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小鼠侵袭性肺曲霉病模型的建立
目的 建立侵袭性肺曲霉病(IPA)动物模型.方法 以环磷酰胺为免疫抑制剂,造成小鼠免疫抑制,对腹腔巨噬细胞和脾细胞进行计数;双侧鼻孔吸入烟曲霉菌孢子,不同时间点处死小鼠,进行组织培养及病理分析.结果 注射环磷酰胺后,小鼠免疫细胞数量急剧下降,腹腔巨噬细胞数及脾细胞数减少,外周血淋巴细胞百分比降低;对IPA模型组的组织培养可见烟曲霉,病理切片可见肺组织大量烟曲霉菌聚积,组织坏死,形成肺脓肿.结论 成功建立了小鼠IPA动物模型.
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人转录因子 PU ．1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定
目的： PU．1是调控肺泡巨噬细胞天然免疫功能的重要转录因子之一。文中旨在构建并鉴定表达人转录因子PU．1基因的重组腺病毒载体。方法将PU．1基因SPI1和真核表达载体pIRES-EGFP进行双酶切、连接酶连接，PCR扩增目的片段SPI1-IRES-EGFP，与中间质粒pDONR221和腺病毒骨架质粒pAd／CMV／V5-DEST进行重组，线性化后转染人胚肾293（HEK293）细胞，获得重组腺病毒pAD-SPI1-IRES-EGFP，经过大量扩增后获得高浓度的重组腺病毒。 TCID 50法测定重组腺病毒滴度，通过荧光显微镜和实时荧光定量PCR（ Real-time qPCR）鉴定PU．1基因在HEK293细胞中的表达。结果菌落PCR、酶切电泳及测序结果均表明重组腺病毒携带有正确的PU．1基因，TCID 50法计算腺病毒滴度为8×1011 IU／mL，荧光显微镜下可见明显的绿色荧光，Real-time qPCR转染重组腺病毒组 PU．1 mRNA表达量是转染空病毒组的2189．93倍。结论成功构建并获得了高浓度的人转录因子PU．1基因重组腺病毒，为后续研究高表达PU．1在宿主抗烟曲霉感染中的天然免疫作用奠定了基础。
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健康人外周血烟曲霉硫氧还蛋白还原酶抗原特异性T 淋巴细胞检测与结果评价
目的：为评估烟曲霉硫氧还蛋白还原酶（ thioredoxin reductase ， TR）抗原是否具有免疫保护作用，文中建立并优化检测健康人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell ， PBMC）中TR抗原特异性T淋巴细胞（TR／AST）分泌干扰素γ（interferon γ， IFN-γ）与白细胞介素-4（interleukin-4， IL-4）的酶联免疫斑点法（enzyme linked immunospot assay ， ELISPOT）检测技术，以探讨TR抗原特异性T淋巴细胞在侵袭性曲霉病（ invasive aspergillosis ， IA）中的作用。方法采用方阵滴定法优化ELISPOT反应条件。以烟曲霉TR为特异性刺激物，阳性细胞刺激剂为对照，用ELISPOT技术检测20名健康人外周血PBMC分泌IFN-γ、IL-4的阳性斑点形成细胞（spot forming cell， SFC）频数。结果方阵滴定法结果显示，10μg TR抗原、健康人PBMC终浓度为3×105／孔时ELISPOT检测结果佳。20名健康人特异性分泌IFN-γ和IL-4的SFC频数分别为15（3．5，59．5）个和0（0，0）个，IFN-γ的SFC频数显著高于IL-4，差异有统计学意义（P＜0．001）。 TR可刺激所有20名健康人产生IFN-γ应答，其中9例产生强IFN-γ应答（SFC＞20个／3×105 PBMC），占45％；而19名健康人在TR刺激后不产生IL-4应答，仅1例产生弱IL-4应答（SFC＝1）。结论烟曲霉TR抗原诱导的T细胞免疫以Th1型免疫应答占绝对优势，因此，该抗原具有成为保护性抗原的潜能。
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两种曲霉菌相关性哮喘临床诊治特点对比分析
目的 提高对两种曲霉菌相关性哮喘——变应性支气管肺曲霉病(ABPA)和真菌致敏性严重哮喘(SAFS)的认识,减少误诊和漏诊.方法 回顾性对比分析23例ABPA患者和7例SAFS患者的临床资料.结果 ABPA患者和SAFS患者哮喘病史、喘息、胸闷气急等哮喘发作症状、嗜酸性粒细胞百分比、C反应蛋白(CRP)、血清总IgE、烟曲霉特异性IgE、PaCO2、HCO3-比较差异均有统计学意义(均P＜0.05).SAFS患者CT表现无特异性,而ABPA患者胸部CT表现为中心性支气管扩张、黏液栓、迁移性肺浸润影等.糖皮质激素联合抗真菌治疗ABPA和SAFS效果明显.然而ABPA和SAFS治疗后复发率高,尤其是ABPA,7例患者在治疗过程或停药后复发.结论 SAFS较ABPA更易被误诊、漏诊,对于严重、难治性哮喘合并或不合并胸部CT表现异常的患者,均应常规行真菌学相应检查.激素联合抗真菌治疗对于ABPA和SAFS均有显著疗效,但两者均易复发,定期随访对于早期发现疾病进展、反复十分必要.
