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腺苷A1受体在妊娠期高血压以及子痫前期中的作用
目的 探讨腺苷A1受体(A1R)在妊娠期高血压以及子痫前期发病机制中的作用.方法 取剖宫产分娩的妊娠期高血压(n=6)、子痫前期(n=14)和正常对照(n=15)产妇胎盘组织,采用免疫荧光检测A1R在胎盘组织中的表达部位,蛋白质印迹法检测A1R在胎盘中的表达量.建立常氧、缺氧(8、24、48、72 h)以及缺氧复氧(8 h)滋养细胞模型,运用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测A1R在细胞中的表达情况,Transwell和蛋白质印迹法检测加入A1R拮抗剂8-环戊基-1,3-二丙基黄嘌呤(DPCPX)后对缺氧的胎盘滋养细胞侵袭性和蛋白激酶A(PKA)表达的影响.结果 A1R在胎盘表面的滋养细胞以及内皮细胞中均有表达.与正常胎盘比较,A1R在轻度和重度子痫前期胎盘组织中表达升高(P＜0.01).A1R在体外胎盘滋养细胞缺氧模型中的表达随着缺氧时间的延长而逐渐升高(P＜0.05).胎盘滋养细胞缺氧模型中滋养细胞的侵袭能力较正常组下降(P＜0.01),PKA表达下降(P＜0.05);加入拮抗剂DPCPX可以增强滋养细胞的侵袭性(P＜0.05),同时上调PKA的表达水平(P＜0.05).结论 缺氧程度的增加可以使A1R表达升高,A1R在胎盘滋养细胞中的作用机制可能与调节PKA相关.
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蛋白激酶A和蛋白激酶C对大鼠背根神经节神经元P2X3受体介导的内向电流的调节作用
目的 探讨蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)对分离培养的背根神经节(DRG)神经元ATP受体P2X3功能的调节作用.方法 分离培养大鼠DRG神经元,给予外源性ATP诱导出瞬时型内向电流,通过全细胞膜片钳记录的方法观察P2X3和P2X2/3受体特异性阻断剂TNP-ATP对这一电流的影响,在此基础上观察PKA和PKC激动剂对ATP诱导的瞬时型内向电流的调节作用.结果 在分离培养的DRG神经元上,ATP诱导的瞬时型电流可以被TNP-ATP抑制,其抑制效应呈剂量依赖性,半数有效剂量(IC50)为(21.7±7.6)nmol/L.PKA激动剂forskolin(1 μmol/L)和PKC激动剂PMA(1 μmol/L)均可以快速、可逆地抑制ATP诱导的瞬时型电流.结论 在大鼠分离培养的DRG神经元,PKA和PKC可能通过磷酸化调节抑制P2X3受体的功能,从而抑制ATP诱导的瞬时型内向电流,提示蛋白激酶对P2X3受体的调节作用可能参与痛觉的形成.
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激活蛋白激酶A信号对阿霉素肾病小鼠足细胞失分化的影响
目的·探讨体内激活蛋白激酶A(PKA)对阿霉素(ADR)肾病小鼠足细胞失分化以及蛋白尿的作用.方法·选择6~8周龄BALB/c雄性小鼠分为3组:ADR组予以ADR 10 mg/kg尾静脉注射构建ADR肾病小鼠模型,A+P组为ADR肾病小鼠予PKA信号激动剂pCPT-cAMP 50 mg/(kg·d)腹腔注射,对照组不做任何干预.蛋白电泳+考马斯蓝染色方法观察小鼠尿白蛋白变化,WT-1免疫组化染色观察足细胞数量,免疫荧光双染观察足细胞的损伤.结果·与对照组相比,ADR肾病小鼠尿白蛋白/肌酐比值显著升高,肾小球足细胞数量显著降低,足细胞特异性蛋白synaptopodin和podocalyxin表达明显下降,足细胞受损伤失分化标志蛋白desmin表达增多.pCPT-cAMP干预后ADR小鼠白蛋白/肌酐比值降低,WT-1阳性细胞和synaptopodin和podocalyxin表达增多,desmin表达减少.结论 ·pCPT-cAMP激活PKA信号后可减轻ADR肾病小鼠足细胞损伤,防止足细胞数量减少,减轻蛋白尿.其作用可能与pCPT-cAMP防止ADR肾病小鼠足细胞失分化相关.
