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睡眠剥夺抗抑郁机制中腺苷及其受体对海马蛋白激酶A的影响
目的:研究快眼动睡眠剥夺(REMSD)抗抑郁机制中腺苷及其受体对海马蛋白激酶(PK)A的影响.方法:成年雄性SD大鼠分为正常对照组(8只)和应激模型组(48只.经21 d慢性不可预见性应激(CUS)、蔗糖水消耗和强迫游泳实验测试后再随机分为抑郁模型组、睡眠剥夺组、水环境对照组、NS对照组、腺苷A1受体拮抗剂组、腺苷A2A受体拮抗剂组(每组8只),行72h REMSD,以免疫组化的方法检测海马PKA的表达).结果:应激模型组蔗糖水消耗量明显降低(P＜0.01),强迫游泳实验中的不动时间明显增加(P＜0.01).海马CA1区PKA的表达无统计学意义,抑郁模型组海马CA3区PKA水平明显降低(P＜0.01).与抑郁模型组比,睡眠剥夺组、腺苷A1受体拮抗剂组海马CA3区PKA水平升高(P＜0.01,P＜0.05),腺苷A2A受体拮抗剂组无统计学意义.结论:72h REMSD可以提高抑郁模型海马CA3区PKA的表达,在72 h REMSD过程中腺苷A1受体的失活可使海马CA3区PKA的表达增加,而腺苷A2A受体失活则无此效应.
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丙泊酚或依托咪酯对大鼠海马胶质纤维酸性蛋白表达的影响
目的 观察丙泊酚或依托咪酯对出生28 d大鼠海马胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)和环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cyclic AMP response element binding protein,CREB)表达的影响.方法 选取雄性SD大鼠60只,随机分为对照组、丙泊酚组和依托咪酯组,每组20只.丙泊酚组腹腔注射丙泊酚总量为200 mg/kg,依托咪酯组腹腔注射依托咪酯总量为60mg/kg,对照组不注射任何药物.血气分析仪检测大鼠动脉血呼吸和代谢指标的变化,免疫组织化学染色法检测大鼠海马组织中GFAP的表达,并应用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测大鼠海马组织中PKA和CREB mRNA的表达.结果 各组大鼠动脉血pH值、氧分压、二氧化碳分压、HCO-3、BE、氧饱和度之间比较差异无统计学意义(P>0.05);丙泊酚组与依托咪酯组GFAP的平均积分光密度值均高于对照组(P<0.05),而丙泊酚组与依托咪酯组比较差异无统计学意义(P>0.05);与对照组比较,丙泊酚组与依托咪酯组PKA和CREB mRNA的表达均降低(P<0.05),丙泊酚组与依托咪酯组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 丙泊酚或依托咪酯可能通过抑制PKA-CREB信号通路而损害大鼠海马神经元,使星形胶质细胞反应性增生、GFAP表达增加.
关键词： 丙泊酚 依托咪酯 胶质纤维酸性蛋白 蛋白激酶A 环磷酸腺苷反应元件结合蛋白 -
纳洛酮在细胞信号转导系统中对甲硫氨酸脑啡肽的拮抗作用
目的:探讨甲硫氨酸脑啡肽对细胞信号转导系统的影响及其机制.方法:用甲硫氨酸脑啡肽及不同浓度的纳洛酮处理小鼠的骨髓瘤细胞(NS-1),采用组蛋白磷酸化法测定NS-1细胞蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)的活性.结果:1×10-6 mol/L的甲硫氨酸脑啡肽可以升高NS-1细胞胞浆PKA活性,却降低胞浆PKC活性,而且这2种作用均能被不同浓度的纳洛酮所拮抗.结论:甲硫氨酸脑啡肽通过传统的阿片受体机制参与了2条(cAMP-PKA途径及DG-PKC途径)胞外信号传递系统的信号传递.