关键词： 变应性支气管肺曲霉病 真菌致敏性严重哮喘 烟曲霉 糖皮质激素 抗真菌药物 -
变应性支气管肺曲霉病6例临床分析
目的 分析ABPA的临床特征和诊断情况.方法 分析确诊的6例ABPA患者的临床资料.结果 6例中,喘息6例,咳嗽、咳痰5例,咯血2例,发热2例.6例外周血中总IgE及外周血中EOS比均升高,6例曲霉皮肤点刺试验阳性;5例血清特异性烟曲霉IgE抗体升高;4例血清特异性烟曲霉IgG抗体升高.结论 ABPA主要临床特点为常有哮喘病史,胸部影像学特征性改变,外周血中嗜酸粒细胞、血清总IgE水平和烟曲霉特异性IgE抗体均升高,对哮喘合并支气管扩张的患者应想到ABPA的可能.
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烟曲霉Bem46基因敲除株构建及其功能初步研究
目的 构建烟曲霉Bem46基因敲除株,初步明确Bem46基因在烟曲霉生长出芽和各种压力传导中的作用,以及对细胞壁形成的影响.方法 采用生物信息学方法查找烟曲霉中Bem46基因,设计引物,并以pyrG作为筛选标记构建烟曲霉Bem46基因敲除株(△Bem46).观察含不同压力物质培养基上对照菌株和△Bem46径向生长速度,观察两菌株发芽状况以及在含有细胞壁抑制剂培养基上的生长状况.结果 通过序列比对在烟曲霉基因组中找到了Bem46基因,其编号为Afu7g04660,由1 116 bp碱基组成,编码311个氨基酸.使用原生质体法得到烟曲霉△Bem46并经PCR和Southernblot确认.经观察在含有山梨醇作为渗透压力来源的培养基上△Bem46生长明显较对照菌株快.显微镜下观察到在GMM液体培养基中,△Bem46发芽速度慢于对照株.结论 烟曲霉Bem46基因涉及由山梨醇引起的渗透压压力传导,并且该基因对促进孢子发芽可能有作用.
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汉防己甲素对伊曲康唑、伏立康唑和泊沙康唑抗烟曲霉体外增效活性研究
目的 探讨汉防己甲素(tetrandrine,TET)对伊曲康唑(itraconazole,ITR)、伏立康唑(voriconazole,VRC)和泊沙康唑(posaconazole,PCZ)体外抗烟曲霉有无增效活性.方法 参照MS8-A2方案的微量稀释法,以23株烟曲霉临床株为研究对象,测定TET对其的大非细胞毒性剂量和ITC、VRC、PCZ单独及联合TET对其的小抑菌浓度(minimal inhibitoryconcentrations,MICs).结果 TET抗烟曲霉的大非细胞毒性剂量为80 μg/mL.ITC单独及联合TET对烟曲霉的MIC值范围分别为0.5 μg/mL～32μg/mL和0.0625 μg/mL～4 μg/mL,差异有统计学意义(P＜0.05);VRC单独及联合TET的MIC值范围分别为0.25 μg/mL～2 μg/mL和0.03125 μg/mL～0.25 μg/mL,差异有统计学意义(P＜0.05); PCZ单独及联合TET的MIC值范围分别为0.125 μg/mL～1 μg/mL和0.03125 μg/mL～0.25 μg/mL,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 汉防己甲素在体外对伊曲康唑、伏立康唑和泊沙康唑抗烟曲霉有增效活性.