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蛋白激酶A部分通过环磷腺苷效应元件结合蛋白信号防止足细胞凋亡
目的 探讨转录因子环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)在蛋白激酶A(PKA)信号防止足细胞损伤中的作用.方法 使用条件永恒的小鼠足细胞株(5P12) 14 ～25代分化的足细胞进行研究,细胞分为对照组、阿霉素(ADR)处理组(ADR组)和PKA特异性激动剂(pCPT-cAMP)预孵育+ADR刺激组(pCPT-cAMP+ADR组).CCK-8法检测细胞毒性;Western blotting检测足细胞内被切割的半胱氨酸蛋白酶-3(cleavedcaspase-3)表达;siRNA抑制细胞内CREB表达,免疫荧光共聚焦显微镜和Western blotting检测磷酸化CREB(p-CREB)的定位和表达.结果 ADR诱导足细胞内cleaved caspase-3表达升高,pCPT-cAMP预孵育可显著降低ADR诱导的cleaved caspase-3表达上升.ADR使足细胞减少为原来的(40.45±6.78)％,pCPT-cAMP预孵育使细胞数量恢复为原来的(69.8±5.48)％.Western blotting检测结果显示:pCPT-cAMP分别预孵育5、15 min可使足细胞总蛋白中p-CREB表达分别上升(105.64±38.21)％和(98.61±41.03)％,细胞核内p-CREB的表达上升(114.52±11.28)％和(118.84±14.44)％.免疫荧光共聚焦显微镜检测显示pCPT-cAMP主要引起细胞核内p-CREB表达上升.siRNA可使足细胞CREB蛋白表达下降为原来的(25.1±2.44)％,且pCPT-cAMP预孵育不能防止ADR诱导的cleaved caspase-3表达升高.结论 转录因子CREB介导了PKA信号对足细胞的保护作用.
关键词： 足细胞 环磷酸腺苷 蛋白激酶A 环磷腺苷效应元件结合蛋白 凋亡 -
甘麦大枣汤加味对抑郁症大鼠海马cAMP-蛋白激酶A途径的影响
目的:探讨甘麦大枣汤加味方对抑郁症模型大鼠海马信号转导cAMP-蛋白激酶A(PKA)途径的影响.方法:以孤养加慢性不可预见性中等刺激所致抑郁症大鼠为模型,灌服甘麦大枣汤加味方,通过旷场行为测定、糖水消耗试验观察行为变化,放免法测定海马cAMP含量以及原位杂交法测定海马5-HT1A受体、PKA mRNA表达.结果:模型组大鼠垂直活动、水平运动及糖水消耗显著下降,海马cAMP、PKAmRNA表达显著上升(P＜0.01).用药组与模型组比较,水平运动及垂直活动上升,糖水消耗增加,cAMP含量显著下降,PKA mRNA表达显著下降(P＜0.01)且呈量效关系.结论:甘麦大枣汤加味方下调抑郁症大鼠海马信号转导cAMP-PKA途径可能是该方纠正抑郁症模型大鼠行为学变化的环节之一.
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RyR2磷酸化在心力衰竭中的作用
心力衰竭在细胞水平主要表现为心肌以兴奋-收缩耦联(excitement-contraction coupling,ECC)为基础的收缩功能障碍,而Ca2信号转导在此过程中起着非常重要的作用.肌浆网(sarcoplasmic reticulum,SR)兰尼碱受体(ryanodine receptor type 2,RyR2)是心肌重要的钙释放通道,RyR2磷酸化是肌浆网钙释放的基础,而RyR2磷酸化主要受蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)和钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)的调控.目前对RyR2磷酸化的研究已经非常广泛,但对其涉及心力衰竭的具体发病机制仍有争议,本综述主要针此问题进行阐述.
