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慢性烟曲霉暴露对哮喘大鼠气道上皮细胞损伤及表皮生长因子受体表达的影响
目的 探讨慢性烟曲霉暴露对哮喘大鼠气道上皮细胞损伤及表皮生长因子受体(EGFR)表达的影响.方法 56只雄性Wistar大鼠随机分为7组(每组8只):慢性哮喘组(A组),慢性哮喘+烟曲霉孢子吸入1周(B组)、3周(C组)和5周(D组)组,慢性哮喘+生理盐水吸入组(E组),卵白蛋白(OVA)致敏生理盐水激发组(F组),OVA致敏生理盐水激发+烟曲霉孢子吸入组(G组).测定大鼠基础气道阻力和气道阻力变化率,ELISA法测定BALF中表皮生长因子(EGF)及转化生长因子α(TGF-α)浓度,肺组织切片HE染色观察气道上皮细胞损伤脱落程度,过碘酸雪夫染色(PAS)观察气道上皮杯状细胞增生程度,免疫组化染色测定气道上皮细胞EGFR表达强度,免疫印迹测定肺组织EGFR蛋白表达.结果 B、C、D组大鼠BALF中EGF[(51.72±8.54)、(68.12±7.85)、(86.24±9.12)pg/mL]、TGF-α[(55.26±9.30)、(75.58±11.56)、(96.75±14.66)pg/mL]、脱落上皮/气道上皮[(11.25±3.12)%、(26.45±5.56)%、(28.50±7.50)%]、杯状细胞/上皮细胞面积比值[(16.42±5.24)%、(22.64±6.82)%、(36.38±9.21)%]、气道上皮细胞EGFR阳性信号累积光密度(IOD)值(82±15、120±19、165±21)、肺组织EGFR蛋白表达IOD值(0.91±0.26、1.61±0.52、2.52±0.78)均高于A、E、F及G组(P<0.05或<0.01).C和D组大鼠气道阻力变化率[(61.91±5.26)%、(84.69±6.38)%]均高于A、E、F及G组(P值分别<0.05或<0.01).气道上皮细胞EGFR表达IOD值与脱落上皮/气道上皮(%)及杯状细胞/上皮细胞面积比值(%)呈正相关(r=0.692,P<0.01;r=0.657,P<0.01).结论 慢性烟曲霉暴露加重哮喘大鼠气道上皮细胞损伤,上调哮喘大鼠气道上皮细胞EGFR表达,促进杯状细胞增生,加重气道高反应性.
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反复吸入烟曲霉孢子对慢性阻塞性肺疾病大鼠气道炎症和重构的影响
目的 观察反复吸入烟曲霉(AF)孢子对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠气道炎症和重构的影响.方法 50只Wistar大鼠随机分为A、B、C、D及E组,每组10只.A、B、C和D组用气管内吸入脂多糖联合熏香烟的方法建立COPD模型,E组为正常对照组.建模后A、B和C组分别经鼻吸入高浓度AF孢子(1×106cfu/次)、低浓度AF孢子(1×103cfu/次)和生理盐水100 μL,每周2次,连续5周;D组无处理.测定支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数及分类,白细胞介素8(IL-8)和转化生长因子β(TGF-β)的水平;肺组织病理切片HE、PAS和Masson染色,观察气道炎症并行半定量评分及病理图像的形态学测量分析.结果 与E组比较,D组大鼠出现典型COPD病理改变,模型建立成功.A组和B组BALF中白细胞总数、中性粒细胞及淋巴细胞百分比均高于C组和D组(P均＜0.01);A组和B组BALF中的IL-8和TGF-β浓度均高于C组和D组(P均＜0.01);A组的气道炎症评分高于B、C和D组(P均＜0.01);A组和B组的管壁总厚度(WAt/Pbm)、平滑肌层厚度(WAm/Pbm)、管壁胶原沉积厚度(WCt/Pbm)、管壁外层胶原沉积厚度(WCo/Pbm)及杯状细胞占上皮细胞比例均高于C组和D组(P均＜0.01);A组和B组BALF中IL-8与中性粒细胞百分比、气道炎症评分及杯状细胞占上皮细胞百分比呈正相关(r=0.856,P＜0.01;r＝0.884,P＜0.01;r=0.702,P＜0.05);TGF-β与WAt/Pbm、WCt/Pbm、WCo/Pbm及杯状细胞占上皮细胞百分比呈正相关(r=0.706,P＜0.05;r=0.802,P＜0.01;r=0.876,P＜0.01;r=0.713,P＜0.05).结论 反复吸入AF孢子可加重COPD大鼠气道炎症,并促进气道重构.
