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改进的TUNEL技术在检测急性心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡中的应用
目的:探讨并总结末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)在急性心肌梗死(AMI)大鼠心肌细胞凋亡检测中的方法学.方法:运用改进的TUNEL法检测大鼠AMI心肌组织中的细胞凋亡.结果:改进TUNEL法能特异地显示AMI大鼠心肌组织凋亡细胞核,对比明显,背景清晰,组织结构与细胞轮廓完整,染色结果稳定可靠,敏感性高,特异性强.结论:改进后的TUNEL法检测心肌组织细胞凋亡效果理想,值得推广.
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海洛因成瘾大白鼠脑细胞凋亡的观察及其机制探讨
目的:研究海洛因成瘾致脑损害中细胞凋亡现象并探讨其机制.方法:采用递增法人为建立海洛因成瘾大鼠模型,设对照组和模型组,取两组大鼠前额皮质、海马、下丘脑等部位脑组织,运用透视电镜观察和原位末端标记(TUNEL)检测脑组织凋亡细胞.结果:本实验中,在透视电镜下观察到海洛因成瘾大鼠脑内多部位神经元、星形胶质细胞各期凋亡超微病理变化影像,TUNEL检测也显示海洛因成瘾各部位脑组织细胞凋亡数明显高于对照组(P＜0.01).结论:海洛因成瘾大白鼠脑内广泛性出现神经元、星形胶质细胞凋亡.脑组织细胞凋亡参与了海洛因成瘾致脑组织细胞死亡的病理机制.
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头针对急性脑缺血再灌注大鼠细胞凋亡的影响
目的 探讨头针治疗脑缺血的可能机制.方法 将90只健康SD雌性大鼠随机分为假手术组、模型组、头针组模型组和头针组再根据缺血再灌注时间的不同而随机分为6、24、48、72h共八个亚组,采用大脑中动脉线栓法制备大脑中动脉闭塞(MCAO)再灌注模型,选取顶颞后斜线,顶颞前斜线、进针后接韩氏穴位神经刺激仪治疗;观察各时间点大鼠神经功能缺损、脑神经元TUNEL阳性细胞数的变化.结果 头针组与模型组各时相上的组间比较,第72小时头针组的NSS显著低于模型组;模型组缺血侧神经细胞凋亡数随再灌注时间延长而增加,24h达高峰;头针治疗可明显减少神经细胞凋亡数,以24、48h显著.结论 头针有利于大鼠脑神经功能的恢复,可减轻急性脑缺血再灌注后细胞凋亡,并在一定范围内降低阳性凋亡细胞的表达.头针抗脑缺血的作用机制可能为抑制细胞凋亡反应,减轻脑缺血再灌注损伤,实现脑组织的保护作用.
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肺癌中细胞凋亡水平和p73基因的转录表达的研究
目的通过观察肺癌癌组织、对应癌旁组织和远癌肺组织中细胞凋亡及p73基因转录表达水平的变化,探讨细胞凋亡及p73基因转录表达水平与肺癌发生、发展的关系.方法采用TUNEL及RT-PCR技术检测32例非小细胞肺癌癌组织、癌旁组织和7例肺良性病变组织,以及对应正常肺组织细胞凋亡和p73 mRNA的表达水平,并结合临床病理学资料进行统计学分析.结果①肺癌组织中的凋亡指数明显高于癌旁肺组织和远癌肺组织(P<0.01),细胞凋亡水平与肺癌组织学类型、分化程度和P-TNM分期无明显关系(P>0.05);②肺癌组织中p73 mRNA表达水平和表达率明显高于癌旁肺组织、远癌肺组织和肺良性病变组织(P<0.01);③组织中凋亡指数的升高和p73基因转录表达水平的增加呈显著的正相关(P<0.01).结论肺癌组织中存在细胞凋亡水平的升高和p73基因的过度转录表达.