关键词： 兰尼碱受体 心力衰竭 蛋白激酶A 钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ -
蛋白激酶A激活和磷脂酶A2抑制参与腺苷对大鼠肾髓袢升支粗段管周膜50pS钾通道的易化效应
本文旨在研究蛋白激酶A(protein kinaseA,PKA)和磷脂酶A2 (phospholipase A2,PLA2)在腺苷对髓袢升支粗段管周膜50pS钾通道刺激过程中的作用.解剖显微镜下分离髓袢升支粗段,膜片钳技术记录50 pS钾通道电流,免疫印迹技术测定PKA及PLA2磷酸化水平的蛋白表达情况.结果显示,环己基腺苷苷(cyclohexyladenosine,CHA,一种腺苷类似物)可增加50 pS钾通道的活性(P＜0.05).在PKA阻断剂H8的存在下,CHA不再增加50 pS钾通道的活性.在PLA2阻断剂AACOCF3存在下,CHA不再增加50 pS钾通道的活性.CHA可以增加髓袢升支粗段中PKA的磷酸化水平,而抑制PLA,的磷酸化水平(P＜0.01).在AACOCF3存在下,CHA依旧可以增加PKA的磷酸化水平(P＜0.01)；在H8存在下,CHA不再抑制PLA2的磷酸化水平(P＞0.05).以上结果提示,腺苷对髓袢升支粗段管周膜50 pS钾通道的刺激作用是通过先激活PKA,而后再抑制PLA2途径而实现的.
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蛋白激酶A对CDC25B蛋白S149与S321位点磷酸化的修饰抑制小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂
在小鼠1-细胞期受精卵,蛋白激酶A (protein kinase A,PKA)可通过磷酸化细胞分裂周期25B (cell division cycle 25B,CDC25B)的321位Ser引起受精卵分裂阻滞.本文旨在研究PKA对CDC25B 149位点Ser的磷酸化对小鼠受精卵发育的影响,及其与321位点的关系.质粒pBSK-CDC25B-WT (野生型)、pBSK-CDC25B-S149A (149位Ser突变成Ala)、pBSK-CDC25B-S321A (321位Ser突变成Ala)、pBSK-CDC25B-S 149A/S321A (149位和321位Ser联合突变成Ala)体外转录成mRNAs;显微注射入小鼠S期受精卵中,在PKA抑制剂H-89预处理的M16培养基中培养,观察其对受精卵发育、有丝分裂成熟促进因子(maturation promoting factor,MPF)活性及CDC2-Tyrl5磷酸化状态的影响.结果显示,H-89呈剂量(0～50 μmol/L)依赖性的方式加速小鼠受精卵卵裂.然后选择卵裂率接近100％、H-89 (40 μmol/L)培养的小鼠受精卵,与对照组相比,CDC25B各种mRNAs注射组受精卵卵裂率明显增高,MPF活性提前达到高峰；CDC2-Tyrl5磷酸化状态和MPF活性变化相一致,以上结果说明,CDC25B蛋白的149位Ser也是PKA在体内调控CDC25B的重要靶点.因此在小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂过程中,PKA对小鼠CDC25B蛋白S149位点与S321位点的磷酸化修饰可能是控制受精卵G2/M转换的重要方式.
