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噬菌体呈现技术筛选抗黑色素瘤单链抗体
目的:制备黑色素瘤单抗的单链可变区片段,用于肿瘤的诊断或靶向治疗.方法:从杂交瘤细胞提取总RNA,分别扩增出轻重链可变区基因(variable region of heavy chain,VH和variable region of light chain,VLDNA),连接形成单链抗体(single chain fragment variable region,ScFv)DNA,将ScFv与载体pCANTAB 5E的连接产物转化大肠杆菌TG1,经M13K07超感染后,获得噬菌体抗体ScFv cDNA文库,用黑色素瘤细胞LiBr对重组的噬菌体抗体进行3轮吸附-洗脱-扩增亲和筛选后,随机挑选克隆经ELISA筛选鉴定.结果:VH、VL和ScFv分别约为360、330、750bp,从随机筛检的30个克隆中获得10个高亲和性噬菌体呈现型ScFv单克隆.结论:用噬菌体呈现技术制备的黑色素瘤ScFv,可为肿瘤的诊断和靶向治疗奠定基础.
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抗IL-4R单链抗体原核表达载体的构建与表达
目的 通过BL21(DE3)原核表达系统制备抗白细胞介素-4受体(IL-4R)鼠抗人单链抗体(scFv).方法在前期研究结果的基础上优化抗IL-4R scFv序列,优化后分析scFv序列,构建重组质粒pET-32a-scFv,将该重组质粒酶切鉴定,将其转入BL21(DE3)原核表达菌进行诱导表达,并进行SDS-PAGE分析检测,对表达蛋白进行纯化和复性,通过SDS-PAGE分析抗IL-4R单链抗体的分子质量,运用Western blot检测融合蛋白的特异性.结果插入pET-32a载体的scFv序列长度761 bp,抗IL-4R单链抗体的分子质量在45 ku左右,重组蛋白具有较高的特异性.结论本实验成功构建pET32a-scFv原核表达系统,重组蛋白具有较高的免疫反应性,为进一步研究抗IL-4R单链抗体作为药物靶点提供了工作基础.
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脂联素单链抗体基因的克隆及表达
目的 克隆人脂联素单链抗体基因并进行表达.方法 提取分泌抗脂联素单克隆抗体杂交瘤细胞株的总RNA,通过RT-PCR技术,扩增VH和VL,与质粒pUC19载体连接,形成克隆,并对其进行鉴定分析.结果 抗体重、轻链可变区扩增拼接后的重、轻链各约为340 bp、350 bp,基因全长约710 bp,将拼接产物插入pUC19质粒中转化大肠杆菌JM 109,得到数个克隆,经酶切分析约含710 bp片段,与拼接结果基本相同,经测定特异性较好,与其他杂蛋白及载脂蛋白没有交叉反应.结论 抗人脂联素单链抗体基因的克隆和表达较为成功.
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单链抗体融合蛋白的研究及应用
单链抗体具有分子量小，免疫原性低，组织穿透力强，特异性强等优点，通过重组DNA技术将单链抗体（single chain antibody fragment, scFv）基因与其他效应蛋白基因融合在一起，经表达后可以得到具有scFv特性和所融合的效应蛋白活性的scFv融合蛋白。这种融合蛋白已应用于许多领域的研究中，并已显示出较高的价值。本文就scFv融合蛋白的研究和应用做一综述。
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人源化抗CD3单链抗体的构建、序列分析和表达研究
目的构建和表达抗CD3单链抗体,并对其构象进行模拟分析.方法应用重叠延伸拼接法连接抗CD3抗体的轻链可变区基因和重链可变区基因,构建抗CD3单链抗体基因(ScFv),并将其克隆于原核表达载体中表达.结果拼接后的抗CD3ScFv基因全长732bp,构象模拟分析表明其三维结构稳定,兼容性分数S＞0,表达的目的蛋白约26.5kD.结论抗CD3ScFv基因的成功构建,为进一步研究抗CD3/抗乙肝病毒的双特异性抗体奠定了基础.
