HLA-E cDNA克隆及在LcL721.221细胞的表达

目的克隆HLA-E cDNA,并使其在HLAⅠ类阴性的靶细胞LcL721.221细胞上获得稳定表达.方法用RT-PCR方法从人外周血淋巴细胞扩增出HLA-E cDNA,并通过内核糖体进入位点(IRES)将目的基因亚克隆于已经载有HLA-A2的逆转录病毒表达载体pGCEN上,构建成HLA-A2/E多顺反子表达载体(pG/A2E),采用感染的方法将重组质粒转入LcL721.221细胞,后经G418筛选及有限稀释,利用抗HLA-E特异的单克隆抗体3D12进行FACS检测,以观察HLA-E分子在靶细胞表面的表达情况.结果 HLA-E分子在经pG/A2E转染的靶细胞表面获得明显的表达(88.79%),且显著高于表达HLA-E的对照细胞株JAR(26.21%),而经pG/A2载体转染的靶细胞则未获得表达. 结论成功构建了pG/A2E多顺反子表达载体,并使HLA-E分子在HLAⅠ类阴性的LcL721.221细胞表面获得表达.

气道内应用IL-12抑制抗原诱导的过敏性气道反应

目的探讨气道内应用白细胞介素12(IL-12)对抗原诱导的过敏性反应的影响.方法 C57BL/6小鼠经OVA免疫建立哮喘模型,在主动免疫及抗原激发阶段气道内应用IL-12,观察肺泡灌洗液细胞成份、肺部淋巴细胞产生细胞因子、外周血IgE水平变化.结果①致敏阶段应用IL-12可明显抑制嗜酸性粒细胞浸润、肺淋巴细胞对IL-5的分泌以及血浆总IgE和抗原特异性IgE的水平;②激发阶段应用IL-12可明显抑制嗜酸性粒细胞的浸润,抑制肺淋巴细胞产生IL-4、IL-5,增加其产生IFN-γ,但对抗原特异性IgE无明显影响;③如致敏和激发阶段均应用IL-12,则明显抑制肺淋巴细胞产生IL-4、IL-5,增强IFN-γ产生,抑制气道内嗜酸性粒细胞的浸润及血浆IgE的升高.结论气道应用IL-12对抗原诱导的气道过敏性炎症有明显调节作用,且与应用时机有关,为IL-12治疗哮喘提供依据.

人黑色素瘤抗原MAGE-3基因的克隆与表达

目的克隆人黑色素瘤特异抗原MAGE-3基因,以制备肿瘤DNA疫苗.方法用RT-PCR方法制备MAGE-3基因,以哺乳细胞高效表达质粒pCI-neo为载体,构建重组DNA疫苗.重组体用载体上的通用引物为测序引物,鉴定克隆的正确性.再将鉴定过的重组质粒用脂质体法转化293细胞,用免疫印迹法鉴定转化细胞中MAGE-3基因的表达.结果正确构建了MAGE-3/pCI-neo重组质粒,并且在转化细胞中检测出了MAGE-3的表达.结论成功地构建了重组MAGE-3/pCI-neo肿瘤核酸疫苗,可以进行下一步的肿瘤动物模型的疫苗接种及疗效观察.

人N端脂多糖结合蛋白基因在sf21昆虫细胞中的表达

目的表达重组人N端脂多糖结合蛋白(truncated lipopolysaccharide binding protein,tLBP).方法通过病毒鉴定、SDS-PAGE、western blot、毛细管电泳、体外结合实验、细胞活性实验对重组病毒及重组蛋白tLBP的分子量、纯度和生物学活性进行分析.结果重组病毒空斑分析确定MOI(multiplicity of infection)为8～10,SDS-PAGE显示感染时间65～72 h为佳表达条件;凝胶扫描显示特异表达蛋白占总产物的9.8%,纯化蛋白的分子量约27 000 u,纯度达95%以上;毛细管电泳显示表达产物呈单一峰型;Lowry法测定约1 L上清液可获9 mg 纯化蛋白;Western blot间接显示表达产物反应带与预期值相符;酶联体外结合实验证实该蛋白可特异结合LPS.应用U937细胞,经LPS(1 ng/mL)刺激与LPS(1 ng/mL)刺激加纯化蛋白(1 μg/mL)对比观察发现,加入纯化蛋白后不同时相点TNF-α含量均有所下降.结论人N端脂多糖结合蛋白在sf21昆虫细胞中获得高效表达,并观察到它在体外具有结合或中和内毒素的活性作用.