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全脑缺血再灌注后神经元凋亡的时相和分布特征
目的探讨大鼠全脑缺血再灌注后神经元凋亡的时相和分布特征,为神经元损伤的早期干预和继发性脑损害的防治提供实验依据.方法建立大鼠全脑缺血模型,采用TTC染色、原位细胞凋亡检测(原位末端标记法,TUNEL)及AO/EB荧光比色法观察脑缺血再灌后海马、皮层凋亡发生的数量和分布,用荧光指示剂Fura-2 AM标记,检测脑海马细胞内游离钙的浓度.结果 TUNEL显示再灌注3 h海马部位即出现散在凋亡细胞,并向皮层区域扩展,24～48 h达高峰;坏死细胞迟于凋亡出现,弥散分布于凋亡细胞周围,再灌注48 h后坏死细胞增多,72 h多.AO/EB法显示海马、额叶和顶叶凋亡细胞总数分布在再灌注后24 h和72 h达高峰,并显著高于对照组(P＜0.05).TTC染色证实全脑缺血再灌注后不出现梗死灶,而是在海马及大脑皮层有弥散性坏死.胞内[Ca2+]i各时间点与对照相比匀显著升高(P＜0.01).结论全脑缺血再灌后受累神经元经历了由凋亡到死亡的过程,对缺血敏感的海马神经元首先受损,并向顶叶和额叶皮层扩展,细胞质内[Ca2+]i增加是主要原因.利用凋亡时间窗进行早期干预可能有益于保护和挽救凋亡前期神经元,减小继发性损害的严重程度.
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选择性COX-2抑制剂NS398干预对HIBD新生鼠脑细胞凋亡的影响
目的 研究新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)时应用选择性COX-2抑制剂NS398干预后不同时段脑原位细胞凋亡的变化.方法 于制备新生大鼠左脑的HIBD模型前30 min,腹腔注射NS398 20 mg/kg,同时设未注射组及假手术组对照,应用TUNEL染色方法及图像分析软件研究于HI后24 h、7 d脑皮层及海马TUNEL染色阳性细胞百分率变化.结果 假手术组组脑组织中偶见TUNEL染色阳性细胞;未注射组缺氧缺血(HI)后24 h TUNEL染色阳性细胞数较多,至HI后7d明显减少;NS398干预组染色阳性细胞数较未注射组明显减少.结论 应用选择性COX-2抑制剂NS398于HIBD新生鼠,可以有效减少HI后凋亡细胞,提示NS398对发育期脑组织缺氧缺血损伤存在保护作用.
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昆明山海棠碱对Jurkat淋巴瘤细胞株的细胞周期和凋亡时相的影响
目的探讨昆明山海棠(THH)碱对Jurkat T 淋巴瘤细胞的细胞毒性、细胞周期和凋亡时相特异性的影响,以了解THH碱诱导细胞凋亡的机制.方法台盼蓝染色法检测细胞生长和细胞活力;DNA染色法、TUNEL标记结合流式细胞术检测细胞周期和凋亡时相特异性.结果 THH碱能有效抑制Jurkat 细胞增殖、细胞活力下降,细胞在增殖周期中被阻滞于G1期.THH碱首先能诱导S、G2/M期细胞凋亡,同时能诱导G1期细胞凋亡.结论提示THH碱能抑制Jurkat细胞的DNA合成,抑制细胞增增殖,并可显著诱导各期相细胞发生凋亡.
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昆明山海棠碱诱导Jurkat淋巴瘤细胞核DNA链断裂和DNA片段化
目的探讨昆明山海棠碱对淋巴瘤细胞核DNA的影响,以了解THH碱诱导细胞凋亡的机制.方法 THH碱诱导Jurkat 细胞后,TUNEL荧光标记DNA链断裂,细胞DNA含量分析方法分析DNA片段化,均以流式细胞术检测.结果 THH碱能诱导Jurkat淋巴瘤细胞DNA链断裂,之后DNA发生片段化.结论提示在THH碱诱导Jurkat凋亡过程中,核DNA发生重要变化.
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maspin与肺癌相关性的研究
目的:探讨maspin与肺癌的相关性.方法:采用免疫组化技术检测maspin在肺癌及正常肺组织中的表达,TdT介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL法)检测细胞凋亡.结果:肺癌组maspin表达较对照组明显减弱,细胞凋亡亦显著减少,两者呈正相关.结论:maspin表达下调可能通过减少细胞凋亡导致肺癌发生.