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以棋盘法测定汉防己甲素与伊曲康唑的体外联合抗烟曲霉作用
目的 探讨汉防己甲素在体外对伊曲康唑抗烟曲霉活性是否有增效作用.方法 参照美国临床和实验室标准协会(CLSI)推荐的M38 A2方案,采用棋盘式微量液基稀释法,以21株烟曲霉临床株为研究对象,测定汉防己甲素联合伊曲康唑对其的抗真菌活性,以OD值测定法判读低抑菌浓度,并以FICI法评价结果,同时以其中的AF46株为代表,用等效线图解法验证结果.结果 汉防己甲素与伊曲康唑单独作用于上述烟曲霉临床株的低抑菌浓度值分别为256～512 μg/mL、0.125～32 μg/mL,联合用药时的低抑菌浓度值分别降至8～64 μg/mL、0.03～2 μg/mL,且终点清晰,“拖尾现象”消失,FI-CI值为0.08～0.38,均表现为显著协同作用.AF46株的等效曲线呈凹形,也表明具有协同作用.结论 汉防己甲素在体外对伊曲康唑抗烟曲霉活性有显著增效作用.
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改进异硫氰酸/酚/氯仿一步法制备烟曲霉总RNA
目的:高质量地提取烟曲霉总RNA,为从转录水平研究烟曲霉病理机制奠定基础.方法:异硫氰酸/酚/氯仿一步法制备烟曲霉总RNA,1.5%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像仪照相.结果:提取的RNA OD260/OD230＞2.0,OD260/OD280为1.8～2.0,电泳条带清晰,RNA纯度及完整性好.结论:该方法可用于制备高质量的烟曲霉总RNA.
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试管法测定6种抗真菌药物对烟曲霉MIC的比较
近年来,深部真菌感染呈上升趋势,尤其是侵袭性曲霉菌感染,病情十分严重,已成为血液病、骨髓移植、重症免疫受损患者死亡的主要原因,1,2 其预后差,病死率高达80%～90%,因此我们对抗深部真菌药两性霉素B、伊曲康唑、伏力康唑、卡泊芬净、氟康唑、特比萘芬进行体外抗菌活性比较,为临床正确选择高效敏感的抗烟曲霉的抗菌药物提供实验依据,提高临床治愈率.
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烟曲霉对人THP-1细胞中IL-6分泌和信号分子IκBɑ活化的影响
目的: 明确烟曲霉对THP-1细胞中IL-6水平和细胞内信号分子NF-κB抑制蛋白(IκBɑ)激活的影响.方法: 体外培养THP-1细胞,分为106CFU/mL和107CFU/mL烟曲霉组,β-Glucan (100g/L)阳性对照组和空白对照组,RT-PCR和ELISA检测各组IL-6 mRNA和蛋白表达水平,免疫印迹法检测IκBɑ和磷酸化IκBɑ水平.结果: 106 CFU/mL IL-6 mRNA水平低于107CFU/mL烟曲霉组,选择107CFU/mL烟曲霉组作为实验浓度.107CFU/mL烟曲霉组IL-6 mRNA和蛋白浓度分别为(209.38±25.35)ng/L和(879.86±32.35)ng/L高于空白对照组的(1.19±0.36)和(10.67±0.17)ng/L,差异均有统计学意义(均P<0.05).烟曲霉作用于THP-1细胞后磷酸化IκBɑ蛋白水平显著升高.NF-κB信号通路抑制剂BAY 11-7082可显著降低烟曲霉组IL-6 mRNA的表达.结论: 烟曲霉可能通过激活THP-1细胞中的IκBɑ刺激IL-6分泌.
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黄芩素联合两性霉素B对烟曲霉菌生物被膜的体外作用
目的：探讨黄芩素联合两性霉素B( AMB)对烟曲霉菌生物被膜的破坏作用和杀菌效果。方法采用微量液基稀释法测定黄芩素及AMB对烟曲霉菌的低抑菌浓度( MIC)及低杀菌浓度( MFC)；构建烟曲霉菌菌株生物被膜模型,将模型分为空白组、黄芩素组、AMB组、黄芩素+AMB组。成模24 h加入黄芩素组、AMB组、黄芩素+AMB组分别加入相应药物干预(黄芩素浓度128μg/mL,AMB浓度8 g/mL),空白组不干预。药物干预48 h后,结晶紫染色法行生物被膜半定量观察,胞外基质染色法荧光显微镜下观察生物被膜形态。结果生物被膜半定量结果：AMB组与空白组比较,P>0.05；黄芩素组低于AMB组和空白组,P均<0.05；黄芩素+AMB组低于黄芩素组,P<0.05。荧光显微镜下空白组和AMB组可见菌丝密集交叉缠绕,胞外基质丰富；黄芩素组菌丝仍密集交叉在一起,但菌丝细长、光滑,无明显胞外基质；黄芩素+AMB组菌丝明显减少,无明显胞外基质。结论黄芩素可以破坏烟曲霉生物被膜胞外基质。黄芩素与AMB联合应用可增加AMB对烟曲霉菌丝的渗透作用,提高其杀菌效果。
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五种抗深部真菌药物对烟曲霉体外抗菌活性的实验研究
目的 测定五种抗深部真菌药物对烟曲霉体外抗菌活性,为临床治疗侵袭性烟曲霉感染提供理论依据.方法 应用美国临床实验室标准化协会(CLSI)的微量液基稀释法 M38-A方案,测定烟曲霉临床株对伊曲康唑(ICZ)、两性霉素B(AmB)、伏立康唑(VRC)、卡泊芬净(CBF)、 氟康唑(FCZ)的敏感性.结果 MIC几何均数VRC为 0.29 μg/ml、CBF为0.45 μg /ml、ICZ为0.52 μg /ml、AmB为0.55 μg /ml、FCZ为62.58 μg /ml.结论 VRC、CBF、ICZ、AmB均有很强的抗烟曲霉作用,FCZ对烟曲霉均耐药.
