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Klotho基因超甲基化在硫酸吲哚酚诱导的血管平滑肌细胞成骨转化中的作用机制
目的：从细胞层面探讨Klotho基因超甲基化在硫酸吲哚酚（IS）诱导的血管平滑肌细胞成骨转化中的作用和相关机制。方法体外培养人主动脉血管平滑肌细胞（HASMC），以IS按0、200、500、1000μmol ／L的浓度梯度干预6 d，采用茜素红染色观察钙盐沉积，Real-time 聚合酶链式反应（PCR）和Western 印迹检测平滑肌细胞肌动蛋白α（α-SMA）、smoothin、骨桥蛋白（OPN）、碱性磷酸酶（ALP）、核结合因子α1（Cbfα1）、Klotho和不同DNA甲基化转移酶（DNMT）的mRNA和蛋白表达水平，同时利用焦磷酸测序方法检测HASMC的Klotho基因甲基化率；在IS 1000μmol／L组培养基中加入不同浓度梯度的5-氮杂脱氧胞苷（5Aza-2dc）进行干预，观察茜素红染色、各基因表达水平和Klotho基因甲基化率的改变。组间均数比较采用独立样本t检验，组间率的比较采用卡方检验。结果IS 1000μmol／L组HASMC细胞外基质呈红色，细胞结节处浓染，为钙盐沉积染色阳性。IS可以下调HASMC的α-SMAmRNA和蛋白及 smoothin 表达水平，上调OPN、ALP的mRNA和蛋白表达水平，使HASMC逐渐丧失平滑肌细胞表型而发生成骨转化。与对照组比较，IS 200、500、1000μmol ／L刺激6 d可显著升高HASMC的Klotho基因甲基化率（9±1％与4±0．7％，t＝5．38，P ＜0．01；18±1．3与4±0．7％，t＝6．92，P＜0．01；41±2％与4±0．7％，t＝9．26，P＜0．001）。IS 500、1000μmol ／L可显著下调HASMC 的Klotho mRNA和蛋白表达水平。同时IS 1000μmol ／L可显著上调 HASMC 的DNMT1 mRNA和蛋白表达水平。5Aza-2dc 10μmol ／L干预可减轻IS诱导的细胞外钙盐沉积，上调α-SMA蛋白、smoothin表达水平并下调Cbfα1蛋白表达水平，同时减低HASMC的Klotho基因甲基化率（20±1％与41±2％，t＝6．98，P＜0．01）、上调HASMC的Klotho 蛋白表达水平。结论 IS可通过上调血管平滑肌细胞DNMT表达，启动 Klotho 基因超甲基化，进而下调 Klotho 基因转录和表达，诱导血管平滑肌细胞成骨转化。
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脱氧核糖核酸甲基化在阿尔茨海默病发病机制中的研究进展
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统退行性病变,其典型病理改变是β-淀粉样蛋白(arnyloid-β,Aβ)沉积形成的老年斑和异常过度磷酸化tau蛋白形成的神经原纤维缠结.然而至今,AD的发病机制尚未完全清楚.流行病学研究表明,AD是遗传因素和环境因素共同作用的结果.近年来,随着脱氧核糖核酸(DNA)甲基化研究的逐步深入,越来越多的证据表明DNA甲基化与AD关系密切.其中与早发家族性AD相关的β淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)、早老素l、早老素2[1]及迄今为止惟一一个在多个不同种群中被证实了的主要AD风险因子ApoE等位基因(e)4[2]均在AD中发生了异常甲基化改变.异常的DNA甲基化通过影响基因的转录,进而影响相应蛋白的表达,产生相关病理变化.随着世界人口老龄化进程的加快,AD患病率呈逐年上升趋势,不仅给个人带来了极大的痛苦,而且给家庭和社会带来沉重负担,因此,明确AD的病理机制对未来AD的诊断及治疗有着重要的意义.现就近年来DNA甲基化在AD发病机制研究中所取得的进展做一综述.