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肠源性内毒素血症在拟阿尔茨海默病模型脑组织凋亡中的作用初探
[目的]通过检测拟阿尔茨海默病(Alzheimer s disease,AD)模型大鼠血浆中内毒素(Lipopolysaccharide,LPS)水平及脑组织细胞凋亡(apoptosis,programmed cell death,PCD)水平,揭示(Intestinal endotoxemia,IETM)在拟AD模型大鼠中对凋亡的影响,从而为进一步揭示IETM.在AD发生发展过程中的作用奠定基础.[方法]选用Wistar大鼠,腹腔注射D-半乳糖和AICl3连续90 d,制备拟AD模型.Morris水迷宫检测大鼠学习记忆水平,流式细胞仪和末端脱氧核糖转移酶介导的生物素化脱氧尿嘧啶缺刻标记技术(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL)检测脑细胞凋亡,鲎试剂法检测大鼠血浆LPS水平.[结果]拟AD模型组大鼠逃避潜伏期(25±9)s,明显长于空白对照组(12±5)S(P＜0.01);模型大鼠体内LPS、TNF-α、脑细胞凋亡率(PD)及TUNEL染色阳性细胞数均明显高于对照组(P＜0.01).[结论]拟AD模型大鼠体内LPS、TNF-α水平及脑细胞凋亡率明显升高,IETM可能是拟AD大鼠模型脑细胞凋亡的原因之一.
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Survivin与Smac在食管鳞状细胞癌中的表达及意义
目的 探讨抑凋亡蛋白Survivin与促凋亡蛋白Smac在食管鳞状细胞癌发病中的作用与关系.方法 收集35例食管鳞状细胞癌标本,取其食管癌组织,癌旁组织和正常组织,采用Tunel法与免疫组织化法分别测定食管癌组织,癌旁组织和正常组织中细胞凋亡及Survivin与smac表达情况.结果 凋亡指数(apoptosis index,AI)癌组织及癌旁组织明显小于正常组织.食管癌组织Survivin的表达高于癌旁组织及正常组织;Smac的表达明显低于癌旁组织及正常组织.Survivin与Smac的表达在食管癌组织中呈负相关,在癌旁组织和正常组织中均不相关.结论 Survivin与Smac可能通过负反馈调节或相互拮抗作用打破凋亡平衡,促进食管鳞状细胞癌的发生.
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高湿环境诱导大鼠肝脏细胞凋亡的实验研究
目的观察高湿环境下大鼠肝脏组织损伤及细胞凋亡情况，探讨高湿环境对大鼠肝脏的影响。方法32只SD大鼠随机分为两组，高湿20d组与对照组，每组16只大鼠。采用人工气候箱模拟高湿环境，条件设置为温度25℃、相对湿度（90%±2%）RH。高湿20d组大鼠每天置于气候箱中10h，其余时间与对照组饲养于相同环境，温度25℃，相对湿度（45%~50%）RH，时间为20d。动物模型制作完成后，取肝脏组织行免疫组化及Western实验观察两组肝脏细胞凋亡情况。结果高湿组Tunel法原位标记可观察到肝脏细胞凋亡，同时活化的Caspase-3酶表达显著升高。结论高湿环境可诱导大鼠肝脏细胞凋亡的发生，凋亡的关键酶Caspase-3在其中扮演了重要角色，为下一步研究高湿诱导细胞凋亡的具体机制提供了实验基础。
关键词： 高湿 细胞凋亡 TUNEL 半胱氨酸天冬氨酸酶-3 -
一种组织原位双重标记的方法
目的在同一张切片上,分别进行两种标记,两种显色系统进行显色.方法应用免疫组织化学S-P法检测结肠癌细胞Fasl表达,再用TUNEL法检测同一组织切片上细胞凋亡情况.结果同一组织切片Fasl阳性表达于癌细胞胞质和/或胞膜,凋亡表达于细胞核清晰可见.结论组织原位双重标记结果更为客观可靠.
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固定对用TUNEL技术原位检测细胞凋亡的影响
用TUNEL技术原位检测凋亡细胞对组织的处理方法较为敏感.本研究采用灌注固定及浸润固定处理的石蜡切片来比较固定处理对细胞凋亡检测的影响.结果显示成年大白兔睾丸(正常及输精管结扎术后的)内凋亡的生精细胞,在用4%的多聚甲醛先灌注固定然后浸润固定处理后可以检测到,仅用Bouin液浸润固定整个器官24小时的方法检测不到凋亡细胞.尽管其原因不清楚,但该结果可能提示TUNEL法对凋亡细胞检测的敏感度高度依赖于固定处理情况,故对凋亡细胞的阴性检测结果的解释应慎重.