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甲硫氨酸脑啡肽和抗δ阿片受体抗体对小鼠骨髓瘤细胞信号转导系统的影响
目的:探讨甲硫氨酸脑啡肽对小鼠骨髓瘤细胞信号转导系统的作用及其机制.方法:用不同浓度甲硫氨酸脑啡肽(methionine enkep-halin,MENK)及抗δ阿片受体单克隆抗体处理小鼠的骨髓瘤细胞(NS-1),采用组蛋白磷酸化法测定NS-1细胞蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)的活性,并采用放射免疫分析法测定其三磷酸肌醇(IP3)的含量.结果:MENK可升高细胞胞浆及胞膜PKA的活性,且这一作用可被抗δ阿片受体抗体所拮抗.MENK对PKC影响呈双向反应,0.1μmol/L MENK可以升高胞浆PKC活性,但却明显降低胞膜PKC活性;MENK浓度为10μmol/L时PKC活性的改变则与此相反;1μmol/L的MENK可明显降低胞浆及胞膜PKC活性,抗体可拮抗这种下调作用.MENK可降低细胞内IP3的含量,且这一作用可被抗δ阿片受体抗体所拮抗.结论:MENK在与δ阿片受体结合后,可以通过多种信号转导系统来调节细胞功能,从而产生不同的生物效应.
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Epac信号分子与哮喘关系研究进展
支气管哮喘是临床常见的气道慢性炎症性疾病，以气道高反应性、慢性气道炎症和气道重塑为病理生理特征，其发病机制目前尚未完全阐明。环磷酸腺苷(cAMP)是体内重要的第二信使，参与调控机体新陈代谢、细胞钙信号传导、细胞生长与分化、凋亡等多种病理生理过程。长期以来，蛋白激酶A (PKA)被认为是介导cAMP生物学效应的唯一下游信号分子。但新近发现的新型cAMP靶分子——cAMP直接激活的交换蛋白(Epac)的发现打破了这一说法。大量研究证实，Epac可单独或协同PKA介导cAMP的多种生物学效应。本文就Epac在支气管哮喘发病中的作用及其可能机制作一综述，为寻找哮喘治疗新靶点奠定基础。
关键词： 支气管哮喘 环磷酸腺苷 cAMP直接激活的交换蛋白 蛋白激酶A -
灵芝多糖对小鼠T细胞蛋白激酶A和蛋激酶C活性的影响
目的：观察灵芝多糖体外对小鼠T细胞蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)活性是否有影响。方法：采用反相离子对高效液相色谱法测定PKA和PKC活力。结果：灵芝多糖GLB7能引起T细胞中PKA和PKC活性明显增强并具有剂量依赖性，达峰时间分别为5min和20min，于20min及1h分别恢复到基础水平；GLB7还可引起T细胞中PKC发生质膜转位，并拮抗Staurosporine对T细胞中PKC的抑制作用。结果：灵芝多糖的免疫增强和抗肿瘤作用与其增强PKA和PKC活性有关。
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艾塞那肽改善缺氧复氧条件下心肌H9c2细胞线粒体功能的机制研究
目的:研究艾塞那肽改善缺氧复氧(H/R)条件下心肌H9c2细胞线粒体功能的机制.方法:体外培养H9c2细胞,分为空白对照组、药物对照(艾塞那肽200 nmol/L)组、模型(H/R)组、预处理(艾塞那肽200 nmol/L+H/R)组、胰高血糖素样肽1受体(GLP-1R)抑制剂[Exendin-(9-39)100 nmol/L+艾塞那肽200 nmol/L+H/R]组、环磷腺苷(cAMP)抑制剂(Rp-cAMPS 1μmol/L+艾塞那肽200 nmol/L+H/R)组和蛋白激酶A(PKA)抑制剂(H-895μmol/L+艾塞那肽200 nmol/L+H/R)组.除前2组外其余各组建立H/R模型,建模前30 min加入艾塞那肽,加入艾塞那肽前10 min加入相应的抑制剂.采用透射电镜观察线粒体形态结构,流式细胞术检测线粒体钙离子(Ca2+m)水平及线粒体膜电位(ΔΨm),酶标仪检测细胞三磷酸腺苷(ATP)水平.结果:与空白对照组比较,模型组细胞线粒体嵴肿胀增加,密度降低,呈空泡化;Ca2+m水平升高,ΔΨm和ATP水平降低(P<0.05).与模型组比较,预处理组细胞线粒体嵴肿胀减轻,密度增加,空泡化程度减轻;Ca2+m水平降低,ΔΨm和ATP水平升高(P<0.05).与预处理组比较,3种抑制剂组细胞Ca2+m水平升高,ΔΨm和ATP水平降低(P<0.05).结论:艾塞那肽可减轻H/R条件下H9c2细胞线粒体钙超载,升高ΔΨm,增加ATP生成.其机制可能与激活GLP-1R/cAMP/PKA信号通路有关.
