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蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin对人鼻咽癌CNE-2细胞系E-钙粘素表达的影响
目的 探讨蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin对人鼻咽癌CNE-2细胞系中表皮钙粘素(E-CD)表达的影响,并试图阐明Agkihpin抑制人鼻咽癌CNE-2细胞的机制.方法 用不同浓度的Agkihpin处理鼻咽癌细胞株72 h后,应用免疫细胞化学、RT-PCR法检测E-CD在CNE-2细胞中的表达.结果 不同浓度Agkihpin作用CNE-2细胞72 h后E-CD表达均降低,并呈现出一定的浓度依赖效应,显示Agkihpin可显著下调CNE-2细胞中E-CD表达.各加药组与不加Agkihpin组比较,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 在人低分化鼻咽癌CNE-2细胞系中,Agkihpin能抑制E-CD的表达,并且随浓度的增大有明显的抑制作用.
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蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin抑制人肝癌SMMC-7721细胞株MRP1表达
目的:探讨蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin对人肝癌细胞株SMMC-7721中多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance associ-ated protein 1,MRP1)表达的影响,并阐明Agkihpin抑制人肝癌SMMC-7721细胞活力的机制.方法:采用不同浓度的Agkihpin处理SMMC-7721细胞72 h后,应用免疫细胞化学、Western blot和RT-PCR等方法检测MRP1在SMMC-7721细胞中的转录和表达.结果:不同浓度Agkihpin作用SMMC-7721细胞72 h后MRP1表达均降低,显示Agkihpin可显著下调SMMC-7721细胞中MRP1转录和表达(P<0.05),并呈现出一定的浓度依赖效应.结论:Agkihpin能抑制人低分化肝癌细胞株SMMC-7721中MRP1的表达,并呈一定程度的浓度依赖效应,提示Agkihpin在一定程度上可用于提高肝癌细胞对化疗药物的敏感性.
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蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin对人鼻咽癌CNE-2细胞系环氧合酶-2表达的影响研究
目的 探讨蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin对人鼻咽癌CNE-2细胞系环氧合酶-2 (COX-2)表达的影响.方法 用不同浓度的Agkihpin处理鼻咽癌CNE-2细胞系72 h后,应用免疫细胞化学、Western Blotting、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测COX-2在CNE-2细胞系中的表达.结果 不同浓度Agkihpin处理CNE-2细胞系72 h后,COX-2的平均吸光密度比较,差异有统计学意义(P＜0.05);其中A1组、B1组和C1组较D1组均明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05),A1组较B1组、C1组和D1组均明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05).Western Blotting检测经不同浓度Agkihpin处理72 h后COX-2表达差异有统计学意义(P＜0.05),随着Agkihpin浓度的降低,COX-2表达水平升高,各组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05).不同浓度Agkihpin处理72 h后COX-2 mRNA的相对转录水平比较差异有统计学意义(P＜0.05),随着Agkihpin浓度的降低,COX-2 mRNA的相对转录水平升高,各组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 在人低分化鼻咽癌CNE-2细胞系中,Agkihpin能抑制COX-2的表达,并且随着浓度的增大更明显;Agkihpin对COX-2的抑制作用,可能成为鼻咽癌化疗的有效药物.
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蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin上调人肝癌细胞株SMMC-7721中表皮钙黏素的表达研究
目的 探讨蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin对人肝癌SMMC-7721细胞株中表皮钙黏素(E-CD)表达的影响及Agkihpin抑制人肝癌SMMC-7721细胞的机制.方法 采用不同浓度的Agkihpin处理肝癌细胞株72 h后,应用免疫细胞化学、Western Blotting和逆转录PCR(RT-PCR)法检测E-CD在SMMC-7721细胞中的表达.结果 不同浓度Agkihpin作用SMMC-7721细胞72 h后E-CD表达均上升,差异有统计学意义(P＜0.05),并呈现出一定的剂量依赖效应.Agkihpin可显著上调SMMC-7721细胞中E-CD表达.结论 在人低分化肝癌SMMC-7721细胞株中,Agkihpin能促进E-CD的表达,因而可能抑制肝癌细胞的迁移和降低肝癌组织的恶性程度.
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精氨酸酯酶的分离与纯化
目的 寻找精氨酸酯酶提纯的佳工艺.方法 应用不同方法 进行提取,比较其收率.结果 佳工艺为二乙氨基乙基葡聚糖A-50和盐浓度梯度洗脱.结论 应用该工艺提取不仅含量、收率高,而且省时、省力.