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慢性烟曲霉暴露对支气管哮喘大鼠气道高反应性、气道炎症及气道重构的影响
目的：探讨慢性烟曲霉暴露对支气管哮喘大鼠气道高反应性、气道炎症和气道重构的影响。方法将56只雄性Wistar大鼠随机分为A组（慢性哮喘组）、B组（慢性哮喘＋烟曲霉孢子滴入组）、C组（慢性哮喘＋生理盐水滴入组）、D组[卵白蛋白（ OVA）致敏＋生理盐水激发＋生理盐水滴入组]、E组（ OVA致敏＋生理盐水激发＋烟曲霉孢子滴入组），B组再分成B1、B2、B3组（分别吸入烟曲霉1、3、5周），每组各8只。测定大鼠气道阻力（Raw）及乙酰胆碱注射后Raw变化率；ELISA法测定血清中总IgE和肺泡灌洗液（ BALF）中IL-13、IL-5、IFN-γ、TGF-β水平；制作肺组织切片，并行HE染色、过碘酸雪肤（ PAS）染色、Masson三色染色和病理图像形态学测定，观察各组气道上皮细胞损伤脱落、杯状细胞增生及上皮下纤维化程度。结果 B3组Raw和BALF中IL-5、IL-13、TGF-β水平及血清总IgE水平、炎细胞浸润、嗜酸性粒细胞浸、脱落上皮长度／气道上皮内径、杯状细胞增生、上皮下胶原纤维沉积均高于A、C、D、E组（P＜0．05或P＜0，01）。结论慢性烟曲霉暴露可加重支气管哮喘大鼠气道高反应性、气道炎症和气道重构程度。
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兔眼外源性烟曲霉性眼内炎模型的建立
目的 建立兔眼外源性烟曲霉性眼内炎模型.方法 选取健康成年新西兰大白兔24只,随机分为8组进行预实验.分别于右眼玻璃体内接种浓度为(1.0～1.5)×104CFU·L-1、(1.0～1.5)×105 CFU·L-1、(1.0～1.5)× 106 CFU·L-1、(1.0～1.5)×107CFU.L-1、(1.0～1.5)×108 CFU·L-1、(1.0～1.5)×109CFU·L-1、(1.0～1.5)×107CFU·L-1的烟曲霉孢子悬液及生理盐水0.1 mL.观察15 d后,对眼球进行组织病理学观察,并取玻璃体液进行真菌培养、真菌形态学及分子生物学鉴定.选取能引起典型临床特征的较低浓度孢子悬液进行重复实验.结果玻璃体内接种浓度为(1.0～1.5)×104CFU·L-1、(1.0～1.5)×105 CFU·L-1和(1.0～1.5)×106 CFU·L-1的新西兰大白兔眼部组织感染体征较轻,3个浓度组成模率为11%;其余浓度组眼部体征较重,成模率为100%.经重复实验确定(1.0～1.5)×107 CFU·L-1的烟曲霉孢子悬液可引起新西兰大白兔眼部组织典型的感染体征,眼部组织培养真菌呈阳性,主要内脏和血液培养阴性.结论 玻璃体内接种(1.0～1.5)×107 CFU·L-1浓度的烟曲霉孢子悬液能够成功建立兔眼外源性烟曲霉性眼内炎模型.