关键词： 细胞分裂周期25B 蛋白激酶A 有丝分裂成熟促进因子 H-89 小鼠受精卵 -
Anisomycin过度激活丝裂原活化蛋白激酶使tau发生过度磷酸化
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的病理特征之一是神经元内存在神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs),后者是由过度磷酸化的微管相关蛋白tau形成的双股螺旋细丝(paired helical filaments,PHFs)构成.为了探讨丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)在微管相关蛋白tau磷酸化中的作用及机制,本实验用0.1 μg/mL、0.2 μg/mL和0.4μg/mL三种不同浓度的MAPK激动剂anisomycin处理小鼠成神经瘤细胞株(mouse neuroblastoma cells,N2a),检测MAPK活性的变化及其与tau蛋白多个AD相关位点过度磷酸化的关系,并检测糖原合酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3,GSK-3)和蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)的活性变化.结果显示,anisomycin以剂量依赖的方式激活MAPK活性,但免疫印迹结果显示tau蛋白的Ser-198/199/202位点和Ser-396/404位点的过度磷酸化只在anisomycin浓度为0.4 μg/mL时出现,三种浓度的anisomycin均未引起tau蛋白Ser-214位点磷酸化的改变;同时,GSK-3活性在anisomycin为0.1 μg/mL时没有明显变化,当anisomycin浓度升高到0.2 μg/mL和0.4 μg/mL时出现明显增高,而PKA的活性没有明显的改变.使用GSK-3的特异性抑制剂氯化锂(LiCl)则完全阻断MAPK被过度激活导致的tau蛋白磷酸化水平的增高,而同时MAPK活性不受影响.以上结果提示:过度激活MAPK可以导致tau蛋白Ser-198/199/202和Ser-396/404位点过度磷酸化,其机制可能涉及MAPK激活GSK-3的间接作用.
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蛋白激酶A介导慢性压迫背根节神经元的肾上腺素能兴奋反应
本实验在背根节(DRG)慢性压迫模型上, 采用离体灌流DRG和单纤维记录神经元自发放电的方法研究了初级感觉神经元的交感-感觉耦联作用及其细胞内机制.用外源性去甲肾上腺素(NE, 10 μmol/L)浸浴损伤的DRG时, 在95个DRG神经元中有85个有自发放电的神经元产生明显反应.其中, 44个呈现单纯兴奋效应, 21个表现先兴奋后抑制效应, 6个出现兴奋-抑制交替振荡现象, 14个表现抑制效应.NE对损伤神经元的兴奋作用可分别被哌唑嗪(5 μmol/L)和育亨宾(10 μmol/L)明显阻断.蛋白激酶A(PKA)选择性抑制剂 Rp-cAMPS(50～250 μmol/L)和PKA催化亚单位抑制剂H-89(10 μmol/L)可以明显减弱NE的兴奋作用.此外, 腺苷酸环化酶抑制剂SQ22, 536(1 mmol/L)亦明显减弱NE的兴奋作用.结果显示: 在DRG慢性压迫模型上, 损伤的DRG神经元存在肾上腺素能敏感性, α1和α2 肾上腺素受体以及PKA介导兴奋性肾上腺素能敏感化作用.
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雌激素的心脏保护作用——与β1-肾上腺素受体的相互作用及其信号通路
雌激素是女性体内主要的类固醇性激素.对于心肌缺血性伤害,切除卵巢的成年雌性大鼠在β-肾上腺素受体激动时,比正常雌性大鼠呈现更严重的心肌损伤;而去卵巢后的雌激素替补组大鼠对β-肾上腺素受体激动时心肌缺血性伤害的反应则又回复到正常雌性大鼠水平,这为雌激素对抗缺血性伤害的心脏保护作用提供了证据.雌激素的这种保护作用是通过下调β1-肾上腺素受体的表达来实现的.也有研究证明,雌激素能抑制蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)的表达和活性,PKA是Gs蛋白/腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase,AC)/cAMP/PKA通路的第二信使,而该通路终影响心肌的收缩功能.有初步证据表明雌激素还能抑制β1-肾上腺素受体通路下游的另一种第二信使钙调蛋白激酶Ⅱ-δc(Ca2+/calmodulin kinase Ⅱ-δc,CaMKⅡ-δc)的活性,而CaMKⅡ-δc参与PKA非依赖性的细胞凋亡.即时给予生理浓度雌激素可不通过雌激素受体而直接抑制心肌β1-肾上腺素受体并减弱Ca2+内流.此外,脑研究也显示雌激素能抑制负责调节动脉血压脑区的β广肾上腺素受体活性.因此,雌激素和β1-肾上腺素受体之间的相互作用及其信号通路十分复杂.雌激素不仅主导性别决定,在机体其它功能例如心脏保护方面也具有重要作用.
