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比较两种小鼠胚胎培养方法在辅助生殖实验室质量控制中的应用
目的:检测辅助生殖实验室的培养体系是否存在对胚胎有害的内毒素,以保证培养体系的可靠性,比较两种培养方法敏感性.方法:收集小鼠合笼后2细胞期胚胎,采用一直添加白蛋白和24h后去除白蛋白两种方法培养,观察胚胎发育情况;结果:96h的囊胚形成率分别为90.37%、86.15%,无统计学差异(P＞0.05),而早期囊胚、扩张囊胚和孵化囊胚形成率有统计学差异(P＜0.01),扩张囊胚和孵化囊胚评分有统计学差异(P＜0.05).结论:建立一个高水平的生殖医学中心,必须有一套严格的实验室质量控制系统,上述两种方法均可作为实验室培养体系检测的评价指标,但去除白蛋白培养的方法更敏感.
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右输卵管妊娠破裂漏诊1例
输卵管妊娠破裂多见于妊娠6周左右输卵管峡部妊娠.受精卵着床于输卵管黏膜皱襞间,囊胚生长发育时绒毛向管壁方向侵蚀肌层及浆膜,终穿破浆膜,形成输卵管妊娠破裂,输卵管肌层血管丰富,短期内可发生大量腹腔内出血使患者出现休克,出血较输卵管妊娠流产剧烈,也可反复出血,在盆腔与腹腔内形成血肿.孕囊可自破裂口排出,种植于任何部位,若囊胚较小则可被吸收,若过大则可在直肠子宫陷凹内形成包块或钙化为石胎.异位妊娠破裂后患者会感剧烈腹痛和大量内出血,出现面色苍白、脉搏细速、血压下降等休克现象,在就医之前,应当头低、脚高,保持宁静,防止出血.但是在诊断上不太明显,本文总结分析右输卵管妊娠破裂漏诊情况.现报告如下.
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囊胚移植对增加单卵双胎风险的研究
目的 比较囊胚期胚胎移植和卵裂期胚胎移植单卵双胎的发生率. 方法 回顾性分析2009年1月—2011年12月在本院生殖中心行体外受精-胚胎移植/卵胞浆内单精子显微注射患者的资料,根据移植胚胎的发育阶段,分为卵裂胚移植组和囊胚移植组.比较两组单卵双胎的发生率及其临床结局. 结果 卵裂期胚胎移植组移植胚胎的数目多[(2.0±0.3)个],多胎率高(32.1％),与囊胚移植组比较,差异有统计学意义;卵裂期胚胎移植组和囊胚移植组的单卵双胎率(2.6％和3.6％)、流产率(33.3％和29.4％)、活胎分娩率(66.7％和70.6％)、早产率(75.0％和66.7％)及低体重儿出生率(50.0％和78.3％)差异均无统计学意义. 结论 囊胚移植不增加单卵双胎发生率的风险.
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囊胚玻璃化冷冻对子代发育行为和生殖能力评价
目的 通过观察囊胚玻璃化冷冻对复苏移植后小鼠的生长发育、神经功能、行为学和生殖能力的影响,评估该技术的长期安全性. 方法 通过促排卵收集性成熟期前C57BL/6雌鼠囊胚,玻璃化冷冻,复苏移植到ICR代孕鼠.仔鼠出生后,观察产仔数和有无外观畸形,记录新生鼠不同时期的生理指标;以正常C57BL/6小鼠为对照,通过转轮、水迷宫和社交试验检测小鼠的运动协调、学习记忆和社交习性;8周龄后检测生殖力. 结果 囊胚玻璃化冷冻鼠发育指标和行为学各项测试结果与对照小鼠对比差异没有统计学意义;囊胚冷冻雄鼠的生殖力(37.5％)和每胎产仔数[(6.7±2.5)只]与对照组[35.0％,(6.5±1.9)只]差异没有统计学意义. 结论 囊胚玻璃化冷冻出生的小鼠在生长发育、行为学特征和生殖力等方面和对照鼠无明显差异,表明小鼠囊胚玻璃化冷冻技术是安全和可靠的.
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固肾安胎中药对小鼠早期胚胎体外发育的影响
固肾安胎中药在助孕保胎方面有着良好的临床疗效,其中尤以寿胎丸为经典名方.本研究旨在通过采用血清药理学及胚胎体外培养的实验方法,动态观察配有各种含药血清的培养基中早期胚胎各期(2CE至囊胚)的发育率,研究单味固肾安胎中药及寿胎丸对早期胚胎发育的作用,以探讨固肾安胎中药对早期胚胎发育的影响及作用机制.
