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二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体的构建及原核表达
目的 构建二硫键稳定的抗HIV-1gp41单链抗体(dsFv)基因原核表达载体,并进行表达和鉴定.方法 采用PCR定点突变的方法,构建含二硫键稳定的抗HIV-1gp41单链抗体突变基因质粒pUC57-d41,BamHI和HindⅢ双酶切后,定向插入pET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用SDS-PAGE、Western blot鉴定表达产物.对目的 蛋白进行纯化和复性,并进行抗原结合活性及相对稳定性检测.结果 重组载体pET-d41经酶切鉴定,证实构建正确.表达产物相对分子质量约为28 000,与理论预期值完全相符.目的 蛋白高表达量可占菌体总蛋白的45.48%.经Ni-NTA亲和层析法纯化并复性后,蛋白纯度达95%以上,抗HIC-1gp41 dsFv具有抗原结合活性,稳定性优于scFv.结论 已成功构建了二硫键稳定的抗HIV-1gp41单链抗体(dsFv)基因原核表达载体,并获得表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.
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人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库的构建及筛选
目的 构建人源抗狂犬病病毒单链抗体(Single-chain fragment variable,scFv)噬菌体抗体库,并进行筛选.方法 以接种过狂犬病疫苗的21份高效价的健康人外周血为原料,提取淋巴细胞总RNA,PCR扩增VH、Vκ、Vλ基因,重叠延伸PCR扩增获得scFv基因,克隆入噬菌粒pS100,电转化E.coli TG1,建立scFv初级抗体库,并进行基因序列分析及鉴定.以灭活的狂犬病病毒为抗原,进行3轮scFv噬菌体抗体库的富集筛选,随机挑取单克隆,制备噬菌体抗体颗粒,并进行ELISA分析,阳性克隆进行序列分析,采用快速荧光灶抑制试验(Rapid fluorescent facus inhibition test,RFFIT)检测噬菌体抗体颗粒的中和活性.结果 获得了库容为1.7×108的人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,该抗体库具有较好的序列正确率和多样性,经3轮筛选后,ELISA分析显示,共获得24个序列各不相同的针对狂犬病病毒的阳性克隆,对其中7个克隆的噬菌体抗体颗粒进行RFFIT检测,均具有中和活性.结论 已成功构建了人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,并建立了筛选方法.
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抗肿瘤坏死因子-α单链抗体在大肠杆菌中的表达及表达条件的优化
目的 构建抗肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)单链抗体(Single chain fragment variable,scFv)的原核高效表达体系,并优化表达条件.方法 在引物中添加编码6×His的核苷酸片段,使目的蛋白C-末端带有6×His标签.从质粒pCANTAB 5E-scFv中PCR扩增scFv基因,连接至pBV220载体,连接产物分别转化至E.coli BL21(DE3)和DH5α中,42℃诱导表达,并对诱导时间、培养基pH值和类型进行优化,Western blot分析表达产物的反应原性.结果 PCR扩增出的scFv基因片段长度约770 bp,且序列正确；重组表达质粒pBV220-scFv经酶切鉴定证明构建正确；在E.coli BL21( DE3)中可获得表达,在E.coli DH5α中不表达；表达的重组scFv相对分子质量约为28 000,以包涵体形式存在于胞浆中,表达量约占菌体总蛋白的15％,且可与抗His-Tag抗体发生特异性反应；工程菌的佳诱导表达条件为:以E.coli BL21 (DE3)为宿主菌,在pH7.4的LB培养基中,42℃诱导5h.结论 将scFv的表达载体更换为pBV220,可提高scFv的表达量,在优化表达条件下,scFv的表达水平进一步提高.
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人源核糖体展示单链抗体库的构建
目的 构建人源核糖体展示单链抗体(scFV)库.方法 从人外周血单个核细胞中提取总RNA,反转录为cDNA,以此为模板,设计多对具有简并性特点的引物,PCR扩增人免疫球蛋白重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,在其两端加上核糖体展示所需元件,并通过重叠PCR法将VH和vL经(Gly4Ser)3短肽连接成单链抗体,构建核糖体展示库.结果 利用不同引物进行PCR时,绝大多数引物能扩增出300～400 bp的VH和VL片段;通过大引物扩增成功加上了核糖体展示所需元件,重叠PCR体外连接成约900 bp大小的scFv基因,大量扩增得到核糖体展示库.结论 已成功构建了人源核糖体展示scFv库,为人源抗体药物的开发奠定了基础.