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桂皮油藿香油复合物对曲霉菌抗菌活性及机理的研究
目的 探讨桂皮油和藿香油复合物对烟曲霉、黄曲霉体外抗菌活性及药物作用于烟曲霉菌后形态和超微结构的变化.方法 采用试管药基倍比稀释法,用桂皮油藿香油复合物对烟曲霉、黄曲霉进行MIC测定,对烟曲霉进行扫描电镜(SME)和透射电镜(TEM)的观察.结果 桂皮油藿香油复合物对烟曲霉MIC均值为桂皮油0.129 mg/ml,藿香油0.064mg/ml;对黄曲霉MIC均值为桂皮油0.257 mg/ml,藿香油0.129 mg/ml.药物作用于烟曲霉后SEM下,24 ～72 h菌丝粗细不一,形态不规则,胞壁脱落,呈碎片状.TEM下,24～72 h细胞水肿,细胞器大部分溶解消失,呈空泡状.结论 桂皮油藿香油复合物对烟曲霉、黄曲霉有很强的抗菌活性,作用于烟曲霉菌后,菌丝胞壁很快溶解脱落,呈不规则或碎片状,细胞内水肿,细胞器消失,细胞变性死亡.
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两性霉素B与大蒜素单独及联合应用抗烟曲霉菌的研究
目的 比较两性霉素B(AMB)与大蒜素体外单独及联合应用对烟曲霉生长的抑制作用,并检测药物对烟曲霉孢子萌发管形成的影响.方法 采用微量稀释法检测AMB和大蒜素单独及联合应用对烟曲霉的抗菌作用,并用部分抑菌浓度指数(FICI)对结果进行评价；同时检测两药联合应用对烟曲霉孢子萌发率的影响.结果 AMB、大蒜素的MIC值范围分别为0.5 ～4 μg/ml和32 ～512 μg/ml,8株烟曲霉菌中6株两药联用表现为协同作用,且联用后两药的MIC值均降低；联用后孢子萌发率显著下降(P＜0.01).结论 AMB和大蒜素联用对烟曲霉的抗菌作用表现为协同作用,大蒜素能提高AMB抑制烟曲霉的生长作用,两药联用后低浓度的药物能达到高浓度药物的药效.
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烟曲霉致病因子的研究进展
曲霉菌以腐物寄生的形式广泛存在于自然环境中,易在空气、水、腐烂植物、低矮潮湿环境、寝具和一些食物中存在,为条件致病菌,可分为18个群、132个种和18个变种.
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根癌农杆菌介导的烟曲霉几丁质合成酶chsC基因缺失突变体的构建
目的 利用根癌农杆菌介导的基因转化定点插入突变几丁质合成酶chsC基因,实现基因失活而构建几丁质合成酶chsC基因缺失烟曲霉突变体.方法 构建根癌农杆菌二元载体pDHt/SK,利用根癌农杆菌介导的转化插入突变烟曲霉几丁质合成酶chsC基因,用潮霉素抗性基因筛选转化子,并进行实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)鉴定.结果 潮霉素抗性基因通过同源重组成功插入烟曲霉基因组中;经RT-PCR鉴定,烟曲霉几丁质合成酶基因chsC表达失活.结论 利用根癌农杆菌介导的基因转化可以定点插入突变并失活目的基因,此方法有可能成为烟曲霉基因转化和功能基因组研究的有力工具.
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两性霉素B联合阿奇霉素及其他抗真菌药对烟曲霉体外抗菌活性研究
目的 探讨两性霉素B(AMB)联合阿奇霉素(AZI)及其他常用抗真菌药对临床分离的30株烟曲霉体外抗菌活性,以指导临床治疗侵袭性曲霉病合理用药.方法 药敏试验采用美国临床实验室标准化研究所(CLSI)制定的M38-A方案.结果 抗真菌药体外抗菌活性依次为伏立康唑(VRC)0.29μg/mL,卡泊芬净(CBF)0.45μg/mL,伊曲康唑(ICZ)0.52μg/mL,AMB 0.55μg/mL.烟曲霉对特比萘芬(TBF)、5-氟胞嘧啶(5-FC)、氟康唑(FCZ)、AZI均显示耐药.联合用药有协同作用的为:AMB+ICZ(96.67%)、AMB+VRC(90.00%)、AMB+CBF(83.33%)、AMB+5-FC(50.00%).结论 单独用药时,AMB、ICZ、VRC、CBF有很强的抗烟曲霉作用,烟曲霉对FCZ耐药,AZI无对抗烟曲霉作用;联合用药时,AMB与ICZ、VRC、CBF、5-FC有协同抗菌作用.对于侵袭性曲霉病,可选择AMB联合用药.