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人胚胎干细胞原代克隆生长及其传代的研究
目的评价人胚胎干细胞建系与囊胚质量、原代克隆生长的关系. 方法 D3废弃胚胎成组共培养获得不同质量的囊胚,免疫刀去除囊胚滋养外胚层细胞后,将内细胞团(ICM)接种到饲养细胞层上生长、传代. 结果从质量好的囊胚得到的人胚胎干细胞传代的代数更多;原代克隆生长快的人胚胎干细胞传代效率更高. 结论人胚胎干细胞建系与囊胚质量、原代克隆生长情况密切相关.
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用低形态学评分D3胚胎建立人胚胎干细胞系
目的 寻找人胚胎干细胞(hESC)建系材料来源.方法 选用IVF低形态学评分的D3胚胎行序贯囊胚培养,用免疫外科的方法去除滋养细胞,将得到的内细胞团(ICM)接种于丝裂霉素C灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)上培养5～8 d,每4～7 d传代1次,分别取不同代的hESC进行碱性磷酸酶(AKP)染色、转录因子OCT-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)SSEA-4、SSEA-1、肿瘤排斥抗原(TRA)TRA-1-60、TAR-1-81、核型及体内外分化全能性鉴定.结果 130枚废弃的D3低形态学评分(评分＜16)的胚胎培养出囊胚19枚,获得原代克隆5个,成功培养出两株hESC系,它们具有hESC的共同的生物学特性.结论 部分低形态学评分的D3废弃胚胎可发育成囊胚.囊胚形成率与形态学评分相关,这些胚胎可作为建立hESC系的材料来源之一.
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脑源性神经营养因子调控热应激条件下小鼠着床前胚胎发育和凋亡
目的 探讨脑源性神经营养因子(BDNF)对正常和热应激条件下小鼠着床前胚胎发育和凋亡的影响.方法 150只雌性昆明小鼠用于实验,2细胞期胚胎添加或不添加10μg/L BDNF进行体外培养,早期囊胚37℃条件下或41℃热处理2h,观察胚胎发育情况,TUNEL法和Hoechst 33342分析囊胚细胞数量和凋亡情况,荧光技术分析Caspase-9的活力.结果 在37℃条件下BDNF能够促进早期囊胚发育,增加囊胚细胞数量,降低凋亡率及Caspase-9的活力,热应激能够降低早期囊胚的发育能力,减少囊胚细胞数量而增加凋亡率,且中等和高Caspase-9活力囊胚的比例热处理后明显增加,当培养基中添加10μg/L BDNF时,能够明显缓解热应激对早期囊胚发育和质量的不利影响.结论 BDNF对37℃或41℃热应激条件下小鼠着床前胚胎发育、细胞数量、凋亡和Caspase-9活力起到一定的调控作用.
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卵丘颗粒细胞骨形发生蛋白-15、6信号通路分子表达对受精卵发育能力的影响
目的 探讨卵丘颗粒细胞骨形态发生蛋白(BMP)-15、BMP-6信号通路分子表达对受精卵发育能力的影响.方法 收集2012年4月～2014年6月,因男性不育症行卵泡浆内单精子显微注射技术(ICSI)助孕的119例病例,456份单个卵子的卵丘颗粒细胞,采用免疫细胞化学,Western blotting方法检测颗粒细胞BMP-15、BMP-6信号通路分子蛋白的表达,采用Real-time PCR方法检测BMP-15、BMP-6信号分子基因表达.比较分析卵子ICSI后发育形成囊胚组与非囊胚组卵丘颗粒细胞BMP-15、BMP-6信号分子表达差异.结果 对两组卵丘颗粒细胞,进行了免疫细胞化学,Real-time PCR,Western blotting分析,结果发现,BMP-15、BMP-6、AKL2、AKL6、BMPRⅡ、Smad1、Samd4、Smad5、Samd8及E盒结合锌指蛋白1(ZEB1)在两组颗粒细胞中均有表达,其中BMP-15、BMP-6、AKL2、AKL6,BMPRⅡ、Smad1 Samd4及ZEB1表达,组间比较差异具有显著性(经Bonferroni校正P＜0.005).而Smad5、Samd8表达,组间比较差异无显著性(P＞0.05).结论 卵丘颗粒细胞BMP-15、BMP-6、AKL2、AKL6、BMPRⅡ、Smad1、Samd4及ZEB1信号通路分子可能通过信号通路的调控作用,对受精卵发育能力产生影响.