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侵袭性肺曲霉病的诊断与治疗
曲霉菌在自然界中分布广泛,已知自然界至少有600多种,其中约20种曲霉菌能感染人类和动物,而常见的有8种,包括烟曲霉(A.fumigatus)、黄曲霉(A.flavus)、构巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉(A.niger)、土曲霉(A.terreus)等,主要通过吸入曲菌孢子引起侵袭性曲霉病.
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烟曲霉引起肺部感染1例
近年来随着皮质激素、免疫抑制荆、各种广谱抗生素等在临床的大量应用以及临床各种侵入性检查和治疗技术的不断开展,使烟曲霉感染呈上升趋势.2006年8月,我们从1例支气管哮喘患者痰液中两次分离出烟曲霉,现报道如下.
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真菌耐药性研究现状及新型抗真菌药物研究进展
抗真菌耐药性给临床治疗侵袭性真菌感染造成极大的困难,现有抗真菌药物由于存在药物-药物间的相互作用以及严重的毒副作用而受到极大的限制.非白色念珠菌属对氟康唑耐药问题受到人们的广泛关注,光滑念珠菌对唑类的耐药率逐年上升,烟曲霉对唑类耐药性主要是由于唑类药物在临床上或环境中的广泛暴露导致烟曲霉对其敏感性降低,这些耐药性病原微生物都是导致侵袭性真菌感染的主要病原菌.另外,曲霉属及其它霉菌对临床上大部分抗真菌药物表现出降低的敏感性和广泛的耐受性.近年来由于广谱抗生素及免疫抑制剂的过度使用,深部真菌感染的发生率呈现逐年上升趋势,而现有抗真菌药物对全身性真菌病或血液感染型真菌病的治疗效果却无法令人满意,病人一旦患上全身性真菌病,其病死率较高.如何有效治疗深部真菌感染已成为临床迫切需要解决的问题.目前,大量新药处于临床前期研究阶段,这些新型化合物的靶标除了已知的麦角甾醇和β-葡聚糖合成酶,还有一些新的作用机制能够克服现有药物的耐药性和毒性.本文综述了现有真菌药物的耐药性以及正在研发过程中的新型抗真菌药物.
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免疫抑制小鼠侵袭性肺曲霉病动物模型的建立
目的 建立免疫抑制小鼠侵袭性肺曲霉病动物模型用于相关基础与临床研究.方法 ICR小鼠腹腔注射不同剂量环磷酰胺和皮下注射一定剂量地塞米松磷酸钠,建立免疫抑制状态;予小鼠两鼻孔接种烟曲霉AF293,观察96h存活率和不同时间点肺组织的病理变化.结果 两次环磷酰胺(150+150)mg/kg和一次地塞米松磷酸钠50mg/kg剂量注射组,中性粒细胞数降低达到预期水平,连续4d低于100/μl:烟曲霉分生孢子悬液10倍稀释后浓度约1×108/ml接种小鼠,96h后小鼠存活率为83.3%;肺组织病理观察在72h时曲霉孢子聚积并生成菌丝,肺组织有肉芽肿形成;96h时孢子大量繁殖,肺组织出血坏死,偶见肺脓肿形成.结论 通过免疫抑制剂成功建立了免疫抑制小鼠,并且通过鼻腔感染曲霉菌获得稳定的肺曲霉病小鼠模型.