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蕲蛇酶与降纤酶的生物活性比较
目的比较蕲蛇酶和降纤酶在试管内的酶活力及在兔体血液凝固系统的生物活性.方法分别体外测定蕲蛇酶和降纤酶的相对分子质量(Mr)、蛋白质含量、精氨酸酯酶活力和凝血酶活力等.分别给家兔静脉注射蕲蛇酶0.75 U/kg和降纤酶5 U/kg,连续3d,比较给药前后纤维蛋白原含量、凝血酶时间、凝血酶原时间、部分凝血酶活酶时间、血小板数目、血小板聚集率、血栓长度及血栓重量的变化.结果蕲蛇酶Mr比较小(27 000),且由2个Mr为15 500的亚基构成,降纤酶Mr较大(40 900),为单链蛋白质.0.75 U蕲蛇酶和0.21 U凝血酶相当;5 U降纤酶约相当于1.4U凝血酶. 蕲蛇酶的精氨酸酯酶活力为(973±14) μmolTAME/(mg·min),降纤酶的精氨酸酯酶活力为(1 140±18) μmolTAME/(mg·min).家兔实验,两者均能减少血栓形成及降低纤维蛋白原含量,但蕲蛇酶的药效比降纤酶强,其余指标无明显差异.结论蕲蛇酶与降纤酶不同,蕲蛇酶在生物体内(家兔)表现的药效比降纤酶强.
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白眉蝮蛇毒精氨酸酯酶Ames试验
目的研究白眉蝮蛇(Agkistrodon halys ussuriensis)毒中精氨酸酯酶的致突变作用.方法用鼠伤寒沙门细菌营养缺陷型突变株TA97 ,TA98,TA100和 TA102,采用平皿掺入法进行Ames试验,将实验分为加和不加代谢激活系统S9 2组平行试验.精氨酸酯酶设6个浓度:10.0×10-3, 5.0×10-3, 2.5×10-3, 1.25×10-3, 0.625×10-3和0.312×10-3 U/mL.结果加和不加代谢激活系统S9两种条件下,精氨酸酯酶不诱发鼠伤寒沙门细菌营养缺陷型突株的回复突变.Ames试验结果为阴性.结论从致突变角度考虑,精氨酸酯酶在高于"蝮蛇清栓酶"(主要成分为精氨酸酯酶)临床治疗剂量约1000倍的条件下仍然较安全.
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蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin对人鼻咽癌CNE-2细胞系MRP1表达的影响
目的 探讨蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin对人鼻咽癌CNE-2细胞系中多药耐药相关蛋白MRP1表达的影响,并试图阐明Agkihpin抑制CNE-2细胞的机制.方法 用不同浓度的Agkihpin处理细胞72 h后,应用免疫细胞化学、Western blot、RT-PCR法检测MRP1在CNE-2细胞中的表达.结果 不同浓度Agkihpin作用CNE-2细胞72 h后MRP1表达均降低,并呈现出一定的浓度依赖效应,显示Agkihpin可显著下调CNE-2细胞中MRP1表达.各加药组与不加Agkihpin组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 在人低分化鼻咽癌CNE-2细胞系中,Agkihpin能抑制MRP1的表达,并且随浓度的增大抑制作用增加,这可能是Agkihpin能降低鼻咽癌细胞活力的原因之一;Agkihpin抑制MRP1的表达提示在一定程度上可提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感度.
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蝮蛇抗栓酶的新用途
蝮蛇抗栓酶(Ahylysantinfarctase, Ahyl)是从蝮蛇蛇毒中提取分离纯化的以精氨酸酯酶为主要成分的一种酶制剂.具有抗凝、溶栓、扩张血管、改善微循环、抗衰老作用.临床上主要用于治疗脑、心及周围血管疾病.近年来随着对本品的临床应用及药理学的深入研究,除上述功能外,还发现新的用途,现综述如下.
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蛇毒纤溶酶的性质及应用研究
蛇毒中含有许多不同生物活性的酶类,包括金属蛋白酶、凝血酶、丝氨酸蛋白酶、磷脂酶、磷酸二酯酶、透明质酸酶、精氨酸酯酶等.其中,在蝰亚科、蝮亚科和眼镜蛇科等蛇毒中存在着一类能直接溶解纤维蛋白(原)的酶,称为纤维蛋白(原)溶酶(简称纤溶酶,Fibrinolytic enzyme,FLE)[1].纤维蛋白原是由Aα、Bβ、γ三对肽链组成.纤维蛋白则是A、 B两对肽链从Aα、Bβ两对肽链上水解下来后,剩下的(αβγ)2通过氢键聚合形成的不溶性纤维蛋白多聚体.纤溶酶对两者都有水解作用.自1976年Ouyang和Huang首次从尖吻蝮蛇毒中获得纯化的纤溶酶以来,迄今已从不同科属的至少15种蛇毒中获得了25种以上的纯化纤溶酶,并对其分子结构、酶学特性及出血活性的关系进行了深入的研究[2,3].纤溶酶是一种具有溶栓、抗栓等作用的药物,已成为蛇毒蛋白领域的一个研究热点.
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蛇毒精氨酸酯酶的研究与应用
精氨酸酯酶(Arginine Esterase)是蛇毒中的一类蛋白水解酶,因能专一性地水解精氨酸酯类化合物而得名.精氨酸酯酶广泛地存在于蝮亚科及蝰科蛇毒中.这类酶多数对凝血系统有重要作用,其抗凝血作用类似于哺乳动物凝血酶,与哺乳动物凝血酶不同之处是此酶在体内不能激活血浆中的Ⅷ因子,不能形成稳定的纤维蛋白凝块,仅能形成松散的纤维蛋白凝胶,易被纤溶酶分解掉,从而使血小板解聚,降低血黏度.由于多种精氨酸酯酶在体内具有明显的去纤、溶栓作用,从加世纪60年代开始,国内外已有多种蛇毒中的精氨酸酯酶用于临床的抗凝和溶栓.