关键词： 囊胚 卵丘颗粒细胞 骨形态发生蛋白 卵泡浆内单精子显微注射技术 女性 -
低等级囊胚与不同质量分裂胚冻融后妊娠结局的比较
目的 比较冻胚移植周期低等级囊胚与不同质量分裂胚冻融移植后的妊娠结局,探讨不同时期和质量的胚胎的发育潜能,为临床冻融周期移植胚胎的选择策略提供参考.方法 回顾性分析2015年1月至2016年6月冻胚移植周期患者临床资料,将同一新鲜周期中既有第三天冷冻分裂胚又在第五天仅有低等级囊胚冷冻者纳入研究.其中冷冻的分裂胚按照形态学评分标准分为顶级冷冻分裂胚和次级冷冻分裂胚.患者自愿选择分裂胚或第5天囊胚解冻,移植2枚胚胎.移植胚胎均为低等级囊胚者243周期,移植胚胎均为顶级分裂胚者156周期,移植胚胎均为次级分裂胚者114周期.比较三组胚胎的临床妊娠率、种植率、早期流产率和多胎率,进行统计学分析.结果 顶级分裂胚与低等级囊胚的临床妊娠率和种植率相似(64.20%vs.64.74%,44.03%vs.46.79%),显著高于次级分裂胚(49.12%,35.48%);顶级分裂胚的早期流产率显著低于低等级囊胚和次级分裂胚(3.96%vs.8.33%,7.14%);多胎率方面,顶级分裂胚高(44.55%),其次为低等级囊胚(37.18%)和次级分裂胚(32.46%),但流产率和多胎率的差异无统计学意义.结论 冻胚移植周期中,顶级分裂胚与低等级囊胚相比,具有更好的妊娠结局,次级分裂胚的临床结局较差.当患者冷冻的囊胚只有低等级,而同时有分裂胚冷冻时,首选顶级分裂胚进行解冻和移植,其次为囊胚,后为次级分裂胚.
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囊胚培养和移植的临床应用
目的:探讨囊胚培养及移植的结局以及囊胚质量对其影响.方法:选择57例因输卵管及男性因素受体精-胚胎移植治疗,且以促进性腺激素反应良好者,常规取卵、受精后采用G1/G2序贯培养,5D或6D(天)选择3期以上胚胎移植.观察囊胚的植入率、临床妊娠以及囊胚分期对其影响.结果:(1)平均取卵14.84个,受精卵10.33个,受精率69.6%;5D及6D平均形成囊胚3.40个,每受精卵的囊胚形成率为32.9%.51例有一个或以上可移植囊胚,平均移植胚胎2.31个,获临床妊娠24例,囊胚植入率为31.2%,临床妊娠率为47.1%.(2)按囊胚质量分期分组,移植至少一个扩展期囊胚组30例(58.8%),植入率及临床妊娠率分别为40%及60%;无扩展期囊胚组21例,植入率及临床妊娠率分别为18.8%及28.6%.经统计学分析,两组植入率差异有非常显著性(P＜0.01),临床妊娠率差异有显著性(P＜0.05).结论:采用序贯培养法进行囊胚培养移植切实可行,囊胚的质量对移植结局有影响.
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Nanog基因及其传导通路在保持胚胎干细胞多能性中的作用
胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)的研究早开始于1980年,当时鼠ES第一次被分离出来[1-2],ES来源于囊胚内细胞团(inner cell mass,ICM),可以自我复制并分化出其他胚层,这一特性对于细胞替代治疗、药物开发和自我修复治疗等研究具有重要的价值.近些年来人类ES的成功培养和分化受到了很大关注,它可以用于组织再生治疗和研究人类进化过程[3].
