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人类神经丝蛋白基因hSTE的分子克隆
啤酒酵母是人类基因组计划的重要模式生物,它的全基因组测序已于两年前完成,其功能基因组研究亦已全面展开.到目前为止,在已知基因中约1/3功能已经清楚,余下2/3基因的功能有待进一步研究.在全基因组所有6 000多个基因中,约1/4的基因尚未被研究,其中一部分基因在功能上尚不能进行归类,称为"孤儿基因"(orphan genes).我们根据系统测序发现的新的开放阅读框基因STE编码的蛋白质序列,在Internet下进行Blast分析,搜寻到一个高分值的人EST,再根据获得的EST序列设计两条引物分别和人脑cDNA文库插入子两端的载体序列配对组成类似于5′-RACE和3′-RACE的扩增体系,获得5′端序列和3′端序列.完成测序后和人的EST库中相关EST进行比较分析,拼接出一个全长为3773bp的cDNA,其中长的开放阅读框在1～3078之间,编码的蛋白质含1026个氨基酸,并含有多个重复的KSP磷酸化位点.同源性检索发现它和人类神经丝蛋白H的同源性在90%以上.将克隆的该基因命名为hSTE并登录到Genbank,登记号为AF203032.利用模式生物对克隆的基因进行遗传互补测验的工作目前正在进行中.
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基因调控表达技术的建立及在多潜能造血干/祖细胞扩增调控中的应用
干细胞是一种原始多潜能的细胞,具有自我更新和定向分化的基本特征.为了克服干细胞数量少的不足,众多学者已经在积极探索干细胞的扩增方法.目前国内外采用不同细胞因子的组合方案来进行干细胞的扩增,但其扩增的结果存在很多问题,主要体现在:扩增的时间短,倍数低,扩增体系难于调控,扩增后的干细胞自我更新能力,可塑性及造血重建的功能均较扩增前下降.
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结核分枝杆菌rpoB基因的套式PCR扩增及其DNA测序
现代分子药理学研究发现,结核分枝杆菌(Mtb)的利福平耐药是由于其RNA聚合酶β亚单位基因(rpoB基因)突变所致.近年来,国内外学者通过"临床标本→Mtb培养鉴定→PCR→DNA测序(或sscp等分析)"的技术路线进行了临床病例研究[1、2、3].但该技术路线不适于大样本的分子流行病学研究,并因为费时,尚不能服务于临床.鉴于套式聚合酶链反应(nested Polymerase Chain Reaction, nPCR)的灵敏度和特异性明显优于传统PCR,因此我们建立了Mtb的rpoB基因nPCR扩增体系.通过"临床标本→Mtb nPCR→DNA测序"技术路线对临床病例直接进行Mtb感染诊断和Mtb利福平耐药检测.
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聚合酶链反应快速检测念珠菌属
病原真菌因具有特殊的细胞壁结构，故聚合酶链反应 (PCR)检测方法自建立以来一直需要经过反复的真菌破壁和 DNA抽提过程才能获取提纯的 DNA，以进行下一步的 PCR检测 [1－ 3]。近来有学者已使用基因释放剂、 CTAB及异硫氰酸胍等 [4－ 6]对真菌菌株或临床标本进行前期处理，然后进行 PCR检测，但这仍需要配制复杂的原生质体形成缓冲液、原生质体裂解缓冲液 [6]等，或者高额购买商品化的基因释放剂 [4,5]，这不仅需要较高的技术要求、较大的实验成本、经过一定训练的技术人员，还要历经较长的实验时间，严重限制了真菌病 PCR检测方法在临床的应用和普及。因此我们以念珠菌属作为突破口，对其破壁—破膜—释放 DNA系列程序的条件及相应的 PCR扩增体系作了反复研究，终获得了一种简便、快速的 PCR检测方法，现介绍如下。
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人脐带血基质细胞体外扩增体系建立的临床前研究
人脐血中存在基质细胞,但由于其数量少,扩增能力弱而限制了在临床上的使用.本课题通过研究不同细胞因子:成纤维细胞生长因子(BFGF)、干细胞生长因子(SCF)、白细胞介素-3(IL-3)、肿瘤坏死因子(TNF)及其组合对人脐血基质细胞集落形成作用的比较,筛选出能高效稳定扩增人脐血基质细胞的体外培养体系并观察扩增后基质细胞的生物学性状.
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转基因基质细胞对脐血CD34+细胞体外扩增及早期祖细胞的影响
自1989年Broxmeyer和Geuckman等证实脐血富含造血干/祖细胞,并有可能用于临床造血细胞移植以来,至今在世界范围内已开展了对脐血干/祖细胞及其造血重建、体外扩增的研究,有报道的脐血干/祖细胞移植已达500多例.尽管脐血具有价廉、易获得、富含干/祖细胞等优点,但由于其量的限制而使其应用受限.因此,建立一个理想的脐血干/祖细胞体外扩增体系以保证干细胞存在,同时有大量祖细胞扩增是脐血干/祖细胞移植和以脐血干/祖细胞为靶细胞而进行基因治疗的关键.
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快速诊断性病用复合聚合酶链式反应方法的建立
淋球菌(NG)、沙眼衣原体(CT)和解脲支原体(UU)已成为目前引起我国性传播性疾病和泌尿生殖道感染的主要病原体,由于这些病原体所致疾病的主要临床表现非常相似,而治疗措施又不尽相同,因此给临床泌尿生殖道感染的诊断和治疗带来了很大的困难. 聚合酶链式反应是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法,其灵敏度和特异性远远超过了传统方法对病原体的检测.本研究根据灵敏度和特异性强的特点,将三对不同引物于同一扩增体系中,并对扩增体系和扩增条件进行了系统优化,建立了一种能同时检测淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体的复合酶链式反应方法.