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应用生物信息学网络资源分析预测融合蛋白的二级结构及其理化性质
目的:利用生物信息学网络资源分析融合蛋白的二级结构及其理化性质,探讨分泌型抗成骨肉瘤单链双功能抗体基因的表达.方法:①将单链抗体基因(ScFv)与白细胞介素2基因亚克隆至反转录病毒表达载体PLXSN,重组质粒PL(ScFv-IL-2)SN在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,用NIH3T3测定病毒滴度,将重组病毒感染人成骨肉瘤细胞命名为OSC/ScFv-IL-2.②以PCR,RT-PCR以及Western blotting对ScFv-IL-2基因修饰的OSC9901细胞进行鉴定.在构建融合蛋白之后,运用DNA分析软件DNAssist)和蛋白质分析软件(ANTHEPROT V5)分析融合蛋白的氨基酸序列、二级结构及其理化性质.结果:①经酶切及PCR分析鉴定,成功地构建了融合基因表达载体PL(ScFv-IL-2)SN,并获得高滴度产毒细胞株C26:Western blotting分析证明ScFv-IL-2基因融合蛋白的表达.②运用DNAssist核酸序列分析软件分析ScFv-IL-2DNA序列翻译并获得了氨基酸序列,运用蛋白质分析软件(ANTHEPROT V5)分析融合蛋白的二级结构及其理化性质.结论:利用生物信息学网络资源可以分析预测融合蛋白的性质,为进一步探讨单链双功能抗体基因融合蛋白提供依据.
关键词： 单链抗体 生物信息学资源 融合蛋白ScFv-IL-2基因 生物医学工程 -
抗人B-淋巴细胞刺激因子噬菌体单链抗体库的构建
目的 构建抗人B-淋巴细胞刺激因子噬菌体单链抗体库.方法 从B-淋巴细胞刺激因子免疫小鼠的脾细胞中抽提总RNA,经逆转录聚合酶反应合成cDNA,分别扩增小鼠重链可变区基因和轻链可变区基因.通过重叠延伸拼接法将重链可变区基因和轻链可变区基因组装成单链抗体基因,重组于载体pFUSE5,电转化E.coli XL1-Blue.在辅助噬菌体援救下,构建成噬菌体单链抗体库.采用聚合酶链反应、核苷酸序列测定和酶联免疫分析鉴定单链抗体库的特征.结果 本抗体库的噬菌体库容量约1×106,单链抗体基因插入效率为93%,存在序列差异性并含有抗B-淋巴细胞刺激因子单链抗体.结论 成功地构建了抗人B-淋巴细胞刺激因子单链噬菌体抗体库,为筛选抗B-淋巴细胞刺激因子单链抗体药物奠定了良好的基础.
关键词： 人B-淋巴细胞刺激因子 单链抗体 噬菌体展示技术 聚合酶链反应 -
单链抗体及其在肿瘤治疗中的应用
单链抗体（single chain variable fragment，ScFv）是利用基因工程技术衍生出来的一种小分子工程性抗体。单链抗体由抗体的重链可变区（heavy chain，VH）和轻链可变区（light chain，VL），通过一段人工合成的多肽序列（Linker）连接而成，其大小只有完整抗体的1/6，但完全保持了抗体与特异性抗原结合的能力。由于单链抗体是抗体重链与轻链可变区的融合表达蛋白，所以在各种细胞内表达后无须组装即能保持活性，且易于纯化。单链抗体具有分子质量小、穿透力强、半衰期短、抗原结合特异性强、免疫原性弱和可以在多种宿主细胞中表达的特点而备受科研工作者的关注，并广泛应用于基础研究和疾病的诊断与治疗过程中，其中在肿瘤的诊断和治疗过程中研究深入应用广泛[1-2]。本文主要针对单链抗体技术及其在肿瘤治疗中的研究应用进展进行综述。
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单链抗体融合人血白蛋白对重症肌无力患者血清与乙酰胆碱受体结合的抑制
目的:研究抗人乙酰胆碱受体(AChR)单链抗体(ScFv637)融合人血白蛋白(HSA-ScFv637)在体外对重症肌无力(MG)的治疗作用.方法:构建出HSA-ScFv637基因,利用甲醇诱导表达出HSA-ScFv637蛋白,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白印迹试验分析融合蛋白的分子量及特异性;应用竞争性ELISA测定法对HSA-ScFv637抑制MG患者血清与人AChR结合率及表达产物稳定性进行测定.结果:HSA-ScFv637对MG患者血清与人AChR结合的抑制率高可达77.4%,对AChR的这种保护能力可持续3天,随着样品的衰变HSA-ScFv637保护作用减弱至消失.结论:HSA-ScFv637在体外能抑制MG患者血清与AChR的结合,对AChR具有保护作用.
