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EGFR单链抗体-力达霉素融合蛋白抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖与侵袭的研究
目的 研究EGFR单链抗体-力达霉素融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)对人乳腺癌MCF-7细胞增殖和侵袭的抑制作用,探讨其作用机制.方法 采用噻唑蓝(MTT)法测定ER(Fv-LDP-AE)对MCF-7细胞增殖的影响.流式细胞术、Hoechst 染色和Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞周期的变化以及细胞凋亡.Transwell实验测定ER(Fv-LDP-AE)对MCF-7细胞迁移和侵袭的影响.采用RT-PCR检测细胞EGFR mRNA的表达水平,Western blot分析ER(Fv-LDP-AE)对EGFR细胞信号通路的影响.明胶酶谱实验测定细胞基质金属蛋白酶(MMPs)的活性.结果 ER(Fv-LDP-AE)能显著抑制MCF-7细胞的体外增殖,其半数抑制浓度(IC50)为1.5 ×10-12 mol/L.ER(Fv-LDP-AE)可引起细胞周期G2/M期阻滞,诱导细胞凋亡,抑制细胞的迁移和侵袭,阻碍EGFR的表达,干扰EGFR细胞信号通路,降低MMPs的活性.结论 ER(Fv-LDP-AE)通过抑制EGFR及其细胞信号通路、干扰细胞周期循环和诱导细胞凋亡,抑制乳腺癌MCF-7细胞的体外增殖,通过降低迁移能力和调节MMPs活性,阻碍肿瘤细胞的侵袭转移.
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抗乳铁蛋白单链抗体制备及鉴定
目的 制备特异性的可溶性抗乳铁蛋白单链抗体.方法 用固相化的乳铁蛋白从天然噬菌体抗体库筛选出抗乳铁蛋白的单链抗体克隆,转化至大肠杆菌HB2151中进行可溶性表达.表达产物以镍离子亲和层析法纯化,并进一步鉴定其纯度、活性等.结果 成功筛选并表达了抗乳铁蛋白的单链抗体,该抗体能与乳铁蛋白特异性结合,而与转铁蛋白、溶菌酶、小牛血清白蛋白无交叉反应.结论 建立了一种抗乳铁蛋白单链抗体的有效制备途径,为其进一步临床应用的研究奠定了基础.
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阿尔茨海默病Aβ40人单链抗体在毕赤酵母的表达
目的 重组表达抗Aβ40的人单链抗体,为被动免疫治疗阿尔茨海默疾病提供研究材料.方法 将从人噬菌体单链抗体文库中筛选获得的抗Aβ40人单链抗体基因,突变BamHI酶切位点,克隆连接到T载体,经过PCR和酶切鉴定.EcoRI和Notl双酶切pT-scFvAβ40质粒,连接到经过同样酶切的pPIC9K载体构建pPIC9K-scFvAβ40质粒,经过基因测序验证.线性化pPIC9K-scFvAβ40,转化GS115毕赤酵母,经0.5%甲醇诱导表达抗Aβ40的人单链抗体.结果 基因测序证实pPIC9K-scFvAβ40序列正确,转化GS115获得重组菌株.经过0.5%甲醇诱导,重组菌株分泌表达分子质量大小约为33kD的蛋白质.结论 成功构建pPIC9K-scFvAβ40质粒,Aβ40的人单链抗体在毕赤酵母系统得以重组表达.
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抗CD44抗体单链抗体构建及表达
目的构建抗CD44抗体的单链抗体(anti-CD44-ScFv),为进一步应用基因工程抗体研究打下基础.方法从分泌抗CD44单克隆抗体的杂交瘤细胞系HII44a中提取总RNA,经RT-PCR分离获得了轻、重链可变区(VL、VH)基因,用连接肽将其构建成具有VL-Linker-VH结构的单链抗体基因,并将构建的单链抗体基因克隆到分泌型蛋白表达载体PET22b(+)中进行表达.结果经测序表明,VH、VL及Linker的序列正确.ScFv在大肠杆菌中的表达量约占菌体总蛋白的16%.能够特异性与CD44抗原结合.结论成功构建抗CD44抗体单链抗体,为进一步制备基因工程抗体奠定了基础.