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支气管哮喘大鼠心肌细胞凋亡研究
目的 探讨支气管哮喘心肌细胞损害的机制,为法医学实践中哮喘猝死案例的死因鉴别诊断提供形态学依据.方法 建立支气管哮喘模型.实验组分别予以肾上腺素、氨茶碱治疗,应用 HE、TUNEL 及流式细胞术,对各组大鼠心肌细胞凋亡的规律进行研究.结果 实验组心肌细胞的凋亡指数(PI)和凋亡率明显高于对照组(P<0.05),随哮喘时间延续,PI和凋亡率均明显增加,至第8周高.实验各组心肌细胞的凋亡依次为:肾上腺素组>肾上腺素加氨茶碱组>哮喘模型组>氨茶碱组.结论 哮喘促进心肌细胞凋亡机制的激活引起心肌细胞凋亡是哮喘心肌损害的分子病理机制中一个重要因素,哮喘心肌细胞凋亡与哮喘发作时间及某些哮喘治疗药物如β2 受体激动剂--肾上腺素的使用有一定关系.
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氢氧化钠抑制原位移植性肝癌生长机制研究
目的 探讨氢氧化钠溶液瘤内注射对原位肝癌的生长抑制作用,研究抵抗肝癌生长的临床机制.方法 获得稳定表达红色荧光蛋白DsRed的人肝癌细胞系SMMC-7721,进行不同浓度氢氧化钠溶液刺激,并使用原位末端标记法(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)检测细胞凋亡.建立裸鼠原位肝癌模型,于第7天进行不同浓度氢氧化钠溶液原位瘤内注射,利用小动物活体荧光成像技术观察肿瘤生长情况.利用免疫组织化学法检测残存肿瘤组织中VEGF表达,并使用TUNEL法检测瘤体内细胞凋亡.结果 氢氧化钠溶液刺激肝癌细胞后,显著增加细胞凋亡比例.成功建立裸鼠原位肝癌模型并进行氢氧化钠溶液注射.在荧光成像系统下,激发光波长570nm,发射波长610nm,于细胞接种后第21天观测到发红色荧光的肿瘤.取肝脏进行原位瘤体积测定,发现与生理盐水瘤内注射相比,氢氧化钠显著抑制了原位瘤生长并引起瘤组织坏死.氢氧化钠抑制了瘤体中VEGF的表达,并增加了TUNEL阳性细胞(即凋亡细胞)比例.结论 氢氧化钠瘤内注射有效抑制裸鼠原位肝癌生长,这可能是通过抗血管生成作用和诱导凋亡作用实现的.
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人参皂甙对兔缺血再灌注肾NO含量及细胞凋亡的影响
目的研究人参皂甙对免肾缺血再灌注损伤的保护作用.方法建立原位兔肾缺血再灌注损伤模型,分别测定正常组、缺血组、缺血再灌注组和不同剂量的人参皂甙组(15,30,60mg/kg)的下列指标:血清肌酐值、肾皮髓质病理改变和NO含量、流式细胞仪检测肾细胞周期、TUNEL法原位标记肾细胞凋亡并经Mias图象分析仪检测阳性目标数和积分光密度.结果30mg/kg体重人参皂甙组血清肌酐值明显低于再灌注组;人参皂甙各组肾组织病理损害均轻于再灌组;正常组肾皮髓质NO含量比值为1.73,缺血组肾髓质NO含量明显升高,皮髓质NO含量比值下降至0.57,再灌注组皮髓质NO含量较缺血组低,以髓质下降为明显,其皮髓质NO含量比值为0.94,人参皂甙各组皮质NO含量均增高,髓质NO含量均下降,皮髓质NO含量比值上升,其中以30mg/kg组的比值(1.57)接近正常值(1.73);细胞凋亡参与缺血再灌注损伤,凋亡细胞主要集中在肾皮质区.30mg/kg和60mg/kg的人参皂甙可明显抑制肾皮质细胞凋亡.缺血再灌注组肾细胞群的主体在GO/G1期,部分样品可见亚二倍体峰(亚Go峰或Ap峰),人参皂甙各组大多处在M期.结论合适剂量(30mg/kg体重)的人参皂甙具有保护缺血再灌注肾功能、减轻肾组织病理损害、提高肾皮质NO含量与髓质NO含量的比值、抑制肾皮质细胞凋亡等作用,未见明显的量效关系.