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大容量人源核糖体展示单链抗体文库的构建
目的 构建大容量、多样性的人源核糖体展示(Ribosome display,RD)单链抗体(Singe chain Fv segment,scFv)库.方法 收集20名健康献血者的新鲜外周血,分离淋巴细胞,提取细胞总RNA；设计兼并引物,利用RT-PCR分别扩增人抗体的VH-linker、Vκ、Vλ及Cκ基因；采用重叠PCR(SOE-PCR)技术,构建VH-linker-Vκ和VH-linker-Vλ-Cκ单链抗体库；将VH-linker-Vκ和VH-linker-Vλ-Cκ等量混合后,与pMD19-T载体连接,并转化感受态E.coli DH5α,对所构建的scFv库进行菌落PCR和测序分析.结果 构建的核糖体展示单链抗体库重组率较高,转化产物经菌落PCR鉴定,均可见约1 000 bp的scFv基因片段,库容量为2.06×1013.经分析该抗体库单链抗体序列均完整,内部无终止密码子,可变区序列无一重复,多样性良好,均具有完整的体外核糖体展示框架.结论 已成功构建了大容量、多样性好的人源核糖体展示单链抗体库,为进一步筛选高特异性、高亲和力的人源抗体奠定了基础.
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抗犬瘟热病毒噬菌体抗体库的构建
目的 构建抗犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)T7噬菌体单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)库.方法 用灭活CDV经皮下注射免疫犬,共3次,每次间隔2周,第3次免疫后2周采集犬外周血,分离淋巴细胞,提取淋巴细胞总RNA,RT-PCR分别扩增犬IgG重链(heavy chain,VH)和轻链(light chain,VL)基因片段,通过SOE-PCR法将VH和VL用一段linker连接组装成scFv基因,经EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切后,连接到表达载体T7 Select 10-3b上,用包装蛋白包装后,以大肠埃希菌BLT5403为宿主菌进行增殖,随机挑取50个噬菌斑,进行PCR鉴定,并测定文库滴度.结果 扩增的VH和VL基因大小均与预期相符,测序结果经blast比对,扩增的片段与犬IgG的VH和VL序列匹配率达90％以上；所构建的原始文库滴度为3.2×107 pfu/ml,扩增后的文库滴度为5.0×108 pfu/ml.对随机挑取的50个噬菌斑进行PCR鉴定,重组率为94％.结论 成功构建了抗CDV的T7噬菌体抗体库,为犬科动物犬瘟热的防治提供了参考.
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抗白念珠菌人源性单链抗体库的构建及筛选
目的 构建多样性良好的抗白念珠菌人源性单链抗体库,筛选抗白念珠菌特异性的噬菌体抗体.方法 从20份人外周血淋巴细胞(包括正常成年人5份、新生儿5份和白念珠菌感染恢复期患者10份)中提取总RNA,反转录为cDNA,PCR扩增人抗体重链(V_H)和轻链(V_L)可变区基因,以重叠延伸PCR法将V_H和V_L拼接成scFv基因,克隆人噬菌粒载体pCANTAB-5E中,电转化大肠杆菌XLI-Blue,构建人源抗白念珠菌天然噬菌体抗体库,并从中筛选阳性克隆抗体.结果 构建的人源性抗白念珠菌天然噬菌体抗体库库容为2.8 ×10~9.多样性良好.共筛选出18个阳性克隆.结论 已成功构建了1个多样性良好的抗白念珠菌人源性噬菌体抗体库,为筛选有效治疗白念珠菌和耐药性白念珠菌感染的药物提供了条件.