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抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体单链抗体ScFv的构建和表达
目的:克隆抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体ScFv.方法:从分泌抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2F4)中提取总RNA,利用RT-PCR技术,克隆该抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),通过基因重组构建VH-VL的表达载体pTAT-AL1,转化大肠杆菌BL21后用IPTG诱导表达.结果:VH基因序列全长369碱基对,编码123个氨基酸,VL基因序列全长339碱基对,编码113个氨基酸,二者均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,含有4个框架区(FRs)、3个抗原互补决定区(CDRs)及抗体特征性的两个半胱氨酸残基.ELISA测定显示基因工程抗体ScFv与原代抗体一样,具有较高的抗原亲和力.结论:成功构建了抗溶藻弧菌独特型抗体ScFv基因并表达于细菌壁膜间隙和包涵体中,为溶藻弧菌独特型抗体单链抗体ScFv成为新一代基因工程疫苗奠定了初步基础.
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抗AIF单链抗体在大肠杆菌中的可溶性表达和鉴定
目的:获得具有生物活性的抗酸性同功铁蛋白(AIF)单链抗体(scFv).方法:将AIF4c9 scFv基因亚克隆于原核表达载体pPOW3,构建重组表达质粒pPOW4c9,电转化大肠杆菌DH5α,以温度诱导重组抗AIF scFv表达,经镍螯合层析柱纯化后,用ELISA和Western blot检测表达蛋白与AIF的结合特性.结果:抗AIF scFv抗体在大肠杆菌中获得可溶性表达,亲和力常数KD为3.18×10-8 mol/L;纯化后的可溶性AIF scFv含量约为1.6 mg/L.重组蛋白能特异识别AIF,并且具有良好的抗体生物学活性.结论:在大肠杆菌中表达并纯化了特异性可溶性抗AIF scFv抗体.
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人源性抗角蛋白单链抗体在巴氏毕赤酵母的分泌表达
目的:用巴氏毕赤酵母表达人源性抗角蛋白单链抗体.方法:从已构建好的质粒p3MH/ScFv中亚克隆目的片段ScFv并插入酵母表达载体pPIC9K,构建成重组质粒pPIC9K/ScFv,并测序鉴定.通过电转将重组质粒pPIC9K/ScFv整合到巴氏毕赤酵母菌GS115的染色体上.经G418筛选得到高拷贝转化子及Mut表型鉴定后,用含0.5%甲醇的培养基诱导其分泌表达.结果:通过6天的诱导,该系统成功表达了抗角蛋白单链抗体,Western blot实验证实表达产物具有特异性.结论:获得了真核表达的抗角蛋白单链抗体,为其应用研究打下了基础.