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毛木耳多糖对小鼠腹腔巨噬细胞蛋白激酶 A活性的影响
目的：观察毛木耳多糖（ APSP）体外对小鼠腹腔巨噬细胞（ MΦ）蛋白激酶 A（ PKA）活性的影响。方法：采用反相离子对高效液相色谱法测定 MΦ中 PKA活力。结果：毛木耳多糖（ 80mg/L）能引起小鼠腹腔 MΦ中 PKA活性明显升高， 8min达峰值， 20min恢复到基础水平； 8min毛木耳多糖与 PKA活性的量效关系具有一定的浓度依赖性。结论：毛木耳多糖的免疫增强作用与其增强 MΦ中 PKA活性有关。
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高密度脂蛋白对氧化型低密度脂蛋白刺激下脂肪细胞TNF-α表达的影响
目的 观察高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)对氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)刺激下3T3-L1脂肪细胞肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)mRNA表达的影响,并探讨其可能的作用机制.方法 3T3-L1脂肪细胞促分化成熟后,oxLDL刺激脂肪细胞,给予不同浓度的HDL(10 ～ 100 μg/ml),及H-89(10 μmol/L)+HDL(100 μg/ml)干预,收集细胞,测定脂肪细胞TNF-α mRNA表达水平,IκB蛋白浓度及核因子-κB(NF-κB)活性.结果 OxLDL刺激使3T3-L1脂肪细胞TNF-α mRNA表达及NF-κB活性明显增强.HDL浓度依赖性抑制TNF-α mRNA表达、NF-κB活化和IκB降解.与oxLDL刺激组比较,100 μg/ml HDL使TNF-α mRNA表达降低64.5％,NF-κB活性减少49％,并明显增加IκB蛋白水平.HDL的这些抗炎效应能被蛋白激酶A(PKA)抑制剂H-89部分抑制.结论 HDL能抑制oxLDL诱导的3T3-L1脂肪细胞TNF-α mRNA表达,PKA-IκB-NF-κB信号通路是其中作用途径之一,该效应不需要HDL与oxLDL的直接接触作用.
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L-4F对oxLDL刺激下脂肪细胞表达单核细胞趋化蛋白-1的影响
目的 观察载脂蛋白A-I模拟肽L-4F对氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)刺激下3T3-L1脂肪细胞分泌表达单核细胞趋化蛋白-1( MCP-1)的影响,并探讨其可能的作用机制.方法 3T3-L1脂肪细胞促分化成熟后,oxLDL(50 μg/ml)刺激脂肪细胞,给予L-4F( 1-50 μg/ml),H-89( 10μmol/L)及H-89+ L-4F(50μg/ml)干预,收集细胞,测定脂肪细胞MCP-1上清液中的浓度和mRNA表达水平,以及脂肪细胞核因子C/EBPα、β的蛋白质水平；改良Boyden小室法检测不同干预组上清液对人外周血单核细胞趋化活性的影响.结果 OxLDL(50 μg/ml)刺激使分化成熟的3T3-L1脂肪细胞表达及分泌MCP-1明显增加,并使得诱导的单核细胞移动距离明显增加.L-4F以浓度依赖的方式减少脂肪细胞MCP-1的表达和分泌,降低单核细胞趋化活性；50 μg/ml L-4F使MCP-1 mRNA的表达降低(91±6)％(P＜0.01).PKA抑制剂H-89(10 μmol/L)干预oxLDL刺激的脂肪细胞后MCP-1 m RNA的表达也显著减少(P＜0.01),但是,在50μg/ml L-4F作用的基础上,H-89(10 μmol/L)的孵育并未使得MCP-1 mRNA的表达进一步降低(P＞0.05).50μg/ml oxLDL刺激对脂肪细胞C/EBPα的含量无明显影响,但增加C/EBPβ蛋白量,且该作用呈时间依赖性；L-4F和H-89干预均降低C/EBPβ的蛋白质含量.结论 OxLDL时间依赖性地诱导脂肪细胞C/EBPβ的蛋白合成,并增强脂肪细胞MCP-1的表达分泌,L-4F以浓度依赖的方式对抗oxLDL的致炎作用,cAMP/PKA-C/EBPβ信号通道可能是L-4F的作用途径之一.