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抗转铁蛋白受体鼠源性单链抗体基因的构建、表达及初步鉴定
目的利用基因工程技术将鼠源性单克隆抗体WuT9改造成单链抗体.方法从分泌抗CD71单克隆抗体的杂交瘤细胞WuT9中提取总RNA,采用Oligod T为逆转录引物,逆转录合成eDNA第一链,然后分别采用VL和VH框架区的PCR引物,扩增VH(重链可变区)和VL(轻链可变区)DNA片段,利用事先合成的存在于VL下游引物和VH上游引物的部分人工连接子重叠互补序列,将VL和VH的PCR回收产物进行部分重叠PCR(SOE),形成单链抗体基因.后将此基因重组进表达载体pBAD/gⅢ/C中,经L-arabinose(左旋阿拉伯糖)诱导表达并初步鉴定.结果构建出700bp左右的单链基因,并获得阳性重组表达载体克隆,表达产物为相对分子质量27000左右的蛋白分子.结论经因特网查询表明,单链抗体基因重链部分属于小鼠H链可变区Ⅰ A亚组;轻链属于小鼠k轻链可变区Ⅱ亚组,此单链抗体基因的表达产物具有一定的特异结合活性.本研究为抗CD71单链抗体的临床应用打下了基础.
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人源抗狂犬病毒G蛋白单链抗体的表达和鉴定
目的对人源抗狂犬病毒G蛋白单链抗体A12进行可溶性表达及特异性和中和活性检测.方法表达人源单链抗体A12的菌株,经诱导后进行SDS-PAGE及Western blot检测,用流式细胞仪(FACS)检测表达狂犬病毒G蛋白的重组痘苗病毒感染Vero细胞的能力,用快速荧光灶抑制实验(RFFIT)检测表达产物的中和活性.结果Western blot显示表达产物与抗C-myc抗体在相对分子质量约30 000处出现强阳性表达带.FACS表明A12与表达狂犬病毒G蛋白的重组痘苗病毒感染的Vero细胞出现特异性反应.RFFIT表明,A12 ScFv在1:27倍稀释时能完全中和病毒.结论已获得了A12可溶性表达,表达产物能与狂犬病毒G蛋白特异性结合,并对狂犬病毒具有一定的中和活性.
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全人源单链抗体库噬菌体展示技术的建立
目的 建立全人源单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)库的噬菌体展示技术.方法 采集100名健康老年志愿者的外周血,5 mL/人,混合所有全血并分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),抽提RNA,反转录合成cDNA,以其为模板,IgG类抗体基因为引物,PCR扩增获得重链可变区片段(VH)和轻链可变区片段(VL),然后以VH和VL为模板,经重叠PCR获得scFv,经sfi Ⅰ酶切,插入pComb3xss载体,电转后获得一定容量的抗体库;加入辅助噬菌体VCSM 13过夜培养,上清液经PEG-NaC1沉淀,无菌PBS重悬噬菌体沉淀,即完成噬菌体抗体库的构建;采用Phage ELISA法进行噬菌体单克隆抗体的特异性鉴定.结果 成功构建了库容为2.6× 109的噬菌体抗体库;随机挑选的100个噬菌体单克隆中共筛选到2个疑似H1N1株HA抗原的噬菌体抗体.结论 成功构建了噬菌体抗体库的技术平台,可用于各类功能抗体的筛选.
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应用蛋白质工程法制备含硒单链抗体酶
目的制备一种具有谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性的含硒单链抗体酶.方法利用RT-PCR方法从杂交瘤细胞株2F3中扩增出单克隆抗体重链可变区和轻链可变区基因.经DNA序列测定后,构建成表达载体pTMF-scFv,经过金属螯合层析纯化、复性和化学诱变,得到含硒单链抗体酶.结果将重组质粒pTMF-scFv分别转化入大肠杆菌JM109(DE3)、BL21(DE3)和BL21(coden plus),表达目的蛋白分别占菌体总蛋白的5%～10%、15%～20%和25%～30%.该重组蛋白以包涵体形式存在,相对分子质量为30000.其GPX活性为3 400U/μmol,接近天然酶水平.结论为工业化制备含硒单链抗体酶奠定基础.