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P KA信号通路影响D-半乳糖诱导老化心肌细胞舒张功能障碍的机制
目的：探讨D-半乳糖诱导老化的心肌细胞舒张功能障碍的机制。方法实验用药物预处理后予以D-半乳糖建立鼠心肌细胞老化模型。分为4组：正常对照组（ C组）、D-半乳糖组（ D-G组）、cAMP依赖蛋白激酶A（ PKA）预激动组（ D-G＋cAMP组）和PKA预抑制组（ D-G＋H-89组）；测定心肌细胞肌浆网钙摄取能力，肌浆网Ca2＋-ATP酶（ SERCA，心脏主要是SERCA2a）活性以及Western blot检测第16位丝氨酸磷酸化受磷蛋白（ Ser16 phos-phorylated phospholamban，Ser16-PLN）的含量。结果与 C 组相比， D-G 组、D-G＋H-89组舒张期钙离子浓度[（[ Ca2＋] i ） D ]升高，钙离子回摄时间（ tβ）延长，给予咖啡因刺激后，钙离子增幅（△[ Ca2＋] i ）减少；细胞内SERCA2a活性下降以及Ser16-PLN表达下调（ P＜0.05）。与D-G组相比，D-G-H-89组（[ Ca2＋] i ） D水平进一步升高，tβ进一步延长，给予咖啡因刺激后，△[ Ca2＋] i明显降低，SERCA2a活性下降，Ser16-PLN表达下调。而D-G＋cAMP组（[ Ca2＋] i ） D水平明显降低， tβ缩短，△[ Ca2＋] i增高，细胞内SERCA2a明显提高，Ser16-PLN表达增加。结论 D-半乳糖可能是通过抑制PKA通路，下调Ser16-PLN的磷酸化水平，增加对SERCA2a活性的抑制，从而引起老化心肌细胞舒张功能障碍。
关键词： 蛋白激酶A Ser16-PLN 肌浆网Ca2+-ATP酶 肌浆网钙失调 心肌老化 -
鞘内注射吗啡加可乐定对切口痛大鼠脊髓背角蛋白激酶A催化亚单位表达的影响
目的 观察鞘内注射(intrathecal injection,IT)吗啡加可乐定对切口痛大鼠脊髓背角蛋白激酶A(protein kinaseA,PKA)催化亚单位表达的影响.方法 选择鞘内置管成功的雄性SD大鼠80只,随机分为5组,每组16只,分别为假手术组、对照组、吗啡2.5μg组、可乐定5 μg组和吗啡2.5 μg+可乐定5μg组.按Yaksh法鞘内置管,按Brennan法制作大鼠足底切口疼痛模型,用机械缩爪反射阈值(mechanical withdrawal threshold.MWT)和热缩爪潜伏期(thermal withdrawal latency,TWL)观察疼痛行为学变化,应用免疫组织化学法和免疫印迹法测定大鼠脊髓背角PKA催化亚单位表达的变化.结果 与假手术组比较,术后2h对照组大鼠的MWT明显降低,TWL明显缩短(P<0.01),脊髓背角PKA催化亚单位免疫反应阳性神经元数量和神经元胞浆内PKA催化亚单位表达明显增加(P<0.01);与对照组比较,吗啡2.5μg+可乐定5μg组大鼠的MWT明显增加,TWL明显延长(P<0.01),脊髓背角PKA催化亚单位免疫反应阳性神经元数量和神经元胞浆内PKA催化哑单位表达明显减少(P<0.01);而吗啡2.5μg组和可乐定5μg组大鼠的MWT、TWL、脊髓背角PKA催化亚单位免疫反应阳性神经元数量和神经元胞浆内PKA催化亚单位表达与对照组比较均无统计学意义.结论 在大鼠切口痛模型中,IT可乐定能增强吗啡的抗伤害作用,其机制可能与其抑制切口痛引起的脊髓背角PKA催化亚单位的表达增加有关.