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蛋白激酶A在培养胎鼠皮层神经元缺氧凋亡中的作用
目的探讨培养神经元缺氧后蛋白激酶A(PKA)活性变化及其与神经元凋亡的关系.方法建立体外培养大鼠皮层神经元模型及培养神经元缺氧模型,用3种不同浓度的PKA抑制剂(Rp-cAMP)、在不同的缺氧时相点观察神经元下述指标的改变:神经元细胞膜和细胞质中PKA的活性、caspase-3(CPP32)和TUNEL表达 (细胞凋亡) 的规律.结果随着缺氧时间的延长,培养神经元细胞膜PKA的活性显著增加,同时caspase-3和TUNEL荧光染色阳性率及平均荧光强度均显著升高,而应用Rp-cAMP后细胞凋亡情况显著减轻.结论①PKA和caspase-3均参与了缺氧诱导的神经元凋亡;②PKA抑制剂Rp-cAMP可减轻缺氧诱导的神经元凋亡;且该作用是通过caspase-3信号转导途径实现的; ③PKA的激活在缺氧诱导的神经元凋亡中起促发作用.
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培养大鼠皮层神经元缺氧损伤与蛋白激酶活化关系的研究
目的检测神经元缺氧后膜性PKA(蛋白激酶A)和PKC(蛋白激酶C)活性变化,以及它们的特异性抑制剂对神经元凋亡率的影响.方法建立培养的神经元"缺血"模型,然后用不同浓度的特异性PKA抑制剂Rp-cAMP和特异性PKC抑制剂Calphostin C预孵育培养神经元再进行"缺血"实验,用放射酶分析法测定神经元缺氧后的膜性蛋白激酶活性,各组缺氧神经元的凋亡百分率由TUNEL荧光试剂盒测定.结果随着神经元缺氧时间的延长,神经元膜性PKA和PKC活性均增加;随着Calphostin C浓度的增加,细胞凋亡率显著增加;相反随着Rp-cAMP浓度的增加,细胞凋亡百分率显著减少.结论①PKA和PKC信号转导通路均参与了缺氧神经元损伤;②缺氧后培养神经元PKA和PKC对凋亡的调控功能相反,提示在培养的缺氧神经元中PKA和PKC信号转导属于单相控制系统,可能二者在细胞中的比例决定着缺氧神经元的存亡.
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CRH通过PKA途径调节大鼠下丘脑CRH表达的研究
目的探讨促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin-releasing hormone,CRH)刺激下丘脑神经元表达CRH的信号调控机制.方法通过大鼠下丘脑脑片实验模型,运用免疫组织化学、Western blot技术,观察CRH激活下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素Ⅰ型受体(corticotropin-releasing hormonetype 1 receptor,CRH1R)后蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)信号通路的活性变化,及其与CRH表达的关系.结果CRH可引起下丘脑脑片磷酸化PKA、磷酸化CREB及CRH含量明显增加,而CP-154526、H89可显著抑制磷酸化PKA、磷酸化CREB及CRH含量的增加.结论在严重创伤应激反应中,CRH通过PKA途径实现对下丘脑神经元CRH的表达的超短正反馈调节.