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人源性抗HBsAg单链抗体在大肠杆菌中的表达及活性测定
目的:制备有活性的人源性抗HBsAg单链抗体.方法:应用噬菌体表面呈现技术获得人抗乙型肝炎表面抗原(HBsAg)抗体的Fab片段,并将VH和VL基因以(Gly4Ser)3linker连接成单链,插入表达载体pQE40,筛选大肠杆菌高表达菌株.结果:工程菌表达优化试验表明,在OD600为0.6时开始诱导,持续6 h,目的蛋白表达量高可达菌体总蛋白的31%.包涵体变性后上样镍离子螯合层析柱一步纯化,收集目的峰,透析复性,得纯度为97%的重组单链抗体,其亲和常数为0.23×108mol/L.结论:抗HBsAg单链抗体在大肠杆菌内获得高效表达,经变性和复性,得到有活性的单链抗体,氨基酸组成正确.为进行临床前研究打下基础.
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噬菌体表面呈现抗人红细胞血型A抗原单链抗体的研究
目的:构建表达抗人红细胞血型A抗原50A杂交瘤细胞的单链抗体(ScFv).方法:应用重组噬菌体抗体技术,从50A杂交瘤细胞中分离、构建单链抗体基因,并将其克隆入噬粒pCANTAB5E中,转化E.coli XL-Blue,辅助噬菌体援救构建50A噬菌体单链抗体库;采用完整红细胞亲和富集法淘选阳性重组噬菌体,鉴定重组噬菌体并进行序列测定分析;免疫印迹试验检测重组单链抗体的特异性抗原活性.结果:用M13KO7援救XL-1 Blue转化菌中的pCANTAB5E重组噬菌体,得到滴度为4×109 pfu/ml噬菌体单链抗体库;免疫印迹试验证实表达产物保留了亲本单抗对人红细胞血型A抗原的特异性亲和力.结论:成功构建50A McAb单链噬菌体抗体库,为进一步研制高特异性、高亲和力的基因工程原核血型检定抗体试剂奠定了基础.
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抗地高辛人源小分子抗体的构建
目的:将从大容量噬菌体抗体库中筛选得到的人源抗地高辛单链抗体进行分泌表达,并构建Diabody(双体抗体).方法:将抗地高辛的噬菌体抗体转染HB2151菌(无琥珀抑制基因的宿主菌),IPTG诱导,制备抗地高辛的可溶性单链抗体.选取活性较好的克隆进行基因改造,构建Diabody表达载体,并分泌表达,表达Diabody进行Western blot鉴定.结果:经ELISA结合活性测定,得到了结合活性较高的抗地高辛的可溶性单链抗体;基因改造后,经ELISA及Western blot测定证实获得了结合活性较好的抗地高辛Diabody.结论:实验获得了分泌表达活性可靠的人源性抗地高辛抗体,并改造成应用前景较好的Diabody,为临床诊断及治疗洋地黄类药物中毒提供具有实用价值的人源小分子抗体.
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大容量人源噬菌体抗体库的构建
目的:构建大容量易于改造成Diabody的噬菌体单链抗体库,筛选人源性抗体.方法:从正常成人外周血和新生儿脐血中分离淋巴细胞提取RNA,经RT-PCR扩增轻重链可变区基因(VL和VH),通过重叠PCR(over-lap PCR)将VL和VH拼接成单链抗体(ScFv)基因(其中VH两侧是两个非同源的loxp基因),并克隆入噬菌体表达载体PDF,得到初级噬菌体抗体库.将初级抗体库以高MOI超感染Cre+菌株BS1365,通过loxp-cre定位重组系统,介导轻重链在菌内重组配对,然后低感染XL1-Blue菌,得到大容量的次级抗体库.以多种不同抗原对库进行筛选,得到多样性较好的特异性抗体.结果:经超感染重组,得到1.2×1010的大容量抗体库.经三种蛋白抗原筛选,均得到多株特异性较好的噬菌体抗体,并成功构建为活性较好的Diabody.结论:经Loxp-Cre定位重组系统在单细胞内重组,能够高效地构建大容量噬菌体单链抗体库.