HCV核心蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫学特性研究

目的研究HCV核心蛋白在大肠杆菌中的非融合表达及重组蛋白的免疫学特性.方法用DNA重组技术在两种表达质粒(pQE3O和pTrcHisA)、4种宿主菌(DH5a, TOP10, BL21和M15)中表达HCV全长及羧基端部分缺失的核心蛋白(aa1～191,aa1～154和aa1～69),表达蛋白经SDS-PAGE检测,免疫印迹分析,亲和层析法纯化后免疫BALB/C小鼠,ELISA法检测免疫小鼠血清中抗HCV抗体水平.结果 HCV核心蛋白C154, C191在pQE30/M15中获得了表达,表达量分别占菌体总蛋白的18.2%和9.3%.免疫印迹分析的结果显示在C154和C191相应位置处出现杂交条带.ELISA结果显示C154和C191诱导小鼠产生了抗HCV 抗体.结论表达的重组蛋白具有抗原特异性和免疫原性.“截断”型HCV核心蛋白的抗原性和免疫原性并未因羧端的部分缺失而减弱.

MCP-1对培养的人肾小球内皮细胞表达ICAM-1的影响

目的研究单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)对培养的人肾小球内皮细胞(HUGEC)表达细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的影响.方法采用细胞ELISA法. 结果①培养的HUGEC表面有少量ICAM-1表达,在10 ng/mL MCP-1刺激后ICAM-1表达量增多(P＜0.05),6 h即有ICAM-1表达增强,12 h达高峰,不同浓度的MCP-1(10、20、40 ng/mL)刺激HUGEC18 h后,ICAM-1表达与对照组比较差异显著(P＜0.01);②加入抗MCP-1抗体后,ICAM-1表达量下降,与对照组比较无差异(P＞0.05). 结论 MCP-1可刺激HUGEC表达ICAM-1增加.

诱导活化的外周血单个核细胞中LIGHT基因的表达分析及其克隆

目的分析不同刺激下外周血单个核细胞(PBMC)中LIGHT基因的表达,并克隆全长的人LIGHT基因.方法按常规方法分离正常人的外周血单个核细胞后,培养于含10%FCS的RPMI1640中,并以不同浓度的LPS、TNFα、IL-2、IFN-γ、PHA及PMA刺激不同的时间,再以RT-PCR法分析PMBC内LIGHT基因转录表达,并克隆相应的全长人LIGHT基因.结果 RT-PCR分析表明:当用LPS和IFN-γ刺激PMBC 24h后,可诱导LIGHT基因的明显表达,而单独应用IL-2、TNFα、PHA和PMA则不能诱导其表达.采用PCR产物克隆方法,克隆了人LIGHT基因,并经DNA序列测定证实.结论本实验克隆得到了人LIGHT基因,为进一步研究LIGHT的功能打下了基础.

表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的减毒沙门氏菌工程菌株的构建

目的采用平衡致死系统构建表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的减毒沙门氏菌工程菌株.方法 PCR扩增幽门螺杆菌尿素酶B亚单位,与pYA3149(asd+)载体质粒重组,转化减毒的伤寒沙门氏菌突变株,SDS-PAGE,用western-blot分析其表达,并观察重组菌体外传代培养的稳定性.结果利用宿主-载体平衡致死系统构建了表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的重组减毒沙门氏菌工程菌株,且在有选择压力的条件下在体外能稳定地繁殖、生长和传代.结论表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的减毒伤寒沙门氏菌工程菌株的成功构建为发展幽门螺杆菌的口服基因工程活疫苗奠定了基础.

MG7胞内抗体的表达及活性鉴定

目的制备MG7胞内抗体并鉴定其分子量和抗原结合活性.方法以含MG7 scFv基因的质粒pCANTAB5E为模板,PCR扩增MG7 scFv基因,并在其3'端引入一段内质网滞留序列(SEKDEL),即形成MG7胞内抗体基因.DNA测序后,将MG7胞内抗体基因克隆到表达载体pGEX-3X中,转化宿主菌HB2151,IPTG诱导,SDS-PAGE分析产物分子量,ELISA检测产物的MG7抗原结合活性.结果电泳分析发现融合基因片段长约780 bp.DNA序列分析显示,SEKDEL与MG7 scFv基因正确融合;SDS-PAGE分析发现MG7胞内抗体的分子量为32 000 u;ELISA检测发现MG7胞内抗体具有明显的抗原结合活性.结论我们成功地制备并表达了MG7胞内抗体,为利用其探讨MG7抗原的功能及胃癌的基因治疗奠定了基础.