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累计妊娠率相关因素的探讨与分析
目的：探讨累计妊娠率的相关因素。方法选取本生殖中心2010年11月至2013年6月完成一次取卵周期的患者为研究对象，比较年龄、获 MⅡ卵比率、受精率、正常受精率、囊胚形成率和可移植胚胎率与累计临床妊娠率的相关性，并对相关因素进行深入探讨。结果年龄、囊胚生成率和可移植胚胎率与累计临床妊娠率相关。其中，30岁以下组累计妊娠率明显高于30岁以上组（卡方检验P＜0.05）。有囊胚生成组累计妊娠率显著高于无囊胚生成组（卡方检验P＜0.05）。可移植胚胎率（ETR）＞75%组累计妊娠率高于50%＜ETR≤75%组，更高于ETR≤50%组，各组间妊娠结局均有差异（卡方检验P＜0.05）。结论年龄、囊胚生成率和可移植胚胎率与累计妊娠率相关。30岁以下具有较高的临床妊娠率；非优质胚胎囊胚培养在预测累计妊娠率上有一定价值；可移植胚胎率在一次取卵周期累计妊娠率中有强提示作用。
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反复植入失败的实验室策略
反复植入失败（recurrent implantation failure, RIF）是指在体外受精-胚胎移植(in vitro fertiliza-tion-embryo transplantation, IVF-ET）中移植8细胞胚胎8枚以上，或移植囊胚5枚以上未获得临床妊娠［1］。其原因多而复杂，其中实验室因素（培养胚胎质量、移植胚胎挑选、实验室质量控制等）为导致RIF的重要原因之一［2］，不可忽视。本文就RIF实验室策略的相关研究进行综述，以期改进RIF患者的结局。
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植入前遗传学诊断和筛查的新进展
植入前遗传学检测发展早期受技术局限性以及伦理等问题影响，发展缓慢。近年来，随着人类胚胎学和人类基因组学的快速发展，一系列诸如囊胚活检，玻璃化冻存，芯片检测技术以及第二代测序等高新技术的应用，很大程度上解决了早期限制其应用的各种问题，为其应用和推广打开了崭新的局面，但同时又带来新的问题。本文从胚胎学家的视角回顾了植入前遗传学检测的历史，发展过程中涉及的关键因素以及新技术应用可能带来的影响及局限性。
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人卵裂期胚胎和囊胚玻璃化冷冻妊娠结局分析
目的 探讨人卵裂期胚胎和囊胚玻璃化冷冻解冻后复苏效果及妊娠结局.方法 回顾性分析434个卵裂期胚胎(卵裂组)和102个囊胚解冻周期(囊胚组)的临床资料,比较采用玻璃化冷冻解冻后的复苏率及妊娠结局.结果 囊胚组患者的临床妊娠率和胚胎种植率分别为63.73％ (65/102)和45.79％ (87/190),卵裂组分别为42.82％ (185/432)和24.17％ (241/997),两组比较,差异均有统计学意义(P均＜0.05);囊胚组患者的复苏率、流产率和异位妊娠率分别为98.45％ (190/193)、12.31％ (8/65)和0(0/65),卵裂组分别为97.55％ (997/1 022)、13.51％ (25/185)和2.16％ (4/185),两组比较,差异均无统计学意义(P均＞0.05).卵裂组中,卵裂球完全存活患者的临床妊娠率和胚胎种植率分别为44.62％ (170/381)和25.57％(224/876),非完全存活者分别为29.41％ (15/51)和14.05％ (17/121),两组比较,差异均有统计学意义(P均＜0.05).结论 囊胚解冻移植的妊娠结局优于卵裂期胚胎,卵裂期胚胎解冻后胚胎的完整性影响胚胎种植.
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基于微阵列比较基因组杂交技术的胚胎植入前遗传学诊断和筛查在不同阶段胚胎中的临床应用结局分析
目的 探讨微阵列比较基因组杂交(array-CGH)技术在胚胎植入前遗传学诊断或胚胎植入前遗传学筛查(PGD/PGS)中的应用效果及不同胚胎阶段活检的临床结局的差异.方法 回顾性分析2011年7月至2015年8月在南京医科大学第一附属医院进行PGD/PGS治疗的381个周期,其中, PGD 320个周期,采用卵裂期活检156个周期、囊胚期活检164个周期;PGS 61个周期,采用卵裂期活检23个周期、囊胚期活检38个周期.活检标本采用单细胞全基因组扩增结合array-CGH技术行染色体拷贝数分析.所有移植周期均采用单胚胎移植,以活产率作为主要临床结局的评价指标.结果array-CGH技术在PGD/PGS中的明确诊断胚胎比例达96.9%~99.1%.PGD活检周期中,卵裂期活检的每移植周期活产率和每活检周期活产率分别为50.0%(58/116)、37.2%(58/156),而囊胚期活检者分别为67.5%(85/126)、51.8%(85/164),分别比较,差异均有统计学意义(P均<0.01).PGS活检周期中,卵裂期活检的每移植周期活产率和每活检周期活产率均为34.8%(8/23),而囊胚期活检者均为42.1% (16/38),分别比较,差异均无统计学意义(P均>0.05).结论 array-CGH技术在PGD/PGS中的应用具有高诊断率,基于array-CGH技术的PGD/PGS可获得理想的临床活产率.在PGD周期中,囊胚期活检比卵裂期活检具有更高的活产率.
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小剂量阿司匹林对促排卵子宫内膜发育的影响
诱发排卵是不孕症常用的治疗方法.氯米芬等促排卵率为55%～99%,但其妊娠率仅为25%左右[1] .氯米芬可直接[2] 及通过减少子宫的血液供应而影响子宫内膜的发育[3],造成囊胚种植时子宫内膜不良的容受状态,使妊娠率降低.本研究于促排卵同时给予小剂量阿司匹林,通过增加子宫的血液供应,改善氯米芬促排卵时造成的子宫内膜发育不良,以提高妊娠率.
