同浓度(1.0,2.5,5.0,10.0,20.0μmol/L)熊果酸作用骨髓间充质干细胞,以不含熊果酸的培养基为对照组,MTT法检测熊果酸对骨髓间充质干细胞增殖的影响.用含不同浓度(1.0,2.5,5.0μmol/L)熊果酸的成骨诱导液培养骨髓间充质干细胞,以不含熊果酸的成骨诱导液为对照组,在诱导后第7天和第14天采用ELISA法检测碱性磷酸酶活性和骨钙素水平,在诱导第14天采用RT-PCR检测成骨基因ALP、COL-I、OCN、OPN、RUNX2 mRNA表达水平,采用RT-PCR和Western blot法检测Wnt信号通路相关Wnt-3α、GSK-3β、β-catenin mRNA和蛋白表达.结果与结论:①不同浓度熊果酸均可促进骨髓间充质干细胞增殖,浓度为5.0μmol/L时增殖率高;②骨髓间充质干细胞成骨诱导第7天和第14天时碱性磷酸酶活性和骨钙素水平均比对照组增高,差异有显著性意义(P<0.05),且诱导相同时间,随熊果酸浓度增加碱性磷酸酶活性增强,骨钙素水平升高(P<0.05);③诱导14 d,熊果酸可促进骨髓间充质干细胞分化后成骨基因ALP、COL-I、OCN、OPN、RUNX2 mRNA表达以及Wnt信号通路相关Wnt-3α、GSK-3β、β-catenin mRNA和蛋白表达,随熊果酸浓度增加其表达水平升高(P<0.05);④结果表明,熊果酸通过Wnt/β-catenin信号通路促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化.
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二氧化钛纳米管对兔胫骨内种植体旋转扭力的影响
目的 通过兔子动物模型评估种植体表面不同管径的TIO2纳米管对成骨细胞黏附、种植体扭力和成骨基因表达的影响.方法 将24个订做的螺旋状的长为6 mm,外径为2.5 mm的纯钛种植体分为3组.A组:对照组平滑面种植体;B组:表面为30 nm管径TiO2纳米管的种植体;C组:表面为70 nm管径TiO2纳米管的种植体.分别将种植体植入兔子胫骨,手术后四周,处死兔子,采用数字扭力仪通过反向旋转取下腿部种植体,测量种植体扭力,通过扫描电子显微镜分析种植体表面成骨细胞的粘附,通过实时PCR检测核心结合因子(Runx2)、胰岛素样生长因子(IGF)、Ⅰ型胶原(col-1)和骨钙素(OCN)的基因表达水平.结果 表面为70 nm管径TiO2纳米管的种植体可以增强兔胫骨内种植体的扭力(P＜0.05),并显著性的提高Runx2、IGF、col-1和OCN等成骨基因的表达水平(P＜0.05).结论 相对于30 nm管径纳米管,表面为70 nm管径纳米管的种植体可以获得良好的成骨反应,并且在早期植入期具有较高的界面强度.
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体外培养大鼠骨髓间充质干细胞成骨基因表达谱的检测
目的:探讨体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)成骨相关基因的表达谱,明确体外培养大鼠骨髓MSC的成骨潜能. 方法: 体外培养SD大鼠骨髓MSC,取第3代细胞提取总核糖核酸(RNA),制备杂交探针,并运用SuperArray公司提供的大鼠Oligo GEArray骨再生基因芯片(每张芯片可测113种基因)进行杂交,化学发光检测,通过X线胶片或台式扫描获得化学发光的芯片图像,使用网上提供的综合型GEArry表达分析配套软件(GEArry Expression Analysis Suite)进行完整的芯片数据分析. 结果:检测体外培养大鼠骨髓MSC的113种成骨相关的基因,其中有31种基因表达强度较低,45种基因呈中等强度表达,37种基因表达强度较高. 结论:体外培养大鼠骨髓MSC具有部分成骨细胞基因表型特征,但成熟成骨细胞的特征基因表达量较低,提示大鼠MSC是具有较强成骨细胞分化潜能的成纤维样细胞.
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阿魏酸对体外培养的成骨细胞增殖、分化和矿化功能的影响
阿魏酸化学名称为3-甲氧基4-羟基丙烯酸，是当归等抗骨质疏松中药复方制剂的组方中药所含的一种水溶性单体成分，是其主要活性物质之一，具有降低胆固醇、抗氧化、抗血小板聚集等功能[1]。目前阿魏酸对心肌细胞、淋巴细胞活性影响的研究已有报道[1-3]，而其对成骨细胞活性影响的研究较为少见。该文研究阿魏酸对体外培养的成骨细胞增殖、分化功能的影响并探讨其作用机制，为当归等在防治骨质疏松症中的应用提供理论依据。
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双基因重组载体转染乙醇诱导的兔干细胞对其成脂与成骨基因表达的影响
目的 观察双基因重组载体转染乙醇诱导的兔干细胞对其成脂与成骨基因表达的影响.方法 取第3代兔骨髓间充质干细胞(BMSCs),随机分为6组:(1)正常组:正常BMSCs,无特殊处理.以下5组均给予终质量浓度0.09 mol/L乙醇.(2)模型组:无基因转染BMSCs;(3)无关序列组:10μl无关序列载体转染BMSCs;(4)干扰过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)表达组(siPPARγ组):10μl siPPARγ基因载体转染BMSCs;(5)exCGRP组:10μl降钙素基因相关肽(CGRP)基因载体转染BMSCs;(6)双基因组:10μl双基因重组载体转染BMSCs.实验第7、14天检测各组细胞中PPARγ、CGRP、Runt相关基因2(Runx2)、骨钙素mRNA与其蛋白表达.结果 实验第7天,双基因组、siPPARγ组、正常组中PPARγ mRNA与蛋白均呈低表达(0.329±0.037与0.162 ±0.013、0.413 ±0.045与0.174±0.023、0.376±0.042与0.169±0.021),明显低于模型组(0.672±0.079与0.871±0.096)、无关序列组(0.674±0.083与0.823±0.089)、exCGRP组(0.683±0.079与0.839±0.091),差异均有统计学意义(均P=0.000).双基因组、exCGRP组中均明显表达CGRP mRNA与蛋白,显著高于模型组、无关序列组、siPPARγ组、正常组,差异均有统计学意义(均P =0.000).双基因组、exCGRP组、siPPARγ组、正常组中Runx2mRNA、骨钙素mRNA与蛋白均呈高表达,双基因组显著高于模型组、无关序列组,且明显高于exCGRP组、siPPARγ组、正常组,差异均有统计学意义(均P =0.000).实验第14天,各组表达量与第7天一致.结论 双基因重组载体转染乙醇诱导的兔干细胞,能够同时高效阻止细胞中成脂基因表达并上调成骨基因表达,显著优于单一基因的作用.