辅酶NADH对放射后外周血免疫细胞的影响

目的研究辐射后淋巴细胞亚群变化及其NADH对免疫细胞表型的影响.方法分离8例健康人群外周血淋巴细胞,每例分3组,第一、二、三组分别为不照射组、照射后不加药组和照射后加入NADH组.采用FCM分析细胞亚群及IL-2受体表达率.结果实验Ⅱ组与实验Ⅰ、Ⅲ组相比CD4/CD8比值减小,CD3、CD4、NK细胞百分率下降,CD8百分率增加,IL-2受体表达下调(P＜0.05).结论 NADH体外能够提高机体的免疫功能.

膜结合表达对HCV C基因免疫的影响

目的探讨膜结合表达对基因免疫的影响.方法流感病毒跨膜蛋白基因修饰带HBV preC分泌型信号肽的HCV C69基因,构建pc69TM质粒;35S-甲硫氨酸代谢标记和免疫沉淀检测质粒体外瞬时表达蛋白;肌肉免疫Balb/c小鼠.结果 pc69TM基因表达出的蛋白存在于膜上.免疫鼠淋巴细胞对特异性抗原刺激的增殖能力pc69TM较分泌表达型质粒pc69显著增强(P＝0.03),而2种质粒诱导小鼠产生抗体效价差异不显著(P＝0.765).结论膜结合表达能增强HCV C69基因免疫的淋巴细胞增殖能力.

IL-10抑制人肾系膜细胞环氧化酶-2及其介导的前列腺素E2的释放

目的观察白细胞介素-10(IL-10)对IL-1β诱导的人系膜细胞(HMC)前列腺素E2(PGE2)释放及环氧化酶-2(COX-2)基因和蛋白表达的影响.方法应用放射免疫测定法检测HMC培养上清中PGE2,应用RT-PCR和western blot检测COX-2 mRNA和蛋白水平.结果①IL-1β显著上调PGE2释放及COX-2基因和蛋白的表达(P均＜0.01);②IL-10对基础状态下PGE2释放及COX-2基因和蛋白表达无明显影响(P＞0.05);③IL-10可呈剂量依赖性地下调IL-1β诱导的PGE2释放及COX-2 mRNA和蛋白表达(P＜0.01).结论 IL-10抑制IL-1β诱导的HMC PGE2释放及COX-2表达,提示:IL-10对HMC具有多方面抗炎作用.

轮状病毒VP7 DNA免疫研究

目的研究促使基因分泌或膜锚定表达的基因修饰对轮状病毒VP7 DNA疫苗所诱导抗体水平的影响.方法把携带野生型(VP7wt)、分泌型(VP7s)和膜锚定型(VP7tm)3种VP7基因的重组pcDNA3质粒分别免疫小鼠,用大肠杆菌表达的重组VP7抗原检测VP7特异的抗体反应,统计分析.结果 3种DNA疫苗均能诱导轮状病毒VP7特异的IgG抗体反应,但其抗体水平之间无显著性差异.结论把轮状病毒VP7基因导入分泌或膜锚定表达途径不能增强其DNA疫苗抗体应答.

Fas/Fas-L与体外热应激胸腺细胞亚群变化及凋亡的关系

目的探讨体外热应激胸腺细胞的亚群变化及凋亡与胸腺细胞表达Fas、Fas-L的关系.方法用流式细胞术检测体外热应激后再培养的胸腺细胞不同时间的凋亡率、CD4CD8亚群及表达Fas、Fas-L的阳性率.结果体外热应激胸腺细胞的凋亡率和表达Fas及Fas-L的阳性率均呈时间依赖性增高,凋亡的胸腺细胞以CD4+CD8+双阳性胸腺细胞为主.结论热应激主要诱导CD4+CD8+胸腺细胞凋亡;Fas与Fas-L是介导热应激胸腺细胞凋亡的重要分子.