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抗HIV-1gp120单链抗体的原核表达与初步纯化
目的在原核细胞表达抗HIV-1gp120单链抗体基因,纯化后检测其活性.方法将单链抗体基因插入pET28原核表达载体进行诱导表达,对包涵体进行变性复性处理后,利用Ni-NTA金属螯合层析柱对表达的蛋白进行初步纯化,纯化后的单链抗体与gp120标准抗原膜条反应.结果表达产物主要以包涵体形式存在,高表达量占菌体总蛋白量的51%,金属螯合层析一步纯化后纯度超过85%.纯化后的单链抗体可以特异地识别gp120标准抗原.结论在原核细胞表达的单链抗体,复性纯化后具有生物学活性.
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单链抗体及其医学应用
基因工程抗体的研究,使人们可以通过基因重组技术获得各种新型的小分子抗体,其中单链抗体具有相对分子质量低、穿透力强、血中半衰期短、抗原结合特异性强、异原性低、容易基因操作、能在原核细胞中表达、易于大量生产等优点,并且可以用化学偶联或基因工程方法构建成与其他靶分子连接的融合蛋白,有利于药物、毒素、放射性同位素导向治疗,因此具有很大的医学应用价值.本文就单链抗体的研究进展及其医学应用作一综述.
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抗狂犬病病毒糖蛋白单链抗体Fv57多克隆抗体的制备
目的 通过凝胶免疫法制备抗狂犬病病毒糖蛋白单链抗体Fv57的多克隆抗体.方法 诱导表达Fv57蛋白,SDS-PAGE分离后,分别以KCI和考马斯亮蓝R-250染色,切取含目的蛋白的凝胶,经背部皮下免疫家兔,共免疫4次.第4次免疫后1周采血,分离血清,Western blot分析Fv57蛋白多克隆抗体的特异性,ELISA检测抗体效价.结果 表达的Fv57蛋白相对分子质量约26000;两种染色方法制备的多抗均能与Fv57蛋白特异性结合,与考马斯亮蓝R-250染色法相比,KCI法的非特异性杂带较少,结合效果更好；两种方法制备的多抗效价均在1∶10000以上.结论 已成功采用凝胶免疫法制备了Fv57多克隆抗体,为检测Fv57与狂犬病病毒糖蛋白的特异性结合奠定了基础.
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与A549细胞相关的旋毛虫抗原蛋白7TR单链抗体的筛选
目的 筛选可与A549细胞相互作用的抗旋毛虫7TR单链抗体.方法 PCR法克隆旋毛虫7TR基因,连接至表达载体pET-32a,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导后,将表达的7TR蛋白进行复性及亲合层析纯化;以纯化后的旋毛虫7TR蛋白为抗原,筛选Tomlinson(I+J)人源噬菌体单链抗体库,筛选并纯化阳性抗体,免疫荧光试验检测抗体与A549细胞的结合活性.结果 重组表达质粒pET-32a-7TR经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的旋毛虫7TR蛋白相对分子质量约50 000.共获得2株稳定分泌抗旋毛虫7TR蛋白单链抗体的E.coli HB2151菌株,命名为4C7和8G5;8G5可与重组7TR蛋白发生特异性结合,具有良好的反应原性,也可与A549细胞发生特异性结合.结论 筛选出了与A549细胞具有结合活性的抗7TR单链抗体,为后续的临床应用奠定了基础.
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从大容量噬菌体抗体库获取人源性抗角蛋白抗体ScFv及Diabody的构建
目的 从大容量噬菌体抗体库筛选人源性抗角蛋白抗体,并构建双体抗体(Diabodv). 方法以同相化的角蛋白对构建的大容量噬菌体抗体库进行筛选,经3～4轮筛选后,挑取克隆,ELISA法鉴定其特异性,并对部分抗角蛋白阳性抗体克隆基因进行DNA序列分析.选取活性好的克隆基因进行改造,构建Diabodv表达载体.结果 在抗体库的筛选过程中可见明显的富集现象,获得了29株可与角蛋白特异性结合的人源单链抗体,选取4个克隆基因进行序列分析,结果表明,4个克隆的轻链基因均属于λ轻链第1亚群,1号和8号克隆的重链基因属于人IgG第2亚群,6号和29号克隆分别属于第1和第3亚群.从表达抗角蛋白抗体的集落中挑选一个进行基因改造,构建的Diabody表达载体所表达的Diabody活性较高.结论 利用噬菌体抗体技术获得了人源性抗角蛋白抗体,并改造成应用前景较好的Diabody,为开发银屑病治疗性抗体奠定了基础.