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根癌农杆菌介导的烟曲霉转化条件的优化
目的 探讨根癌农杆菌介导烟曲霉的遗传转化及其影响因素.方法 构建根癌农杆菌二元载体PDHt/SK,二元栽体转化根癌农杆菌,分别对共培养温度(23、24、25、26、27、28)℃、媒介(尼龙膜、硝化纤维膜、液相静置培养)、共培养时间(12、24、36、48 h)、预培养加乙酰丁香酮与否、加入乙酰丁香嗣的浓度(100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml);分生孢子与根癌农杆茵的不同比例(1:1、1 : 10、1:100、1:1000)进行根癌农杆菌介导烟曲霉的转化,观察上述条件下的根癌农杆菌介导的烟曲霉转化效率,用潮霉素抗性基因筛选转化子.结果 共培养温度、转化媒介、共培养时间、共培养加入乙酰丁香酮不同的浓度、分生孢子与根癌农杆茵的不同比例均对根癌农杆菌介导烟曲霉转化效率产生影响,但是预培养加乙酰丁香酮与否对根癌农杆菌转化烟曲霉的效率影响不明显.结论 根癌农杆菌可成功介导烟曲霉的遗传转化,其转化过程受诸多因素的影响.
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烟曲霉及其渗出物影响肺泡巨噬细胞功能的实验研究
目的:以体外培养的Wistar大白鼠肺泡巨噬细胞(PAM)为靶细胞,研究烟曲霉及渗出物对其功能的影响.方法:制备烟曲霉孢子悬液和烟曲霉渗出物,用不同浓度的烟曲霉孢子混悬液及烟曲霉孢子混悬液与烟曲霉渗出物的混合液分别刺激PAM,测定培养液中PAM存活率、吞噬率、吞噬指数以及肿瘤坏死因子α(TNF-α)的活性,观察烟曲霉孢子混悬液和混合液对肺泡巨噬细胞功能的影响.结果:烟曲霉孢子能引起肺泡巨噬细胞存活率和吞噬率降低,且有一定剂量-效应关系和时间-效应关系(P＜0.01),TNF-α活性随烟曲霉孢子刺激剂量增高而上升(P＜0.01).单纯烟曲霉组与混合组检测结果存在显著性差异(P＜0.05).结论: 烟曲霉孢子促进PAM释放TNF-α的同时,还对PAM有一定细胞毒性,损害其吞噬功能,烟曲霉渗出物对PAM存在一定细胞毒性作用,同时部分减少TNF-α释放,在烟曲霉感染发展中可能起着重要的促进作用.
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烟曲霉感染时NADPH氧化酶通过诱导活性氧活化巨噬细胞自噬
目的 研究NADPH氧化酶(NOX)参与烟曲霉孢子诱导巨噬细胞自噬及其作用机制.方法 取对数生长期的RAW264.7细胞,随机分为3组:以烟曲霉孢子刺激的处理组、烟曲霉孢子联合NOX抑制剂氯化二亚苯基碘鎓(DPI)的处理组和无处理的空白组.细胞作用2h后荧光显微镜观察细胞内二氯荧光黄亮度以检测活性氧(ROS)水平,免疫印迹法检测微管相关蛋白轻链3(LC3)的表达量,免疫荧光技术观察LC3的表达与定位.结果 烟曲霉孢子刺激后RAW264.7细胞的ROS与LC3BⅡ表达水平显著升高,同时LC3呈斑点状聚集并与烟曲霉孢子共定位;以DPI抑制后ROS与LC3 BⅡ表达量与空白组相比无明显变化,并且LC3在细胞内弥散分布.结论 烟曲霉感染时NOX通过产生ROS活化巨噬细胞自噬.
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一种快捷、定量检测烟曲霉GM抗原双mAb夹心ELISA的方法
目的: 建立一种快速诊断烟曲霉病的双mAb夹心ELISA法.方法: 应用4株抗烟曲霉GM单克隆抗体(mAb), 分别包被和制备HRP-mAb, 用双mAb夹心ELISA法配对试验, 选择捕获及检测mAb.结果: 经筛选得到捕获及检测mAb的佳组合,并建立了双mAb夹心ELISA法. 该法检测GM抗原的灵敏度为0.1 μg/L, 测出范围在0.1～10 μg/L之间. 连续6 d用ELISA法检测同一份样品, 所获CV的平均值为(7.2±3.8)%.结论: 建立了一种可快速、定量检测烟曲霉GM抗原的双mAb夹心ELISA法, 灵敏度高、重复性好, 对研制试剂盒应用于烟曲霉病早期诊断和防治, 具有重要的临床应用价值.