CTLA-4Ig治疗C57BL/6小鼠自身免疫性肝炎的实验研究

目的研究CTLA-4Ig在治疗C57BL/6小鼠自身免疫性肝炎上的作用.方法通过用C57BL/6近交系小鼠的肝特异性抗原与弗氏完全佐剂混合物免疫攻击小鼠,随后用CTLA-4Ig治疗,观察小鼠的临床经过、血生化、肝脏组织学改变.结果随着免疫次数的增多,治疗组临床经过、血生化、肝脏组织学改变逐步与正常对照组相似,而病理模型组与前两组有明显差异:血生化可见天冬氨酸氨基转移酶、球蛋白显著升高;肝组织学检测可见炎细胞的浸润,肝细胞的肿胀、灶性坏死甚至广泛坏死;肝组织免疫荧光检测提示有大量免疫球蛋白沉着.结论 CTLA-4Ig能有效地治疗C57BL/6小鼠自身免疫性肝炎.

IL-12对慢性乙型肝炎患者TH1/TH2分化的影响

目的观察IL-12对慢性乙肝患者TH1/TH2类细胞分化的影响.方法分离50例慢性乙型肝炎患者PBMC,分别与植物血凝素(PHA,100 μg/mL)、HBcAg(1 μg/mL)、HBeAg(1 μg/mL)单独或联合IL-12(10 ng/mL)体外培养48 h,ELISA法检测培养上清液中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平.20例健康人群做对照.结果 IL-12对健康人群PBMC产生TH1/TH2类细胞因子无显著影响,但对慢性乙型肝炎患者则显著增强PBMC产生IFN-γ,且慢性中度患者为突出.IL-12与HBeAg联合诱导,不但显著增强慢性乙型肝炎患者PBMC产生IL-2和IFN-γ,还抑制IL-4和IL-10的产生.结论 IL-12可增强慢性乙型肝炎患者IFN-γ优势表达,可促进HBeAg诱导的TH2型优势表达向TH1型优势表达转换.

IFN-γ与TNF联合治疗结核菌感染小鼠疗效及机理的研究

目的研究IFN-γ和TNF对结核分枝杆菌感染小鼠的疗效及作用机制.方法小鼠感染结核分枝杆菌后第5 d给予IFN-γ和/或TNF治疗,观察治疗后半数死亡时间、一定时间内的死亡率、脾脏内活菌数,检测脾细胞分泌IFN-γ和IL-4水平(ELISA法)及MΦ产生NO水平(用Griess试剂).结果与单纯攻毒组比较,联用IFN-γ和TNF组感染小鼠半数死亡时间明显延长、35 d内的死亡率从100%降低到20%、脾脏内活菌数显著减少,脾细胞IFN-γ分泌水平明显升高,IL-4分泌水平显著降低,MΦ产生NO水平明显增加.结论 IFN-γ和TNF联合诱导MΦ产生NO,促进TH1细胞反应,抑制TH2细胞反应,改变了TH1/TH2平衡,对结核分枝杆菌感染小鼠产生保护效应.

拉米夫定对慢性乙型肝炎患者CTL活性的影响

目的探讨拉米夫定治疗是否会影响慢性乙型肝炎患者(CHB)HBV特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)活性.方法选择34例 HLA-A2+CHB患者,其中19例患者行干扰素-α治疗,另15例患者用拉米夫定治疗.在治疗前和治疗后1、3、6个月后分离外周血单核细胞(PBMC),经体外诱导扩增,以HepG2.2.15细胞和HepG2细胞作靶细胞,乳酸脱氢酶释放法检测其细胞毒活性.结果在接受干扰素-α或拉米夫定治疗后,CHB患者HBV特异性CTL活性均能得到不同程度的恢复.两种治疗方法比较显示,干扰素-α治疗组CTL活性增强持续的时间较使用拉米夫定的治疗组长.结论拉米夫定治疗能短暂地增强CHB患者HBV特异性CTL活性.

乙肝疫苗无、弱应答与HLA-DR2、7、9相关性的研究

目的研究广东汉族人群乙肝疫苗无、弱应答水平与HLA-DR2、7、9等位基因的相关性.方法对1 400名广东籍汉族学生进行重组乙肝疫苗标准接种,末次接种后第8周检测血清抗-HBs抗体水平,对无、弱应答者和强应答者通过PCR-SSP法检测HLA-DR2、7、9. 结果无、弱应答组携带HLA-DR2、7、9的频率分别为5.08%、15.25%和19.49%;强应答组携带HLA-DR2、7、9的频率分别为2.22%,17.7%和20%;2组的HLA-DR2和HLA-DR7间比较,P＜0.05; HLA-DR9间比较,P＞0.05.结论广东汉族人群乙肝疫苗无、弱应答与HLA-DR7相关,与HLA-DR2的低携带有关,而与HLA-DR9无明确相关性.