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抗人ICAM-1单链抗体表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达
目的 构建抗人细胞间黏附分子-1(ICAM-1)单链抗体(ScFv)的表达载体,并在大肠肝菌中表达.方法 从分泌ICAM-1单抗的杂交瘤细胞中提取RNA,用RT-PCR扩增抗体VH和VL基因,重叠延伸PCR扩增人ICAM-1-ScFv基因,将其连接到pET-22b(+)载体上,转化大肠杆菌BL2(DE3),IPTG诱导表达,表达产物纯化及复性后,检测特异性及活性.结果 序列分析表明抗ICAM-1 ScFv基因全长为744 bp,编码247个氨基酸,其中含357 bp的VH基因片段和342 bp的VL基因片段.表达蛋白以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的32%.经变性和复性后,纯度达80%以上,复性率达25%.Western blot和ELISA检测,ScFv均可与ICAM-1抗原特异性结合.细胞黏附试验表明ScFv能抑制ICAM-1与HSB2细胞间的黏附,其作用稍弱于亲本mAb.结论 已成功构建了抗人ICAM-1的ScFv表达载体,其表达产物具有抗体特异性和活性.
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078单链抗体的改进--ScFv多聚体
ScFv多聚体是通过将单链抗体的连接肽缩短至12个氨基酸以下而构成的一种新型小分子抗体,由单链抗体聚合为二聚体、三聚体等形式,使抗原结合价增加、亲和力得到提高、功能多样,具有广阔的应用前景.本文对该新型小分子抗体连接肽的设计、性能、表达及应用作一综述.
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细胞内抗体应用的研究进展
细胞内抗体是近几年发展起来的具有良好应用前景的抗体工程领域,是指在细胞内表达并被定位于亚细胞区室(如胞核、胞浆或某些细胞器),与特定的靶分子作用(干扰或阻断靶分子的加工、分泌或功能)从而发挥其生物学功能的一类新的工程抗体.主要应用在抑制病毒复制特别是HIV-1复制、肿瘤基因治疗方面,已经逐渐拓展到中枢神经系统疾病、移植排斥和自身免疫性疾病等领域,本文对细胞内抗体的研究进展作一综述.
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单链抗体scFv-GCN4在大肠杆菌中的重组表达及活性检测
目的:重组表达融合GST或MBP标签的单链抗体scFv-GCN4,对其进行分离纯化,并检测其生物学活性.方法:构建pBAD-MBP-scFv-GCN4及pBAD-GST-scFv-GCN4表达载体,使用大肠杆菌(Escherichia coli) Topl0菌株表达并亲和纯化重组蛋白MBP-scFv-GCN4及GST-scFv-GCN4.构建pET30a-Nus-GCN4载体,使用E.coli BL21 (DE3)菌株表达重组蛋白Nus-GCN4及Nus.以重组的GCN4为特异性抗原,通过Pull-down技术和Western Blot技术,检测MBP-scFv-GCN4及GST-scFv-GCN4的抗体活性及特异性.结果:重组菌株E.coli Top 10可高效表达可溶性的MBP-scFv-GCN4和GST-scFv-GCN4蛋白,通过亲和纯化,均得到了高纯度的重组蛋白.重组菌株E.coli BL21(DE3)可高效表达可溶性的Nus与Nus-GCN4蛋白.Pull-down及Western Blot结果显示,重组蛋白MBP-scFv-GCN4及GST-scFv-GCN4均可以高效、特异地识别重组的GCN4抗原.结论:重组抗体GST-scFv-GCN4及MBP-scFv-GCN4均可在E.coli中高效表达,并且具有良好的抗体活性及特异性.