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烟曲霉深部感染家兔模型的建立
目的 建立烟曲霉播散性感染家兔模型,为进一步研究烟曲霉深部感染的致病机制及诊疗措施提供可用的动物模型.方法 免疫抑制新西兰大白兔致其免疫功能低下,经耳缘静脉注射烟曲霉分生孢子致感染.通过观察各组家兔的生命体征及尸检、脏器培养、组织病理结果等鉴定感染结局.结果 实验组各家兔具有感染症状(体重渐减,体温≥39.5℃),解剖发现明显的组织病理学改变,脏器培养鉴定为烟曲霉,组化染色查到菌丝.结论 成功的建立了烟曲霉深部感染家兔模型,为烟曲霉感染过程中致病机制的研究及研制新型诊疗措施提供了依据.
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抗烟曲霉果胶裂解酶 A 抗体检测对侵袭性曲霉病诊断价值的评估
目的：建立检测抗烟曲霉果胶酶 A（pectate lyase A，PlyA）抗体的 ELISA 方法，评估其对侵袭性曲霉病（invasive aspergillosis，IA）的诊断价值。方法用重组 PlyA 作为包被抗原，建立检测人抗 PlyA IgG 抗体的间接 ELISA 方法。检测97例 IA 患者、80例非 IA 患者和200例体检健康者血清。将所得结果与抗烟曲霉硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reduc-tase，TR）抗体和抗烟曲霉二肽基肽酶 V（dipeptidyl peptidase V fragment，DPPV）抗体结果比较。结果抗 PlyA IgG 抗体ELISA 方法的批内变异系数为5.3％，批间变异系数为10.9％。诊断 IA 的敏感度为62.9％，特异度为90.4％。非中性粒细胞缺乏 IA 患者和中性粒细胞缺乏组患者阳性率分别为72.3％和43.8％（χ2＝7.493，P ＜0.05）。抗 PlyA，抗 TR，抗DPPV 抗体检测的阳性率分别为62.9％，60.8％和66.0％，三者差异无统计学意义（χ2＝0.562，P ＞0.05）；三种方法联合检测的阳性率可达到92.8％。结论成功建立了检测抗 PlyA IgG 的 ELISA 方法；抗体检测对非粒细胞减少 IA 患者的诊断价值均优于粒细胞减少 IA 患者；联合三种抗体检测可提高诊断敏感度。
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肺泡巨噬细胞体外抗烟曲霉孢子及其代谢产物的电镜观察
目的 通过透射电镜观察烟曲霉孢子及代谢产物对肺泡巨噬细胞(PAM)吞噬功能形态学的影响.方法 以体外培养的Wistar大白鼠PAM为靶细胞,制备烟曲霉孢子悬液和烟曲霉渗析物,用烟曲霉孢子混悬液刺激PAM后,加入烟曲霉蛋白或烟曲霉渗析物,观察PAM在吞噬烟曲霉孢子过程中的形态学变化,并与枝霉毒素,烟曲霉素和烟曲霉酸相对照.结果 PAM可吞噬烟曲霉孢子,并发生明显的形态学改变.烟曲霉渗析物可抑制PAM对烟曲霉孢子的吞噬,枝霉毒素可诱导PAM发生凋亡.烟曲霉素和烟曲霉酸对PAM吞噬烟曲霉孢子的活动无明显影响作用.结论 枝霉毒素和烟曲霉渗析物对PAM有一定的细胞毒性,烟曲霉渗析物能够抑制PAM的吞噬功能,枝霉毒素可诱导其发生凋亡.
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烟曲霉刺激下TLR4对大鼠肺泡巨噬细胞释放TNF-α和IL-1β作用
目的 观察在烟曲霉孢子刺激下Toll样受体4 (TLR4)介导大鼠肺泡巨噬细胞(PAM)释放肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素1β(IL-1β)的水平并分析其意义.方法 应用体外培养的Wistar大鼠PAM,设置抗TLR4抗体组(阴性对照组)、单纯烟曲霉孢子组(阳性对照组)、烟曲霉和抗TLR4抗体混合组(实验组),于刺激0.5h,1h和2h后分别用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组上清中TNF-α和IL-1β的水平.结果 0.5h,1h和2h后,实验组抗TLR4单抗浓度为20μg/mL的A3组的TNF-α和IL-1β分别为(120±12.4) PG/ML, (160±13.2) PG/ML, (240±16.6) PG/ML和(18±2.3) PG/ML, (58±4.2) PG/ML,(92±9.4) PG/ML,显著低于阳性对照组(P<0.05),高于阴性对照组(P<0.05),且呈剂量依赖性.结论 TLR4在烟曲霉孢子诱导大鼠PAM释放TNF-α和IL-1β中发挥着重要作用,监测TNF-α、 IL-1β水平的动态变化有利于曲霉病的早期发现和防治.