从随机肽库中筛选抗人ANG抗体的模拟小肽

目的从随机噬菌体十二肽库中寻找抗重组人ANG抗体的模拟肽.方法以重组人ANG为目标分子,对随机十二肽库进行亲合筛选,用噬菌体ELISA及竞争抑制实验鉴定阳性克隆的结合性和特异性.结果经过3轮亲和筛选,噬菌体的回收率从2.0×10-4%增加到9.3×10-2%,阳性克隆得到富集;ELISA和竞争抑制实验证明:有9个噬菌体克隆与靶分子有较强的结合活性,其中6个阳性噬菌体克隆能特异性地抑制抗人重组ANG单抗与ANG的结合.结论该小肽可能是抗人ANG抗体的模拟小肽,可作为ANG的拮抗剂.

大容量人源单链抗体库构建中轻链重链可变区的连接

目的单链抗体库的构建过程中,多采用轻链可变区(VL)、重链可变区(VH)、和linker 3条片段重叠延伸拼接法(SOE)进行连接.为了优化抗体库的多样性,提高效率,探讨了新的连接方法.方法通过不对称PCR制备单链DNA,再俩俩连接,得到单链抗体(ScFv)基因.分别将SOE法及不对称PCR法连接得到的ScFv基因与载体连接,转化E.coli TG1,构建抗体库.结果后者只需25次连接反应,78次电击转化,既可达到1×1010库容量.结论可以认为新方法具有更高的基因构建效率,并有效提高了抗体库的多样性.

HLA-DR抗原在肝细胞癌中的表达及意义

HLA-DR通过MHCⅡ类分子限制的T细胞对外来抗原的识别,在机体免疫应答和免疫调节过程中发挥重要的作用.许多肿瘤细胞表面常出现HLA-DR的异常表达[1, 2],这种现象在肿瘤发生、发展及自身免疫调节过程中具有一定的生物学意义,而成为肿瘤免疫学研究的热点之一.本研究采用免疫组化技术对HCC肝组织中HLA-DR抗原的表达进行了检测,并探讨其意义.

梅花鹿组织细胞培养上清促小鼠免疫细胞增殖效应

梅花鹿是吉林省的特产,具有奇特的药用价值,鹿茸、鹿胎等被作为药用制剂而广泛利用,但对于鹿组织细胞培养上清的研究很少.本研究拟通过免疫细胞增殖试验探讨鹿组织细胞培养上清液对小鼠脾细胞、胸腺细胞、骨髓细胞增殖的影响作用,并进一步研究这些培养上清液中的活性因子,以便开发梅花鹿的新产品.

从琼脂糖凝胶中回收DNA方法的评估

从琼脂糖凝胶电泳分离的条带中回收DNA,是常用的分子生物学技术.回收的DNA分子,根据目的不同,可用于连接重组、序列分析、制备探针等后续工作[1].目前从琼脂糖凝胶中回收DNA的方法较多,如试剂盒法、电洗脱法、凝胶挖孔等.本研究从敏感性、回收率、经济性等几方面,比较了3种常用的从凝胶中回收DNA的方法[2].

甲状腺癌组织中细胞凋亡及相关基因Fas和Bcl-2表达的研究

1 材料与方法

树突状细胞肿瘤疫苗的研究进展

在抗肿瘤免疫应答?关键的一步是抗原呈递细胞将肿瘤抗原呈递给T淋巴细胞.树突状细胞是专职抗原呈递细胞,它能够有效的将肿瘤抗原呈递给T细胞,引发机体产生抗肿瘤的免疫应答.因此,利用树突状细胞制备肿瘤疫苗可望提供一种有效的肿瘤免疫治疗方法.目前,体外实验、动物实验和初期的临床实验都已经证明了树突状细胞肿瘤疫苗的抗肿瘤作用.本文主要介绍树突状细胞的生物学特征和树突状细胞肿瘤疫苗在肿瘤免疫治疗中的研究进展.种

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