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腺相关病毒介导β淀粉样肽单链抗体对动物阿尔茨海默病的治疗效果
目的 观察携带β淀粉样肽单链抗体基因的腺相关病毒对阿尔茨海默病动物模型的治疗效果.方法 给突变淀粉样蛋白前体转基因阿尔茨海默病模型小鼠腿部肌肉注射携带 AB 单链抗体基因的腺相关病毒,在药物注射前和注射后3、7、10个月用 Morris 水迷宫测定潜伏期,并在药物注射后 10 个月取大脑做组织切片,行免疫组织化学染色,观察淀粉样斑块在海马的沉积.结果 注射基因治疗药物后3个月,阿尔茨海默病模型小鼠的学习和记忆能力明显改善,注射基因治疗药物后 10 个月,模型小鼠海马淀粉样斑块的沉积减少.结论 肌肉注射携带 AB 单链抗体基因的腺相关病毒对阿尔茨海默病模型有治疗作用.
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阿尔茨海默病Aβ人抗体可变区片段基因的克隆和表达
目的筛选出β淀粉样蛋白40(Aβ40)的人源抗体单链可变区片段,克隆单链抗体的基因并在原核生物大肠杆菌表达,为阿尔茨海默病的诊断和治疗开辟新的途径.方法先将Aβ40包被在免疫反应板上,后用来自正常人外周血淋巴细胞的单链抗体文库结合.经过5轮的生物淘金法筛选,从后一轮噬菌体感染的大肠杆菌TG1中随机挑选55个克隆进行ELISA测试,筛选出Aβ40特异的单链抗体并对其进行基因测序.将人源抗体单链可变区片段基因克隆到原核表达载体pGEX-6P-1上,转化大肠杆菌BL21表达谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合的单链抗体.结果ELISA测试表明,55个克隆中有33个克隆能结合Aβ40,Aβ40对10个克隆的竞争抑制率达到50%以上,而其中5个克隆的抗原结合表位在Aβ40的氮基端1～16个氨基酸之间.DNA测序结果发现,Aβ40单链抗体基因由768 bp组成,推导得到的氨基酸序列具有典型的抗体可变区结构.将单链抗体基因克隆到原核表达系统中诱导表达,得到相对分子质量为55 000的GST融合抗体表达产物.结论利用非免疫途径筛选出阿尔茨海默病发病中起关键神经元毒性作用的Aβ40的人源抗体单链可变区片段,为该抗体的表达和临床应用打下了基础.
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引导选择抗细胞表面分子单链抗体
目的用引导选择方法从抗KGla细胞的噬菌体展示抗体库中分离单链抗体.方法首先用KGla细胞吸附法富集抗体库3轮或未富集,再分别用抗CD34单克隆抗体为引导分子进行引导选择,分离单克隆后用免疫荧光和流式细胞术鉴别其细胞结合特异性.酶联免疫吸附法分析部分克隆与CD34抗原的结合,并对10个阳性克隆进行DNA序列分析.用一级结构不同的单链抗体作免疫印迹,鉴别其抗原分子量.结果从144个经3轮富集和引导选择的单菌落中挑选出100个阳性单克隆,从96个未经富集的文库中引导选择出2个阳性克隆.102个阳性克隆中47个可识别KGla、HL60、U937、和CEM细胞(KGla+、HL60+、U937+、CEM+),55个只识别KGla细胞(KGla+、HL60-、U937-、CEM-).其中28个只识别KGla细胞的单克隆经ELISA检测均不结合CD34抗原.10个阳性克隆的DNA序列分析显示来自4种不同克隆,所结合的抗原显示不同的分子量.结论从抗KGla单链抗体库分出102个能识别造血干细胞和祖细胞的阳性克隆,引导选择在改进筛选效率方面具有优越性.
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阿尔茨海默病β淀粉样肽40人单链抗体的生物活性
目的 测定重组表达的抗β淀粉样肽(Aβ)40的人单链抗体的生物活性.方法 通过基因重组表达方式获得抗Aβ40人单链抗体,应用常规ELISA和竞争性ELISA鉴定抗Aβ40人单链抗体的抗原结合活性,以人成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞为模型检测抗Aβ40人单链抗体的神经元保护作用.结果 重组表达的抗Aβ40的人单链抗体主要位于细菌不溶性内涵物中,经过尿素溶解和金属亲和层析纯化后具有结合Aβ40或Aβ42的活性.与Aβ42组相比,Aβ42加等摩尔抗体组可显著提高SH-SY5Y细胞的存活率(P＜0.05).与Aβ40组相比,Aβ40加等摩尔抗体组亦显著提高SH-SY5Y细胞的存活率(P＜0.01).结论 从大肠杆菌系统中重组表达的抗Aβ40人单链抗体可以部分对抗β淀粉样肽的神经毒性.