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CRH刺激大鼠下丘脑脑片CRH及CRH1R的表达研究
目的通过CRH刺激大鼠下丘脑脑片,探讨下丘脑CRH和CRH1R在下丘脑中的分布和表达规律.方法采用大鼠下丘脑脑片实验模型,运用免疫组织化学技术,观察CRH刺激大鼠下丘脑脑片后CRH和CRH1R在下丘脑中的分布和表达规律.结果CRH刺激下丘脑脑片后下丘脑CRH和CRHlR含量明显增多,而CP-154526、H89可显著抑制CRH和CRHlR的增加.结论CRH刺激下丘脑脑片后增多的CRH与CRHIR结合后进一步引起下丘脑神经元CRH和CRHIR表达增加.提示在严重创伤应激反应中,CRH通过PKA途径实现对下丘脑神经元CRH的表达的超短正反馈调节.
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附子对缓慢性心律失常大鼠cAMP-PKA信号转导通路的影响
目的:观察附子对缓慢性心律失常大鼠模型cAMP-PKA信号转导通路的影响.方法:用普萘洛尔制备缓慢性心律失常大鼠模型,观察附子对缓慢性心律失常大鼠心率、SOD、MDA、AST、LDH、CK、Na+-K+-ATP酶、cAMP及cAMP-PKA信号转导通路的影响.结果:附子水提10,5,2.5g生药/kg能升高大鼠心肌Na+-K+-ATP酶的活性和cAMP,PKA的含量,这可能是其治疗缓慢性心律失常的机制之一.结论:附子10g/kg具有明显的抗缓慢性心律失常的作用.
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黄芩苷对NLRP3炎症小体活化和细胞焦亡的抑制作用及其机制研究
目的 以LPS致敏的小鼠巨噬细胞(J774A.1或者腹腔巨噬细胞)作为细胞模型,探讨黄芩苷对ATP诱导的炎症小体活化和细胞焦亡的影响及其机制.方法 C57BL/6小鼠腹腔注射30 g·L-1巯基乙酸盐培养基诱导大量腹腔巨噬细胞产生;利用LPS致敏巨噬细胞,再以ATP激活NLRP3炎症小体;采用免疫印迹法检测细胞裂解物和培养上清液中IL-1β、caspase-1、HMGB1等蛋白的表达水平;以基于微球的免疫测定法(CBA)检测细胞培养上清液中IL-1β的水平;碘化丙锭(PI)染色法检测黄芩苷对LPS+ATP诱导的细胞焦亡的影响.结果 黄芩苷处理能剂量依赖性地抑制LPS+ATP刺激下巨噬细胞中caspase-1的活化,成熟IL-1β(Mτ17 000)和HMGB1的释放;同时,黄芩苷也能明显抑制LPS+ATP诱导的小鼠巨噬细胞发生焦亡.腺苷酸环化酶抑制剂MDL12330A和蛋白激酶A(PKA)抑制剂H89可以明显逆转黄芩苷对ATP诱导的细胞焦亡的抑制作用.结论 黄芩苷可能通过影响巨噬细胞中PKA的活性,进而抑制NLRP3炎症小体活化与细胞焦亡.
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重组人睾丸精子结合蛋白对蛋白激酶A活性的影响
为探讨人睾丸精子结合蛋白(TSBP)在精子获能及顶体反应中可能发挥的作用,检测了TSBP重组蛋白在体外转染细胞系中对蛋白激酶A活性的影响.构建真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)B/tsbp,稳定转染HEK293细胞后,蛋白免疫印迹检测到培养细胞中融合蛋白的表达.选择表达量高的细胞克隆,扩增并用金属亲和层析柱(IMAC)从细胞裂解液中纯化融合蛋白His6-TSBP.用放射自显影法检测HEK293细胞中蛋白激酶A(PKA)活性,发现重组质粒转染组PKA活性高于对照组,确定了TSBP对PKA活性的促进作用.