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电刺激大鼠小脑顶核对缺血-再灌注视网膜的保护作用实验研究
目的 探讨电刺激大鼠小脑顶核(cerebellar fastigial nucleus,CFN)对视网膜缺血-再灌注损伤的保护作用及其机制.方法 大鼠随机均分为三组,缺血-再灌注损伤组、缺血-再灌注治疗组和假手术组.用TUNEL试剂盒检测视网膜神经节细胞凋亡率；用免疫组织化学染色法检测视网膜细胞Bcl-2蛋白和Bax蛋白的表达.结果 缺血-再灌注损伤可使视网膜神经节细胞发生凋亡(P＜0.05),同时视网膜细胞Bcl-2蛋白表达逐渐减弱(P＜0.05),Bax蛋白表达逐渐增强(P＜0.05)；而使用电刺激小脑顶核的治疗组上述改变较轻(P＜0.05).结论 电刺激大鼠小脑顶核对视网膜缺血-再灌注损伤具有保护作用,其机制可能通过上调Bcl-2蛋白表达,下调Bax蛋白表达来减少视网膜细胞的凋亡.
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大鼠卵巢蒂扭转后颗粒细胞凋亡及相关蛋白表达
目的 探讨大鼠卵巢蒂扭转后不同时间颗粒细胞的凋亡及与Bax和Caspase-3蛋白表达的关系,用实验数据验证卵巢蒂扭转后保守性手术治疗的佳时间.方法 将20只Sprague-Dawley性成熟雌性大鼠按照随机设计原则分成4组,每组均为5只.此4组分为正常组,卵巢蒂扭转后24 h,48 h,72h组.取卵巢组织常规石蜡包埋,切片,HE染色,采用免疫组化(SP)法检测Bax和Caspase-3及(TUNEL)测定颗粒细胞凋亡.SPSS进行统计分析,P<0.05为差异有统计学意义.结果 SD性成熟雌性大鼠在卵巢扭转后,TUNEL检测细胞凋亡在第48 h达高峰,与对照组比较,在第24 h、48 h、72 h时均有统计学意义(P<0.05).实验组Bax的表达随扭转时间的增加而表达增加,扭转后第72 h达高峰.与对照组比较,实验组Bax的表达在卵巢扭转后第24 h、48 h、72 h均有统计学意义(P<0.05).Caspase-3蛋白在对照组几乎无表达,实验组Caspase-3的表达随扭转天数的增加而增加,扭转后第72小时达高峰.与对照组比较,实验组Caspase-3的表达在卵巢扭转后第24h、48 h、72 h均有统计学意义(P<0.05).Bax和Caspase-3蛋白在卵巢扭转后细胞凋亡的表达中呈正相关.结论 卵巢扭转后可诱导颗粒细胞发生凋亡,其机制与Bax和caspage-3的激活有关.同时根据TUNEL检测结果提示.卵巢扭转后,复位卵巢并保留卵巢的保守性手术治疗的佳时机是扭转48 h内,而且时间越早越好.
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大鼠胚胎心脏发育过程中凋亡及凋亡基因表达的检测
目的:检测大鼠胚胎心脏发育过程中凋亡及凋亡基因表达,进一步明确心脏发育的调控机制.方法:采用半定量RT-PCR、免疫组织化染色SABC法和TUNEL法对E11～E19 SD大鼠心脏凋亡细胞和p53mRNA、Bax蛋白表达进行测定.结果:p53和BAX在E11～E19表达均呈逐渐增强再减弱的趋势,表达的高峰位于E14.TUNEL染色结果显示,E11～E19均可见凋亡小体.E11时散在分布于心内外膜;E13主要分布于心尖;E14时表达强,主要分布于心房和心腔分隔处;E16后表达减弱,分布主要集中于心腔内壁.结论:大鼠心脏发育中后期均有凋亡存在;E14为凋亡表达高峰时期;p53和Bax在促进心肌细胞凋亡、心脏外形和心腔形成方面起到重要的作用.