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Aβ单链抗体基因腺相关病毒载体的构建
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)的发生、发展和β淀粉样肽(amyloid β peptide, Aβ)在大脑组织的过载和神经毒性密切相关~([1]).动物实验和临床测试结果均表明Aβ疫苗免疫接种或Aβ抗体的外周注射有助于清除大脑组织内过载的Aβ~([2-3]).
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肝癌特异性启动子调控的双靶位慢病毒载体的构建、鉴定及其在肝癌基因治疗中的应用
目的 探讨survivin-CMV特异性启动子调控的双靶点慢病毒对肝癌细胞生长的影响.方法 RT-PCR扩增anti-AFP-scFv,测序鉴定,双酶切连接,获得pMD2G-anti-AFP-scFv质粒.针对已经筛选确定的IGFIR基因干扰有效序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与质粒pPRIME连接得到pPRIME-miR30-shRNA-IGFlR质粒.RT-PCR扩增survivin-CMV肝癌特异性启动子,测序鉴定,与双酶切的质粒pPRIME-miR30-shRNA-IGFlR连接,得到质粒sur-CMV-pPRIME-miR30-shRNA-IGFIR.用.ur-CMV-pPRIME-miR30-shRNA-IGFIR,psPAX2,pMD2G-anti-AFP-scFv共转染293T细胞,经过病毒空斑纯化,包装成慢病毒,测定病毒滴度.RT-PCR、Westemblot检测IGFIR表达,竟争抑制实验检测抗人AFP单链抗体活性.CCK-8法检测细胞生长.结果 成功构建survivin-CMV肝癌特异性启动子调控的慢病毒AFP-sur-CMV-PRIME-miR30-shRNA-IGFIR;滴度为4.58×10～9PFU/mL;AFP-sur-CMV-PRIME-miR30-shRNA-IGFIR抑制了肝癌细胞IGFlR表达,竞争实验显示抗人AFP单链抗体的基因高效表达,该慢病毒抑制肝癌细胞的生长.结论 本次实验构建的慢病毒载体具有良好的靶向性,为肝癌生物治疗奠定了理论基础,提供了新的思路.
关键词： RNA干扰 单链抗体 人胰岛素样生长因子1类受体 慢病毒 -
单链抗体-包膜蛋白嵌合型单嗜性逆转录病毒构建及靶向感染肿瘤细胞的研究
目的将单链抗体基因插入单嗜性逆转录病毒胞膜蛋白，以构建能靶向感染肿瘤细胞的逆转录病毒载体。方法 构建单链抗体融合表达质粒PET20b-scFv，通过酶联免疫分析，Western blot检测基因工程单链抗体的抗原结合活性。利用PCR定点突变技术，在野生型MoMulv胞膜蛋白上的SU亚单位氨基末端产生合适的酶切位点，插入体外构建，证实具有抗原亲合活性的抗人脑胶质瘤细胞膜抗原的单链抗体基因，并构建利用CMV启动子高效表达胞膜蛋白-单链抗体融合基因的表达质粒，转染Ψ2包装细胞后，以lac-z为报告基因，包装出重组逆转录病毒，进行病毒结合实验，感染实验。结果 酶联免疫分析，Western blot 结果证实基因工程单链抗体能与肿瘤细胞表面相应抗原结合，病毒结合实验，感染实验，结果证明所构建嵌合型逆转录病毒能改变其嗜性，由仅感染鼠细胞到特异性感染人脑胶质瘤细胞，且这种作用能为特异性单克隆抗体阻断。结论 利用单链抗体修饰单嗜性逆转录病毒胞膜蛋白的SU亚单位能达到选择性感染肿瘤细胞的目的。
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SSA表位在原发性干燥综合征患者唾液腺中的表达
目的 探讨60 000相对分子质量SSA表位差异性表达与原发性干燥综合征(pSS)患者唾液腺(MSG)受累的相关性.方法 利用噬菌体抗体展示技术筛选并可溶性表达针对3个SSA抗原表位(P1:480-494,P2:310-323和P3:230-241)特异性单克隆单链抗体(ScFv McAb),免疫组化法(IH)检测不同表位在pSS患者MSG的表达情况,并判断表达程度与MSG炎症是否存在相关性.结果 pSS MSG活检标本P1～P3表位的均有表达,以腺管、泌管上皮细胞胞质和胞膜着色为主.P1表位表达强度高于P2和P3表位(x2=12.94,P＜0.01),且仅P1表位表达强度与MSG的炎性浸润程度呈正相关关系(t=2.27,P＜0.05).结论 SSA抗原表位在MSG组织异位表达于上皮细胞的细胞膜,从而可能打破免疫耐受,诱导机体产生致病性抗体.P1表位在MSG膜高表达,而且仅P1与MSG炎症存在正相关关系,提示P1表位可能是引发pSS自身免疫应答的关键表位.