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烟曲霉Af293 chsD基因缺失突变株的构建
目的 构建Af293 chsD缺失突变株,并对chsD的功能进行初步的研究.方法 PCR扩增chsD两侧部分序列并连接至pPK2质粒的潮霉素表达盒两端,从而构建重组质粒pPK2/chsD-(L+R).酶切pPK2/chsD-(L+R)并胶回收含chsD左侧、hph表达盒及chsD右侧的片段,连接至pDHt/SK而构建二元质粒pDHt/chsD∷hph.经ATMT方法将pDHt/chsD∷hph转化至Af293,经潮霉素抗性筛选从而获得烟曲霉△chsD突变株,并测量Af293,△chsD突变株生长直径及扫描电镜下观察分生孢子形态.结果 经PCR初步鉴定,筛选出的突变株中,其染色体中的chsD序列已被hph置换,初步形态研究表明,△chsD突变株的生长速度显著低于Af293野生型,且分生孢子凹陷呈干瘪状.结论 成功获得Af293△chsD突变株.chsD基因功能初步研究表明,chsD可能与烟曲霉的生长相关.
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烟曲霉感染中Toll样受体作用机制研究进展
Toll样受体(TLR)是参与天然免疫的主要模式识别受体之一,许多微生物病原体及其产物的病原相关分子模式(PAMP)与之结合后通过MyD88依赖性或非依赖性途径启动宿主胞内信号传导途径,引发一系列生物学效应.TLR能识别曲霉成分,烟曲霉通过不同TLRs逃避宿主天然免疫系统的识别.
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含额外拷贝ERG3B基因烟曲霉的表型分析
目的 克隆烟曲霉ERG3B基因,并构建烟曲霉ERG3B基因额外拷贝株,了解该基因对烟曲霉表型的影响.方法 通过同源性比对,在烟曲霉基因组找出烟由霉可能的ERG3基因的开放读码框(ORF),PCR扩增ERG3B基因ORF连同其上下游各约1 kb的DNA片段,将该片段重组到穿梭质粒pRG-AMA1-Not1.用重组后的质粒转化嘧啶营养缺陷株烟曲霉AF293.1.观察转化子的生长速度并测定转化子对抗真菌药物敏感性.结果 ①烟曲霉ERG3基因有3个拷贝(ERG3A,ERG3B,ERG3C).Erg3Ap和Erg3Bp与其他真菌的Erg3同源性高.②烟曲霉ERG3B基因被重组到了pRG-AMA1-Not1,产生质粒pERG3B.用pERG3B和空载体pRG-AMA1-Not Ⅰ转化AF293.1后,分别得到转化子AF-pERG3B和AF-empty.AF-pERG3B与AF-empty的生长速度无差异;两者对伊曲康唑、伏立康唑、特比萘芬、两性霉素B、卡泊芬净、灰黄霉素的敏感性也无差异.结论 额外拷贝的ERG3B基因不影响烟曲霉的生长速度及对伊曲康唑、伏立康唑、特比萘芬、两性霉素B、卡泊芬净、灰黄霉素的敏感性.
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变应性支气管肺曲菌病
变应性支气管肺曲菌病(allergic bronchopulmonary aspergilosis, ABPA)系肺泡、肺间质和支气管对曲霉抗原(主要是烟曲霉)产生的变态反应性炎症.该病常在患有慢性哮喘或肺囊性纤维化患者的基础上发生.英国在1952年首次报道ABPA.约7%～14%激素依赖性哮喘患者及2%～15%肺囊性纤维化患者发生ABPA.其发生机制主要与曲菌特异性IgE介导的II型变态反应及特异性IgG介导的III型变态反应有关.主要临床特征为哮喘、支气管炎或肺炎、发热、外周血嗜酸性粒细胞增加、痰液嗜酸性粒细胞增加、一过性肺浸润和金棕色胶胨样脓痰栓,慢性患者可出现中心性支气管扩张的症状.