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高质量分数葡萄糖对内皮细胞迁移、增殖功能的影响
目的：探讨高糖状态对体外培养血管内皮细胞迁移、增殖能力的影响，以及其潜在可能的分子机理。方法：通过不同质量分数的葡萄糖干预血管内皮细胞后，用CCK－8评估内皮细胞增殖情况；用transwell实验检测内皮细胞的迁移能力；用Real －time PCR检测腺苷酸环化酶（adenylate cyclase，AC）mRNA的表达；用Western blotting 检测PKA、p－PKA蛋白的表达情况。结果：高质量分数葡萄糖干预血管内皮细胞后，血管内皮细胞迁移、增殖能力明显下降，同时AC mRNA表达明显下降，PKA蛋白表达无明显变化，而p－PKA蛋白表达明显下降。结论：高质量分数葡萄糖使血管内皮细胞迁移、增殖能力下降，cAMP－PKA信号通路的活化可能参与了血管内皮细胞增殖、迁移及修复功能。
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吡格列酮通过抑制PKA表达抑制AD大鼠脑片模型海马神经元HVA钙通道电流
目的 探讨PPARγ激动剂吡格列酮(pioglitazone,Pio)是否对Aβ致阿尔茨海默病(AD)大鼠脑片模型海马神经元高电压激活(high-voltage-activated,HVA)钙通道电流有抑制作用以及是否通过抑制蛋白激酶A(protein kinaseA,PKA)表达途径而实现.方法 采用Aβ25～35孵育大鼠脑片制备AD模型;采用全细胞膜片钳技术观察Pio干预后AD大鼠脑片模型海马神经元HVA钙通道在刺激电压下电流密度、Ⅰ～Ⅴ曲线、激活曲线及失活曲线的变化情况;采用免疫组织化学染色观察Pio干预后AD大鼠脑片模型PKA蛋白表达情况.结果 Aβ孵育可以导致大鼠脑片海马神经元HVA钙通道电流增加,激活曲线半激活电压减低,斜率因子增大;失活曲线半失活电压增大,斜率因子减小.Pio干预后AD大鼠脑片模型海马神经元HVA钙通道在各激活电压下电流密度降低;激活曲线半激活电压增加,斜率因子减小,HVA钙通道激活对电压的敏感性降低,不易被激活;失活曲线半失活电压减小,斜率因子增大,HVA钙通道失活对电压的敏感性增加,更易失活;同时海马神经元PKA蛋白表达水平下降.结论 Pio可能通过抑制PKA表达途径抑制AD大鼠脑片海马神经元HVA钙通道电流,从而减少细胞钙离子内流,降低细胞内钙离子水平,对抗Aβ的神经毒性.
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Kinase-Glo激酶发光法体外测定蛋白激酶A活性
目的:建立一种简便、无害的体外测定PKA激酶活性的非放射性核素方法.方法:采用RT-PCR方法从HEK293细胞的总RNA中扩增PKAα的cDNA,并将PKAα的cDNA克隆至pGEX-6p-1载体中.经纯化后的体外表达蛋白用免疫印迹(Western blot)法进行鉴定.后采用非放射性核素法Kinase-Glo激酶发光检测试剂盒测定表达蛋白GST-PKAα的活性.结果:经过优化诱导条件,我们成功地纯化得到了GST-PKAα的融合蛋白.用非放射性核素法Kinase-Glo激酶发光检测试剂盒测定纯化蛋白GST-PKAα活性.我们还用PKA特异性抑制剂H-89进一步确定了表达蛋白GST-PKAα的活性,并且测定了其IC50值为(35.2±3.97) nmol/L,与报道值一致.结论:Kinase-Glo激酶发光检测法测定PKA激酶活性,操作简便、对人体无害.此方法能有效应用于临床前PKA激酶抑制剂的高通量筛选、PKA激酶新作用靶点的发现以及靶向蛋白PKA磷酸化位点的研究.