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降钙素基因相关肽基因转染干细胞移植在兔股骨头坏死模型中的成骨基因表达
目的 观察人降钙素基因相关肽α(hCGRPα)转染骨髓间充质于细胞(BMSCs)联合自体骨移植在兔股骨头坏死(ONFH)模型中成骨基因的表达.方法 采用液氮冷冻法成功制作出家兔股骨头坏死兔.将72只ONFH模型兔随机分为3组.hCGRPα基因转染BMSCs组(A组):将hCGRPα基因转染BMSCs移植于股骨头内;BMSCs组(B组):植入BMSCs;无关序列组(C组):植入干细胞为无关基因BMSCs.3组中均同时将自体骨植入股骨头.于实验第1个月末观察兔股骨头的细胞内hCGRPα和成骨基因骨钙素的表达.结果 将hCGRPα基因转染BMSCs植入股骨头1个月时,A、B、C组中hCGRPα mRNA与其蛋白的相对表达量分别为0.84±0.06、0.31±0.02、0.29±0.02与0.76±0.07、0.21±0.02、0.18±0.02.3组中骨钙素mRNA与其蛋白的相对表达量分别为0.76±0.07、0.39±0.04、0.29±0.04与0.68±0.06、0.33±0.03、0.31±0.03.A组股骨头细胞中hCGRPα基因和骨钙素基因均呈高表达,明显高于B组和C组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 hCGRPα修饰BMSCs植入ONFH动物模型股骨头中,可促进细胞中成骨因子hCGRPα和骨钙素基因的表达.
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体外培养人牙周膜细胞成骨基因表达谱的检测
目的:探讨体外培养人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPDL)成骨相关基因的表达谱,明确体外培养人牙周膜细胞的成骨潜能.方法:消化离心法收集体外培养人牙周膜细胞,提取总RNA,使用Superarray公司的点样数96点的人骨再生基因表达谱芯片检测人牙周膜细胞成骨相关基因的表达.结果:体外培养人牙周膜细胞有15种成骨相关基因无表达,81种基因有表达,其中表达较高的基因22种.结论:体外培养人牙周膜细胞具有部分成骨细胞基因表型特征,但成熟成骨细胞的特征基因表达量较低,提示人牙周膜细胞是具有成骨细胞分化潜能的成纤维细胞.
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国产多孔钽对成骨细胞生物相容性及其相关成骨基因表达的影响
目的 探讨国产多孔钽材料对成骨细胞粘附、增殖及成骨基因OPN、OC及FN mRNA表达的影响.方法 分离培养新生SD大鼠颅盖骨成骨细胞并鉴定.根据国家标准制备多孔钽浸提液,以多孔钽浸提液与成骨细胞作为实验组,以DMEM完全培养基培养成骨细胞作为对照组.MTT法检测多孔钽浸提液对成骨细胞生长及增殖的影响;倒置相差显微镜及扫描电镜观察成骨细胞在多孔钽上粘附、生长及增殖的情况;实时荧光定量PCR技术检测OPN、OC及FN mRNA的表达并进行定量分析.结果 肉眼及扫描电镜观察多孔钽外观呈深灰色、多孔状三维立体结构,表面及断面均匀分布直径400～600 μm的微孔,内部孔隙相互连通.MTT法检测结果显示,实验组及对照组成骨细胞培养1～8d,除第3天外,各时间点细胞光密度值差异无统计学意义(P＞0.05).成骨细胞种植于多孔钽培养结果显示,材料表面和孔隙内细胞叠层生长,分泌的骨基质完全覆盖材料表面.实时荧光定量PCR检测结果显示,实验组成骨基因OPN、OC、FN mRNA的相对表达量分别为1.45、1.79、1.69.结论 国产多孔钽材料具有良好三维立体空间构型及良好的生物相容性,可刺激成骨细胞的粘附、增殖及成骨基因OPN、OC及FN mRNA的表达.
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Nel样Ⅰ型分子基因及其促进成骨作用的研究进展
Nel样Ⅰ型分子基因作为一种新发现的颅颌面组织特异性的成骨相关基因,可能操纵了成骨基因的下游途径,并影响了信号通路,促进成骨细胞的分化.对于它的研究可能成为颅颌面骨组织工程中新的研究热点.本文对此基因的发现、作用机制和在骨组织工程中的应用前景作一综述.