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脱氧核糖核酸甲基化与胃癌RASSF1A基因失活的相关性研究
胃癌的发生发展是遗传因素、环境因素、癌基因激活、抑癌基因缺失等多步骤参与的渐进过程。RASSF1A基因是近确定的一种候选抑癌基因，它在多种人类恶性肿瘤中因启动子区甲基化而致表达缺失。DNA甲基化是指在具有胞嘧啶甲基转移活性的DNA甲基转移酶(DNMT)催化下，将甲基基团转移至某些基因的碱基上并进行转录水平调控。DNMT1是维持机体现有DNA甲基化模式的关键因素。本研究运用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)、甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific PCR，MSP)检测沉默DNMT1基因后SGC-7901细胞RASSF1A基因表达情况及DNA甲基化状态改变情况，探讨DNMT1基因与胃癌RASSF1A基因失活的关系。
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Bin1甲基化对食管鳞状细胞癌TE13细胞侵袭能力的影响
目的:检测食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)细胞株TE13中(bridge integration factor1,Bin1)甲基化状态,分析去甲基化药物5-Aza-dC去甲基化前后Bin1表达水平、甲基化状态及细胞生物活性的变化,探讨ESCC发生的可能机制及治疗策略.方法:采用qRT-PCR方法检测去甲基化前后TE13细胞Bin1 mRNA的表达,MSP法检测ESCC细胞株TE13中Binl启动子区甲基化状态,划痕实验及Transwell实验分别检测去甲基化对TE13细胞迁移及侵袭能力的影响,Western blotting法检测Bin1与基质金属蛋白酶2(MMP-2)及基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白的表达变化.结果:TE13细胞株中Bin1表现为完全甲基化状态,Bin1 mRNA呈低表达,经5-Aza-dC处理后Bin1 mRNA表达显著升高(P＜0.01);划痕试验及Transwell试验显示去甲基化处理可明显降低TE13细胞迁移、侵袭能力(P＜0.01);经5-Aza-dC处理后Bin1蛋白表达显著升高(P＜0.01),MMP-2和MMP-9蛋白表达显著降低(均P＜0.01).结论:DNA甲基化是Bin1低表达或缺失的重要机制之一,并可能通过调节MMP-2和MMP-9蛋白的表达,影响食管鳞状细胞癌细胞株TE13迁移、侵袭能力.
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FHIT基因在宫颈癌细胞中的表达及其甲基化调控
目的 探讨脆性组氨酸三联体(FHIT)基因在宫颈癌中的表达及其甲基化的调控.方法 培养4株宫颈癌细胞C-33A、HeLa、CasKi、SiHa 及1株人脐静脉血管内皮细胞ECV-304,分别用不同浓度5-氮脱氧胞苷(5-aza-dC)作为干预细胞.提取细胞的RNA,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测FHIT基因在干预前后表达变化情况;用直接记数法和四甲基偶氮唑盐(MTT)显色法检测细胞生长曲线与细胞增殖实验;以流式细胞仪分析干预前后细胞周期及凋亡率变化.结果 ①宫颈癌细胞在干预前均未见明显FHIT表达,用5-aza-dC干预后FHIT mRNA表达不同程度增强,尤其以1×10-6及2×10-6 mmol·L-1浓度干预24 h可诱导FHIT表达显著增强;正常对照组细胞在干预前后均见到较强FHIT mRNA表达(P＜0.05).②5-aza-dC干预后宫颈癌细胞生长曲线明显下降,而正常对照组细胞生长曲线无明显变化(P＜0.05).③MTT显色法结果提示,经过化学干预的宫颈癌细胞增殖速度及细胞存活率明显降低,正常细胞则无明显变化(P＜0.05).④5-aza-dC干预的宫颈癌细胞凋亡率增高,细胞周期阻滞在G1期,其中CasKi、C-33A细胞在干预浓度为2×10-6及10-6 mmol·L-1时的变化明显;而正常对照组细胞的细胞周期和凋亡率无明显变化(P＜0.05).结论 FHIT基因的甲基化是FHIT基因表达下调的重要机制,FHIT基因可能作为抑癌基因在宫颈癌的发生发展中起重要作用;而通过人为抑制FHIT的甲基化,有可能抑制肿瘤的进展.
关键词： 宫颈肿瘤 脱氧核糖核酸甲基化 基因 脆性组氨酸三联体基因 -
亲代因素对后代神经系统发育的表观遗传学影响
表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下,基因表达了可遗传的变化的一门遗传学分支学科,又被称为非孟德尔遗传.这种改变的获得是在个体发育、生长及后天经历中通过DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑和非编码RNA调控等方式实现的.人类基因组大约包含23000个功能基因,细胞的生长需要这些功能基因在特定的时间条件下准确表达.真核细胞基因组和组蛋白紧密地组装在一起,形成一个个构成染色质的基本单位——核小体.
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外周血游离DNA甲基化检测:食管鳞癌早期诊疗的新机遇
癌组织DNA甲基化作为一种典型的至关重要的表观遗传事件,已被证实在食管鳞状细胞癌的发生、发展中起重要作用.近年关于食管鳞状细胞癌患者外周血与配对癌组织进行的DNA甲基化研究已初步证明两者有较好的一致性,且相比较手术或活检获得的肿瘤组织检测,外周血游离DNA甲基化检测有着无创以及可随时重复取材的优势,有望成为食管鳞状细胞癌早期筛查诊断及治疗后动态预警复发、转移的有力手段.另外,研究显示外周血游离DNA甲基化是一类可预测肿瘤治疗敏感性的潜在标志物,为滞后的食管鳞状细胞癌个体化治疗提供新思路.