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降钙素基因相关肽对大鼠心室肌细胞膜ATP敏感性钾离子通道的影响
目的 探讨降钙素基因相关肽(CGRP)与大鼠心室肌细胞膜ATP敏感性钾通道(KATP)之间的关系及其信号转导通路.方法 酶解法急性分离SD大鼠心室肌细胞,采用Langendroff灌流装置,分别用含0.1 nmol/L CGRP、1 nmol/LCGRP8-37(CGRP特异性阻滞剂)、1μmol/LH-89(蛋白激酶A阻滞剂)的细胞外液灌流心室肌细胞,每个细胞采用给药前后自身对照,标准的全细胞膜片钳技术记录KATP电流,待细胞电流稳定后,观察不同药物对KATP电流的影响.结果 0.1nmol/L CGRP对KATP电流有明显的激活作用,电流密度-电压(I-V)曲线明显上移(P＜0.05).1nmol/L CGRP8-37和1μmol/L H-89可使CGRP激活的KATP电流明显降低,I-V曲线明显下移(P＜0.05).结论 心肌细胞上CGRP与其特异性受体结合,通过蛋白激酶A激活KATP,增强KATP电流.
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蛋白激酶A与物质依赖
综述蛋白激酶A基本结构与功能、成瘾物质对蛋白激酶A的影响以及蛋白激酶A对药物滥用行为学反应及与物质依赖的研究进展.
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大鼠初级感觉神经元内PKA/CREB通路在骨癌痛中的作用
目的:观察蛋白激酶A拮抗剂H-89对骨癌痛大鼠疼痛行为和背根神经节环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)磷酸化水平的影响.方法:①检测骨癌痛大鼠背根神经节CREB磷酸化水平:将32只雌性SD大鼠随机分为假手术组和骨癌痛组(n=16),分组后在大鼠右侧胫骨髓腔内分别注射PBS或乳腺癌Walker 256细胞,肿瘤细胞接种后1,3,7,10,14 d检测大鼠机械痛阈,第14天提取骨癌痛组大鼠第2至第5腰椎右侧的背根神经节,应用免疫印迹法检测磷酸化CREB(p-CREB)的表达量.②检测H-89对大鼠疼痛行为及CREB磷酸化的影响:将32只骨癌大鼠随机均分为DMSO组和H-89组.在肿瘤细胞接种后的第9天至第14天每天鞘内注射DMSO或H-89.分别在给药前、给药后15,30,45和60 min进行疼痛行为测试.在第14天后一次鞘内给药1h后,快速提取大鼠右侧背根神经节,应用免疫印迹法检测p-CREB的表达量.结果:与假手术组比较,骨癌痛组大鼠机械痛阈明显降低,背根神经节中CREB磷酸化水平升高(P＜0.05).鞘内注射DMSO或H-89后,H-89组大鼠机械痛阈较DMSO组明显升高.同时H-89组CREB磷酸化水平较DMSO组明显降低(P＜0.01).结论:蛋白激酶A通过CREB磷酸化加剧大鼠骨癌痛.
关键词： 蛋白激酶A 骨癌痛 背根神经节 环磷腺苷效应元件结合蛋白 -
蛋白激酶A催化微管相关蛋白tau磷酸化的研究
目的:研究蛋白激酶A(PKA)对微管相关蛋白tau的磷酸化作用.方法:采用免疫印迹技术,利用位点特异性、磷酸化依赖的tau蛋白抗体,检测PKA对tau蛋白磷酸化作用的位点特异性及磷酸化作用动力学.用双倒数作图,计算PKA催化tau磷酸化以及各个位点磷酸化的Km值,并结合培养细胞的实验,研究PKA对tau蛋白磷酸化作用的位点特异性.结果:PKA催化tau蛋白在Ser214,Ser262,Ser409三个位点磷酸化,而且各位点磷酸化作用的Km值不同,PKA对Ser214的Km值低,即对Ser214位点的亲和性高,催化其磷酸化的能力强.在细胞实验中,也显示了PKA引起Ser214位点的磷酸化明显.结论:PKA催化tau蛋白在Ser214,Ser262,Ser409三个位点磷酸化,其中Ser214是PKA催化tau磷酸化反应的好位点.