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抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白的构建与表达
目的:抗转铁蛋白受体单链抗体(TfR-scFv)-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建与表达.方法:设计两对引物引入连接肽(Gly4Ser)3以及酶切位点HindⅢ和BamH Ⅰ,采用重叠延伸PCR扩增与构建具有前导肽的L-VH-Linker-VL单链抗体基因,亚克隆至pEGFP-N1,转染COS-7细胞,倒置相差荧光显微镜下观察荧光蛋白表达,流式细胞术(FCM)检测细胞分泌上清与乳腺癌细胞MCF-7及黑色素瘤细胞A375结合活性.结果:测序表明获得了正确的L-VH-Linker-VL单链抗体基因序列;亚克隆至pEGFP-N1后,表达载体转染COS-7细胞,经荧光显微镜观察转染细胞,及通过流式细胞术(FCM)检测细胞分泌上清,证实抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白在转染细胞中分泌性表达,并能够与天然高表达TfR的细胞特异性结合.结论:抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白真核表达载体构建成功,其表达产物具有与TfR阳性细胞结合的活性.
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抗五步蛇毒ScFv噬菌体显示文库的构建及表达
目的:构建抗五步蛇毒的特异性ScFv噬菌体显示文库,并从中筛选出阳性克隆.方法:用五步蛇毒素免疫BALB/C小鼠,挑选其中效价高的3只小鼠提取脾脏组织,抽提细胞总RNA,经RT-PCR分别扩增出VH、VL基因片段,经Linker连接成ScFv基因(single chain variable fragment),再把ScFv基因重组到pCANTAB 5E载体,转化至大肠杆菌TG1中表达,经辅助噬菌体(Helper phage)M13K07拯救后建成噬菌体显示文库.结果:经4轮吸附-洗脱-富集筛选后,库容量达到4×108cfu/L,随机挑取90个克隆进行ELISA检测,结果16个呈阳性,并进行了重复验证.结论:成功构建出具有一定库容的特异性ScFv噬菌体展示库.
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人源性天然噬菌体展示文库的构建及鉴定
目的:构建人源性天然噬菌体展示文库并对文库进行鉴定.方法:从未经主动免疫健康志愿者的外周血淋巴细胞中提取总RNA,反转录合成cDNA,用直接PCR及半巢式PCR扩增人抗体重链(VH)及轻链(Vκ和Vλ)可变区基因.采用改进的重叠延伸PCR法将VH基因和VL(Vκ和Vλ)基因连接成人单链抗体(scFv)基因,并将scFv文库基因克隆到噬菌体载体pCANTAB-5E中,电转化E.coli TG1,构建单链抗体文库.结果:采用直接PCR和半巢式PCR扩增得到42条VH基因片段,16条Vκ基因片段,18条Vλ基因片段.混合的VH和VL等摩尔比连接后,产生的单链抗体文库基因大小为750 bp左右;转化后构建了文库容量为1.35×108的单链抗体文库.BstN Ⅰ酶切分析文库中的单链抗体基因结果显示,酶切得到的scFv指纹图谱均不相同.结论:构建的抗体文库多样性好,可用于多种人源性单链抗体的筛选.
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抗乙肝病毒表面抗原单链抗体在大肠杆菌中的高效表达
目的:在大肠杆菌中高效表达抗乙肝表面抗原的单链抗体.方法:通过PCR将单链抗体基因重组到原核细胞表达载体pT7中,构建单链抗体高效表达载体pT7SC.将pT7SC质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导进行表达.结果:获得了ScFv的高效表达,表达产物占菌体总蛋白的28%以上.竞争抑制性ELISA检测诱导后的细菌培养上清,证明所表达的ScFv具有抗体活性.进一步将c-Myc十肽连接在ScFv的羧基端,使所表达的ScFv易于检测.结论:在大肠杆菌高效表达抗乙肝ScFv,将促进小分子抗体的应用.