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抗前列腺癌/抗CD3双特异性单链抗体的构建及表达
目的构建并表达抗前列腺癌/抗人CD 3双特异性单链抗体,观察其生物学活性及临床意义.方法利用PCR方法及分子生物学基因克隆技术,构建抗前列腺癌/抗人CD 3双特异性单链抗体融合基因,测序正确后,利用EcoR I 和Hind Ⅲ酶切位点,将融合基因亚克隆入真核表达载体进行表达,表达产物纯化后,利用流式细胞仪进行生物学活性测定.结果经酶切、测序分析证实插入的基因片段大小为1.5 kb,序列与设计完全一致;SDS-PAGE和Western印迹实验证明:表达产物分泌于细胞培养上清,相对分子质量为61 000;流式细胞仪结果显示:双特异性单链抗体与PBMC和PC-3细胞的阳性结合率分别为54.1%和53.7%.结论抗前列腺癌/抗人CD 3双特异性单链抗体具有较好的生物学活性,为进一步的体内实验奠定了基础.
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单链抗体技术及其在药用植物研究中的应用
抗原刺激动物免疫系统产生抗体,抗体识别抗原的部位在其重链和轻链的可变区(variable region).如果将抗体的可变区(VH和VL)通过弹性多肽接头(peptide linker)稳定地连接在一起,即为单链抗体(single chain fragments variable,scFv).scFv大小仅为完整抗体的1/6,但其完全保持了抗体的抗原特异性及抗原的结合能力,同时由于为单链,在大肠杆菌或植物体内等容易表达,无须组装即能保持活性.在植物研究领域,其可用于植物病理诊断、植物生物活性成分的检测、定量分析与分离精制;而将单链抗体基因转入植物细胞,更可使转基因植物获得诸如增强对病毒、除草剂等的抗性,体内生理活性物质增加,次生代谢产物量提高等新的特性.特别是通过转入单链抗体基因,提高药用植物中具生物活性的次生代谢产物量的技术,可望发展成为一种新的分子育种方法,可以在不需要明了目标成分的生物合成途径的情况下,提高其产量.
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抗人纤维蛋白噬菌体单链抗体库的构建和鉴定
目的 应用噬菌体展示技术构建抗人纤维蛋白单链抗体(scFv)文库,筛选高亲和力抗人纤维蛋白scFv并进行鉴定.方法 利用人纤维蛋白免疫小鼠,分别扩增小鼠VH和VL基因,经重叠延伸聚合酶链反应(PCR)将VH和VL基因拼接成scFv基因,SfiⅠ/NotⅠ双酶切克隆人pCANTAB5E噬菌粒载体,转化E.coli TG1构建成库,采用人纤维蛋白原对抗体库进行负筛选,人纤维蛋白进行正筛选,酶联免疫吸附分析(ELISA)检测阳性克隆的抗原特异性并进行测序分析.结果 构建了库容为8.7 × 106的抗人纤维蛋白 scFv库,ELISA测定显示scFv具有较高的抗原特异性；抗人纤维蛋白scFv基因序列长732 bp,编码244个氨基酸,VH和VL基因均有明确的3个互补决定区和4个骨架区.结论 成功构建了抗人纤维蛋白scFv文库,并筛选到高亲和力的抗人纤维蛋白scFv,为新型血栓显像剂的开发奠定了实验基础.