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RhoA和蛋白激酶A对胃癌细胞迁移的影响
目的:研究RhoA 对胃癌细胞迁移的作用和蛋白激酶A对这一作用的影响.方法:采用Boyden槽迁移率分析法和刮除-迁移分析法,观察RhoA激动剂LPA及PKA激动剂cAMP对人胃癌细胞SGC-7901迁移活动的影响.结果:加入RhoA激动剂LPA后,癌细胞迁移活动明显增强.加入PKA激动剂cAMP后再加入RhoA激动剂LPA,癌细胞迁移活动不再出现明显变化.结论:RhoA活化可促进SGC-7901细胞迁移,PKA可通过抑制RhoA活性而阻止该细胞迁移.
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8-Br-cAMP联合顺铂作用于肺腺癌细胞A549的初步研究
目的:观察8-溴-环腺苷酸(8-Br-cAMP)联合顺铂(DDP)对人肺腺癌细胞A549生长及其表皮生长因子受体(EGFR)表达的影响.方法:MTT法测定不同浓度8-Br-cAMP、DDP以及两药联用处理人肺腺癌细胞A549后细胞增殖活性的差异;应用RT-PCR技术检测EGFR mRNA表达水平的变化;Western blot技术检测EGFR蛋白表达水平的变化;利用流式细胞术测定细胞周期的改变.结果:8-Br-cAMP及DDP均能抑制人肺腺癌细胞A549的增殖,并呈浓度及时间依赖性;DDP联合8-Br-cAMP细胞抑制率显著高于相应浓度单药组(P<0.05),两者呈现出相加的抗瘤效果.8-Br-cAMP可下调人肺腺癌A549细胞EGFR mRNA和蛋白的表达.8-Br-cAMP将细胞周期阻滞在G2/M期(P<0.05).结论:8-Br-cAMP、DDP均可抑制A549细胞增殖.8-Br-cAMP可显著提高顺铂的细胞毒作用,增强化疗效果,并将细胞阻滞于G2/M期.8-Br-cAMP可以下调EGFR表达,可一定程度地逆转化癌细胞.
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蛋白激酶A 对小鼠皮层神经元酸敏感离子通道的调节
目的:探讨蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)对小鼠皮层神经元酸敏感离子通道(acid sensing ion channels,ASICs)功能的影响及机制.方法:取原代培养小鼠皮层神经元,通过应用钙影像、全细胞膜片钳、免疫荧光和Western Blot等技术,分别观察PKA 激动剂和抑制剂对ASICs 功能的影响及机制.结果:(1)在给予PKA 激动剂或抑制剂前神经元ASICs 电流幅值约为(224.2±17.59) pA(n=15),预孵育PKA 激动剂forskolin(10 μmol/L)使电流幅值减小为(108±14.67) pA(n=9),与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01),而预孵育PKA 抑制剂PKAI(5 μmol/L)则使电流幅值增加为(306.3±22.9) pA(n=12),与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01);(2)在给予PKA 激动剂或抑制剂前,酸诱导的胞内钙△F/F值为(0.708±0.07)(n=20),PKA 激动剂forskolin(10 μmol/L)使其减少为(0.140±0.013)(n=17),与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01),PKA 抑制剂PKAI(5 μmol/L)使其增加为(0.978±0.108)(n=19),与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01);(3)在加入forskolin 或PKAI 24 h 后,神经元ASIC1 总荧光密度无明显改变(P>0.05),但神经元ASIC1 膜荧光密度从对照组的(78.58±7.42)(n=32)减少到forskolin 孵育后的(31.41±3.38)(n=57),与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01),而PKAI 孵育后神经元ASIC1 膜荧光密度增加到(118.29±11.50)(n=34),与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01).结论:PKA 通过影响ASICs 膜分布负性调节小鼠皮层神经元ASICs 电流及由酸诱导的胞内钙增加.