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卵裂期发育延缓胚来源的人类胚胎干细胞系的建立
目的 观察体外受精(IVF)周期中24 h内不发生卵裂的第3天(D3)发育延缓胚的体外发育潜能,为建立人胚胎干细胞库提供新的材料来源.方法 通过囊胚序贯培养法将卵裂期发育延缓胚培养至囊胚,观察囊胚形成率及囊胚质量.用逐步logistic回归分析囊胚形成率与卵裂球数、卵裂球对称性及卵裂球碎片比率的相关性.用免疫外科法去除滋养细胞,将得到的原代克隆接种于小鼠胚胎成纤维细胞上,体外传代并鉴定.结果 120枚卵裂期发育延缓胚培养出囊胚22枚(囊胚形成率18.7%).第6天早期囊胚、囊胚、满囊胚、扩张胚、孵化胚及孵化后囊胚的比率分别为5.9%、23.5%、35.3%、23.5%、5.9%及5.9%.内细胞团分级及滋养外胚层分级均仅有1个为A级,其余均为B或C级.发育延缓胚的囊胚形成率与卵裂球数、卵裂球对称性相关,而与卵裂球碎片比率无关.获得内细胞团7个,原代克隆3个,成功培养出2株人类胚胎干细胞系(hESC),并具有hESC的生物学特性:碱性磷酸酶(AKP)、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)4、肿瘤排斥抗原(TRA)1-60、TRA-1-81呈阳性;悬浮培养可形成拟胚体;在严重免疫缺陷(SCID)小鼠体内可形成畸胎瘤;分别传45及35代后核型正常.结论 部分发育延缓胚可以发育为囊胚,从而可为建立人胚胎干细胞系提供新的材料来源.
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未见原核囊胚与双原核囊胚冻融移植后临床结局的比较
目的 分析未见原核(0PN)来源胚胎和正常受精的双原核(2PN)来源胚胎的优质囊胚形成率,以及囊胚冻融移植后的临床结局,评价0PN囊胚的临床应用价值及新生儿情况.方法 回顾性分析2015年1月—2016年12月在山东大学附属生殖医院体外受精(IVF)或卵母细胞胞质内单精子注射(ICSI)治疗周期中出现的0PN来源胚胎及2PN来源胚胎的临床资料,分析两种受精方式0PN来源胚胎及2PN来源胚胎的优质囊胚形成率;收集囊胚冻融移植周期中,移植IVF或ICSI来源的、第5天(D5)或第6天(D6)2PN囊胚及0PN囊胚的临床资料,分析临床妊娠率、胚胎种植率、流产率、活产率和新生儿异常率.结果(1)IVF方案中2PN来源胚胎比0PN来源胚胎的优质囊胚形成率略高(分别为46.64%、42.42%),差异有统计学意义(P<0.01);ICSI方案中2PN来源胚胎的优质囊胚形成率(41.96%)更显著高于0PN来源胚胎(21.73%),差异也有统计学意义(P<0.01).(2)囊胚冻融移植周期中,IVF方案的D5 0PN囊胚的临床妊娠率、胚胎种植率、流产率、活产率和新生儿异常率(分别为52.64%、49.91%、17.37%、46.54%、1.31%),分别与D6 2PN囊胚的临床妊娠率、胚胎种植率、流产率、活产率和新生儿异常率(分别为46.78%、41.20%、23.36%、39.56%、4.21%)比较,差异均有统计学意义(P均<0.05).IVF方案的D5 2PN囊胚的临床妊娠率、胚胎种植率、活产率和新生儿异常率(分别为59.73%、55.95%、53.03%、3.90%),分别与D5 0PN囊胚的相应指标比较,差异均有统计学意义(P均<0.05);其中新生儿异常率2PN囊胚略高于0PN囊胚,余3项均优于0PN囊胚;流产率无明显差异(P>0.05).IVF方案中D5 2PN囊胚的临床妊娠率、胚胎种植率、流产率和活产率(分别为59.73%、55.95%、18.23%、53.03%)与D6 2PN囊胚的相应各率(分别为46.78%、41.20%、23.36%、39.56%)分别比较,差异均有统计学意义(P均<0.05),仅新生儿异常率无明显差异(P>0.05).结论 在优先移植2PN囊胚的原则上,0PN囊胚在知情同意后可以用来移植;IVF方案中,综合2PN和0PN囊胚的发育速度和质量评价,选择获得妊娠可能性大的囊胚进行移植.