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蝮蛇抗栓酶的临床新应用
蝮蛇抗栓酶是从蝮蛇毒中分离的以精氨酸酯酶为主要成分的一种酶制剂.由于它能明显降低血液粘度、血浆纤维蛋白原、血脂,并能减少血小板数量,故对脑血栓形成等疾病有较好的疗效[1].近来又发现了许多临床新用途,报道如下.
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降纤酶与精制蝮蛇抗栓酶治疗脑梗塞的疗效对比研究
降纤酶是由蝮蛇毒经现代生物工程提纯,精制而成的丝氨酸蛋白酶单成分制剂,它具有降低血纤维蛋白原浓度;促使组织型纤维蛋白溶酶原激活剂(t-pA)由内皮细胞释放并增强其活性;降低t-pA抑制因子的活性;增强活性纤维蛋白溶酶;抑制红细胞的凝集力,改善微循环等诸多作用.而精制蝮蛇抗栓酶(精氨酸酯酶)也具有降低血浆纤维蛋白原;降低血液粘度和血小板聚集等作用.两者均可用于治疗缺血性心脑血管疾病.
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白眉蝮蛇毒精氨酸酯酶的长期毒性实验
研究白眉蝮蛇(Agkistrodon halys ussuriensis)毒中精氨酸酯酶的长期毒性,为临床应用提供依据.用Beagle犬进行长期毒性实验,将犬分成4组,每组4只,对照组(生理盐水)、精氨酸酯酶低剂量组(0.06 u/kg)、中剂量组(0.18 u/kg)和高剂量组(0.36 u/kg).静脉给药每天1次,每周6 d,连续给药180 d后每组处死3只,留1只停药饲养15 d.观察用药期间毒性反应及停药15 d期间恢复情况.通过对活动能力、生长率、进食量、死亡率等一般综合指标;血检、尿检等临床指标;病理解剖和脏器系数变化几方面对毒性反应进行分析评价.一般综合指标,药物处理组和对照组没有明显差别;临床指标,高剂量药物处理组肝功能与对照组相比有明显差异,其它生化指标无显著差异(P>0.05);病理解剖指标高剂量药物处理组肝脏明显肿大、空泡化,脏器系数也明显高于对照组(P<0.05),但停药后肝脏恢复正常,其它脏器未见病变,脏器系数无显著差异(P>0.05).纯精氨酸酯酶对犬的无毒反应剂量大约为0.18 u/kg.从长期毒性方面考虑,纯精氨酸酯酶比现在临床应用的"蝮蛇清栓酶"(主要成分为精氨酸酯酶)毒性低,在高于临床治疗剂量约15倍的条件下长期用药仍然安全.
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白眉蝮蛇蛇毒精氨酸酯酶的致突变研究
目的与方法:采用Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验及小鼠精子畸形试验研究白眉蝮蛇(Agkistrodonhalysussurien-sis)蛇毒中精氨酸酯酶有无致突变毒性,为临床应用提供安全性依据.结果与结论:3项试验均为阴性,精氨酸酯酶对所试菌株、小鼠体细胞及雄性生殖细胞均无诱变性.从致突变角度考虑,精氨酸酯酶在高于临床治疗剂量约100倍的条件下仍然安全.
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白眉蝮蛇蛇毒精氨酸酯酶致畸实验
目的: 研究白眉蝮蛇(Agkistrodon halys ussuriensis)蛇毒精氨酸酯酶对大鼠的致畸胎作用,为临床应用提供依据. 方法: 用大鼠进行致畸胎试验,将动物分成5组:阴性对照组(生理盐水)、精氨酸酯酶低剂量组(0.06 U / kg)、中剂量组(0.18 U / kg)、高剂量组(0.36 U / kg)和阳性对照组(Vit AD 滴液10 mg / kg).精氨酸酯酶于受精第6 d连续静脉给药至15 d, 第20 d(分娩前1 d)断头处死动物并剖腹.通过3项指标确定精氨酸酯酶的致畸胎作用:一般综合指标,包括实验期间动物的体重、进食量、精神状态和活动情况;妊娠指标,包括剖腹检查记录的着床总数、死胎数、活胎数、吸收胎仔数、胚胎体重、身长、尾长和性别比;致畸指标,包括对外形、器官和骨骼畸胎率的测定. 结果: 母鼠胚胎毒性症状出现在高剂量组(0.36 U / kg),与对照组相比表现为妊娠期间平均体重增长减慢和胎仔的体重减轻(P<0.05),但外形、内脏和骨骼畸形率与对照组相比未见明显差异(P>0.05).其它药物处理组与对照组相比没有明显差别(P>0.05). 结论: 纯精氨酸酯酶0.18 U / kg以下对孕鼠无胚胎毒性和致畸作用,高于0.18 U / kg则有一定的胚胎毒性.临床应用的剂量(0.012 U / kg)是安全的.