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人源性抗乳腺癌Her-2/neu噬菌体单链抗体库构建
目的 构建乳腺癌患者抗Her-2/neu全人源性噬菌体单链抗体可变区(ScFv)文库,筛选抗Her-2/neu单链抗体.方法 收集40例乳腺癌患者前哨淋巴结(SLN),提取总RNA,反转录为cDNA作模板,在目前常用的引物基础上重新设计可变区的引物,用PCR扩增全套抗体可变区,构建T载体库.并改造pCANTAB-5E构建了pCANTAB-Linker.将T载体库酶切连接人pCANTAB-Linker构建出scFv文库.后构建噬菌体单链抗体库并进行初级筛选.结果 成功改良ScFv文库的构建方法.初步得到12株对人乳腺癌组织有高亲和力的Her-2/neu单链抗体.结论 改良了ScFv文库的构建方法,可以获得较大库容量的单链抗体库,并从中筛选到人源性抗Her-2/neu单链抗体.
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乳腺癌单链抗体制备及其在荷人乳腺癌裸鼠中的放免显像
目的:制备抗乳腺癌单链抗体,用于荷瘤裸鼠的放免显像研究.方法:提取乳腺癌膜抗原,制备抗乳腺癌单克隆抗体M4G3,用Pharmacia噬菌体单链抗体制备系统得到可溶性具有抗乳腺癌活性的ScFv抗体,利用环DTPA法标记核素99mTc,进行体外培养的乳腺癌细胞系MCF-7和荷瘤小鼠体内定位显像.结果:免疫组化显示单链抗体与乳腺癌膜抗原有较强的亲和力,并在体外培养的乳腺癌细胞及荷瘤小鼠体内显像成功,且在抗体注射第3～5天显像清晰.结论:提示M4G3的ScFv可在乳腺癌的放射免疫显像和定位诊断研究中发挥作用,值得进一步研究.
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全人源食管癌噬菌体单链抗体库的筛选及特异性鉴定
目的:我们应用噬茵体抗体库技术构建了食管癌相关的人源单链抗体文库,本文目的在于对该抗体库进行鉴定,筛选食管癌抗体,同时对抗体的活性进行检测.方法:PCR鉴定TGl中食管癌单链抗体scFv的插入率;1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定Sfi I和Not I双酶切质粒的结果;先以人正常食管上皮细胞吸附后再以食管癌细胞Eca109为抗原对所建抗体库进行4轮的亲和筛选;将阳性重组噬茵体克隆感染Ecoli HB2151进行可溶性抗体表达及经亲和柱层析纯化;用SDS-PAGE测定该抗体的相对分子量;用Western blot鉴定该抗体;用ELISA法、免疫组化法鉴定该抗体与人食管癌细胞的结合的特异性.结果:scFv基因插入率为91.7%;酶切后检测到目的基因片段.在亲和筛选过程中,食管癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮得到提高,第4轮为第1轮的141倍;SDS-PAGE与Western blot结果显示抗体的相对分子量为左右和30kd条带染色;在Ecoli HB2151中实现了单链抗体的可溶性表达.免疫组织化学结果提示可溶性抗体仅染食管癌组织,而肝癌组织和胃癌组织不染色.免疫细胞化学结果表明此可溶性抗体可使Eca109细胞染色.ELISA测定结果显示可溶性抗体具有较高的免疫活性,能与Eca109细胞结合,而不与胃癌BGC-823和NHEEC结合.结论:利用噬茵体抗体库技术的阴性、阳性筛选得到了食管癌噬菌体单链抗体,且筛选后的抗体片段与人食管癌细胞有特异性的结合活性.
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单链抗体研究进展及其在医学中的应用
自英国和日本学者发现白喉抗毒素以来,人们对于抗体的研究经历了多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体3个阶段,其中单链抗体由于具有相对分子质量小、穿透力强、血中半衰期短、抗原结合特异性强、免疫原性弱和可在原核细胞中表达等特点而倍受人们关注.
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单链抗体的研究进展
抗体技术由细胞工程抗体(杂交瘤-单克隆抗体)发展到基因工程抗体,尤其是抗体库技术的出现,将抗体工程发展到了一个新阶段.本文从抗体库技术等方面介绍单链抗体(single-chain Fv antibody,scFv)的进展情况.
